本發(fā)明涉及一種腎上腺類器官培養(yǎng)基、腎上腺類器官的培養(yǎng)方法、以及一種原發(fā)腎上腺皮質癌動物模型的構建方法，屬于生物。

背景技術：

1、腎上腺皮質癌是一種罕見但侵襲性強的腎上腺腫瘤，通常起源于腎上腺皮質。過去幾十年中，手術和米托坦加鉑類治療一直是腎上腺皮質癌患者的主要治療手段，腎上腺皮質癌的臨床治療并未取得突破性進展。深入了解腎上腺皮質癌發(fā)生機制，找到其中關鍵作用因子，進而研發(fā)更加有效的治療手段，顯得尤為迫切。腫瘤動物模型在探究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制、研發(fā)新藥物上扮演著至關重要角色。小鼠腎上腺皮質癌模型為研究腎上腺皮質癌發(fā)生與轉移機制、抗腫瘤藥物篩選、免疫治療評價等方面提供有力的工具。

2、目前，常用的小鼠腎上腺皮質癌模型，主要包括移植瘤模型和自發(fā)成瘤模型。移植瘤模型是采用的免疫缺陷小鼠（如無胸腺裸鼠、scid小鼠）作為移植受體，將腫瘤細胞（細胞系）或腫瘤組織塊移植進免疫缺陷小鼠體內(nèi)后形成移植腫瘤。自發(fā)成瘤模型小鼠則主要包括基因工程小鼠腎上腺皮質癌模型。已有報道的基因工程小鼠腎上腺皮質癌模型主要包括tp53缺失和b-catenin過表達小鼠，這種小鼠是利用小鼠胚胎干細胞的基因同源重組，將特定基因在小鼠基因組上敲除或敲入。

3、但是，目前的小鼠腎上腺皮質癌模型存在諸多缺點，在滿足基礎及臨床前研究需求都存在不足。小鼠移植瘤模型一直飽受爭議，因為移植瘤并非小鼠自發(fā)形成的腫瘤，不能反映體內(nèi)腫瘤形成的真實過程，更重要的是，機體的免疫系統(tǒng)在腫瘤形成過程中十分重要，而免疫缺陷小鼠缺乏完整的免疫系統(tǒng)，利用移植瘤模型已經(jīng)不能滿足腫瘤免疫學治療研究的需要。基于基因工程小鼠的自發(fā)成瘤模型因其類似人體內(nèi)腫瘤的發(fā)生過程而得到認可，但是腫瘤的發(fā)生是多個基因累積改變的過程，傳統(tǒng)基因工程小鼠單次只引入一至兩個基因改變，若想獲得多個基因突變小鼠，需要多次交配迭代，耗時長，若要同時獲得大量相同基因型的腫瘤小鼠，需要更多的親代小鼠，研究成本提高。同時，由于基因工程小鼠是生殖系突變，容易誘發(fā)多系統(tǒng)多器官的腫瘤，這與腫瘤實際發(fā)生情況也有差異，并且由于小鼠個體差異，自發(fā)成瘤的周期差異也較大，難以達到同步。更重要的是，基因工程小鼠構建技術門檻高，若要構建新的基因型小鼠模型周期長成本高，一般研究機構無法常規(guī)開展。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種更接近腎上腺皮質癌生物學特性，且制備周期短的免疫健全小鼠的原發(fā)腎上腺皮質癌模型。

2、本發(fā)明提供了一種腎上腺類器官培養(yǎng)基，它是以dmem/f12培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，加上以下組分組成：

3、40x-60?b27?、n‐acetylcysteine?1-1.5mm、egf?40-60ng/ml、noggin?80-120ng/ml、r-sponding1?8-12%、y27632?8-12um、a83-01?160-240nm、?acth?2.4-3.6nm。

4、優(yōu)選地，它是以dmem/f12培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，加上以下組分組成：

5、50x?b27?、n‐acetylcysteine?1.25mm、egf?50ng/ml、noggin100ng/ml、r-sponding1?10%、y27632?10um、a83-01?200nm、?acth?3nm。

6、本發(fā)明提供了一種腎上腺類器官的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

7、a、取動物腎上腺，洗凈，剪碎至1-2mm大小組織塊；

8、b、采用i型膠原酶及iv型膠原酶于37攝氏度進行組織消化，移液槍吹打；

9、c、每10分鐘進行一次吹打，直至組織消化成單細胞；

10、d、過濾未消化組織，獲得細胞懸液，離心，棄上清；

11、e、取沉淀使用基質膠重懸，待基質膠凝固后，加入權利要求1或2所述培養(yǎng)基培養(yǎng)得到類器官。

12、其中，e步驟所述的培養(yǎng)條件為：在37°c、5%co2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，每7-8天進行傳代。

13、本發(fā)明提供了一種原發(fā)腎上腺皮質癌動物模型的構建方法，它包括如下步驟：

14、a、將培養(yǎng)得到的腎上腺類器官注射至動物皮下；

15、b、對動物進行遺傳改造，所述的遺傳改造是敲除抑癌基因，和/或過表達癌基因。

16、其中，遺傳改造的方法是敲除tp53、cdkn2a、znrf3、nf1基因，過表達myc基因。

17、所述的遺傳改造包括對類器官轉入熒光標記基因。

18、本發(fā)明提供了所述的腎上腺類器官培養(yǎng)基在用于制備腎上腺類器官中的用途。

19、本發(fā)明提供了所述的構建方法構建的原發(fā)腎上腺皮質癌動物模型在用于藥物篩選、藥物毒性試驗或免疫治療試驗中的用途。

20、本發(fā)明構建的腎上腺類器官是用小鼠已發(fā)育成熟的腎上腺器官消化成單細胞，加入特定的培養(yǎng)基生長分化而成，主要來源是成體干細胞，主要研究目的是小鼠原發(fā)腫瘤模型的構建。與從多能干細胞誘導產(chǎn)生的類器官，在來源上有本質的區(qū)別，多能干細胞來源誘導產(chǎn)生的類器官主要是研究具體器官功能，模擬器官發(fā)育過程（見文獻：郭雅婕，人胚胎腎上腺細胞來源類器官培養(yǎng)體系的建立及鑒定，廣西醫(yī)科大學碩士學位論文，2022?年?05月）。本發(fā)明著重在小鼠類器官以及基因編輯后的原發(fā)成瘤的小鼠模型構建。本發(fā)明中基于小鼠腎上腺類器官的腎上腺皮質癌小鼠模型，病理以及生物學特征與腎上腺皮質癌患者相似，成瘤率高，成瘤時間相較基因鼠更短，且成瘤后的腫瘤組織能接著進行類器官培養(yǎng)，同時提供了小鼠體內(nèi)和體外的腫瘤學研究途徑，更有利于腎上腺腫瘤的免疫學研究，基因治療，藥物篩選等實驗。

21、本發(fā)明組織來源為發(fā)育成熟的免疫完全小鼠腎上腺，這種成體干細胞來源的類器官更能特異性模擬器官真實的生理和病理狀態(tài)，為日后在腎上腺皮質癌患者培養(yǎng)特異性類器官奠定基礎。其次，本發(fā)明培養(yǎng)的腎上腺類器官與誘導性多能干細胞培育而來的腎上腺類器官相比，生長速度快，技術簡便，節(jié)省了分化和培養(yǎng)的技術要求，降低了操作的復雜性，有更好的實用性和可重復性。多能干細胞在分化過程中，尤其在體外長期培養(yǎng)中，可能會發(fā)生遺傳突變。而本專利中組織來源的類器官通常更穩(wěn)定，基因突變風險較低，更有助于保持原組織的表型和功能特性，在基因編輯成瘤和患者個性化醫(yī)療中更為直接和高效。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、本發(fā)明的腫瘤模型構建周期較基因工程動物模型大大縮短，不會導致動物成瘤前死亡，成瘤率高達100%。本發(fā)明構建的免疫健全小鼠的原發(fā)小鼠腎上腺皮質癌腫瘤模型，可模擬在人體內(nèi)由于遺傳改變導致正常細胞向腫瘤細胞轉化的過程，能動態(tài)地表征腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，在基因層面、腫瘤微環(huán)境、腫瘤發(fā)展及生理病理等方面與腫瘤發(fā)生發(fā)展真實情況更加貼近。

24、總之，本發(fā)明的方法可高效率地制備得到更接近腎上腺皮質癌、符合臨床研究需求的腎上腺皮質癌模型;該模型可以在探究腎上腺癌發(fā)生發(fā)展機制、尋找和優(yōu)化新的腎上腺皮質癌可能的治療方式等研究領域提供有利工具。

25、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

26、以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。