本發(fā)明涉及一種檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的引物組和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、聽力障礙是人類常見的出生缺陷之一。我國每年新增6萬-8萬耳聾新生兒，耳聾病因復(fù)雜，且60％以上的耳聾是由遺傳因素引起。

2、遺傳性耳聾相關(guān)基因，很多大部分為常染色體隱性遺傳，90％聾兒的父母親聽力正常。the?hereditary?hearing?loss?homepage(http：//hereditaryhearingloss.org/)數(shù)據(jù)庫顯示，非綜合征型耳聾(non-syndromic?hearing?loss，nshl)已知的致聾基因已超過80個，涉及1000多種致病變異和150個相關(guān)基因區(qū)域。在我國人群中耳聾基因變異攜帶率約為6.3％，其中約70％的變異來自于g]b2、slc26a4、線粒體dna?12s?rrna及gjb3等4個熱點基因。

3、耳聾涉及的致病基因數(shù)量多，迄今為止發(fā)現(xiàn)了超過100個基因區(qū)域和46個致病基因，而每個基因中又存在數(shù)目眾多的耳聾突變位點，因而具有較高的基因和位點遺傳異質(zhì)性。現(xiàn)有技術(shù)中大部分集中在g]b2、slc26a4、線粒體dna?12srrna及gjb3等4個熱點基因的位點的突變情況。然而還有很多耳聾突變位點如kcnq4、coch、tmie、pou3f4基因位點少有檢測。為了更全面覆蓋高頻檢測位點和提高突變位點的檢測準確性，有必要研究出針對更多的易感基因突變位點的檢測方法，并且簡化檢測步驟，降低成本，滿足大規(guī)模篩查的需要，為耳聾易感基因的早期篩查提供新的技術(shù)手段和支持。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于，提供一種更全面檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的引物組和試劑盒，以及利用試劑盒，檢測遺傳性耳聾基因位點突變情況的方法。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的引物組，包括多重pcr擴增引物，所述多重pcr擴增引物的序列如seq?id?no:1～54所示，用于擴增27個遺傳性耳聾相關(guān)基因位點：

4、

5、

6、所述引物組還包括用于單堿基延伸反應(yīng)的uep引物，序列如seq?id?no:55～seqid?no:81所示：

7、

8、本發(fā)明還提供了檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的引物組的應(yīng)用，為下列(1)-(2)中的至少一種：(1)對樣本進行遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的檢測；(2)制備用于對樣本進行遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性檢測的試劑盒。

9、作為優(yōu)選，將上述的引物組應(yīng)用于制備檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的試劑盒。

10、進一步，本發(fā)明還提供一種檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括上述多重pcr擴增引物和uep引物。

11、進一步，所述試劑盒包括含有所述多重pcr擴增引物的多重pcr擴增反應(yīng)體系、蝦堿性磷酸酶(sap)純化反應(yīng)體系、含有所述uep引物的單堿基延伸反應(yīng)體系。

12、進一步，所述多重pcr擴增反應(yīng)液包括堿基序列如seq?id?no:1～54所示的多重pcr擴增引物，每條引物的濃度為0.1～1μm(優(yōu)選0.5μm)；

13、作為優(yōu)選，所述多重pcr擴增反應(yīng)液包括多重pcr擴增引物、pcr緩沖液、脫氧酸核苷三磷混合物(dntp)、dna聚合酶、mgcl2。

14、所述sap純化反應(yīng)體系包括sap酶和sap緩沖液。

15、sap酶和sap緩沖液可購自agena公司。

16、所述單堿基延伸反應(yīng)體系包括堿基序列如seq?id?no:55～81所示的uep引物，每條引物的濃度為0.1～1μm(優(yōu)選0.7μm)。

17、作為優(yōu)選，所述單堿基延伸反應(yīng)體系包括uep引物、iplex?buffer?plus、iplextermination?mix和iplex?pro?enzyme；

18、iplex?buffer?plus、iplex?termination?mix和iplex?pro?enzyme購自agena公司。

19、本發(fā)明還提供利用所述試劑盒，在檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性中的應(yīng)用。

20、所述遺傳性耳聾基因包括gjb2、gjb3、gjb6、slc26a4、kcnq4、coch、pou3f4、tmie、mt-rnr1(mtdna)中的一種或多種。

21、遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性包括以下基因位點突變中的一種或多種：

22、gjb2：c.109g>a、c.167del、c.176_191de、c.235del、c.299_300del、c.35del；

23、gjb3：c.538c>t、c.547g>a；

24、gjb6：c.14c>t；

25、kcnq4：c.827g>c；

26、coch：c.151c>t；

27、pou3f4：c.652del、c.896del；

28、tmie：c.274c>t；

29、slc26a4：c.1174a>t、c.1226g>a、c.1229c>t、c.1707+5g>a、c.1975g>c、c.2027t>a、c.2162c>t、c.2168a>g、c.281c>t、c.589g>a、c.919-2a>g；mt-rnr1(mtdna)：m.1494c>t、m.1555a>g。

30、本發(fā)明還提供利用所述試劑盒，體外非診斷目的檢測遺傳性耳聾基因多態(tài)性的方法，所述方法包括以下步驟：

31、(1)多重pcr擴增反應(yīng)：

32、提取樣本的模板dna，配制多重pcr擴增反應(yīng)體系，進行多重pcr擴增反應(yīng)，得到多重pcr擴增產(chǎn)物；

33、多重pcr擴增反應(yīng)體系為5μl反應(yīng)體系，包括以下組分：

34、超純水0.8μl、10×pcrbuffer?0.5μl、25mm?mgcl20.4μl、dntp?0.1μl、p?mix1μl、pcr?enzyme?0.2μl，dna模板2μl；

35、所述p?mix為seq?id?no:1至seq?id?no:54的引物序列，每條引物的濃度為0.5μm；

36、多重pcr擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件為95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45循環(huán)；72℃5min；4℃保溫。

37、(2)蝦堿性磷酸酶(sap)純化反應(yīng)：

38、將多重pcr擴增產(chǎn)物用sap酶純化，得到純化產(chǎn)物；

39、sap純化反應(yīng)體系包括以下組分：超純水1.53μl、sap?buffer?0.17μl、sap?enzyme0.3μl、擴增產(chǎn)物5μl，總計7μl反應(yīng)體系。

40、純化反應(yīng)的反應(yīng)條件為37℃40min，85℃5min，4℃保溫。

41、(3)單堿基延伸反應(yīng)

42、步驟(2)的純化產(chǎn)物進行單堿基延伸反應(yīng)，得到延伸產(chǎn)物；

43、單堿基延伸反應(yīng)體系包括以下組分：超純水0.62μl、iplex?buffer?plus0.2μl、iplex?termination?mix?0.2μl、uep?mix?0.94μl、iplex?pro?enzyme?0.04μl、純化產(chǎn)物7μl，總計9μl反應(yīng)體系；

44、uep?mix為seq?id?no:55至seq?id?no:81的引物序列，每條引物的濃度為0.7μm；

45、所述單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序為95℃30s；95℃5s，{52℃5s，80℃5s，5個內(nèi)部循環(huán)}，40個外部循環(huán)；72℃3min；4℃保溫。

46、(4)核酸質(zhì)譜檢測分析

47、延伸產(chǎn)物用核酸質(zhì)譜儀進行檢測，得到遺傳性耳聾基因相關(guān)位點多態(tài)性信息。

48、所述核酸質(zhì)譜儀一般為maldi-tof?ms基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜儀。

49、核酸質(zhì)譜儀檢測器將電信號轉(zhuǎn)化為可視的峰圖，每一種基因型有特有的分子量，軟件自動分析對應(yīng)的堿基類型，從而得到最后的基因分型結(jié)果。

50、本發(fā)明先通過自主設(shè)計的引物進行pcr擴增，之后sap純化，最后再利用自主設(shè)計的探針進行目標堿基的延伸反應(yīng)，獲得的延伸產(chǎn)物進行核酸質(zhì)譜檢測，最終得到相關(guān)基因型信息。

51、本發(fā)明提供的檢測遺傳性耳聾基因位點多態(tài)性的試劑盒具有高準確性、高通量、低成本、短周期的優(yōu)點，相對于常規(guī)的sanger測序、焦磷酸測序以及實時熒光pcr技術(shù)，具備了顯著的高通量優(yōu)勢，可以一批次檢測96個樣本(96孔板)或384個樣本(384孔板)，每個樣本可測27個基因變異位點；而相比一代測序，本發(fā)明一批次樣本只需8-10小時即可完成，用時短，提高了檢測效率。本發(fā)明秩序只需微量基因組dna即可得到檢測結(jié)果。

52、本發(fā)明可以檢測27個遺傳性耳聾基因變異位點，涉及9種基因，涵蓋范圍更廣泛，降低因檢測位點不全導(dǎo)致的誤診風(fēng)險，更好地滿足耳聾臨床診斷需要。本發(fā)明具有較高的準確性、靈敏度和重復(fù)性，檢測結(jié)果對于輔助診斷和治療遺傳性耳聾具有重要的指導(dǎo)和研究價值。