本發(fā)明涉及生物工程，尤其是涉及一種耐寒類芽孢桿菌及其應用。

背景技術：

1、煙葉發(fā)酵是提升煙葉品質的關鍵工藝，旨在優(yōu)化香氣量、香氣質及滿足感，同時降低刺激性和有害物質含量。在這一過程中，煙葉內部的化學成分如糖類、蛋白質和有機酸等發(fā)生復雜的生物轉化，這些轉化對煙葉品質具有決定性影響。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵方法存在耗時長、效率低、微生物活動難以控制等問題，導致品質不穩(wěn)定，且在儲存過程中易受到霉菌污染，影響感官品質和人體健康。

2、煙葉中的刺激性化合物，如木質素、纖維素、淀粉、果膠以及亞硝胺類化合物(nab、nat、nnn和nnk)，對煙草制品品質有重要影響。這些化合物不僅產(chǎn)生刺激性味道，部分還具有致癌性，因此降低其含量對提升煙葉品質和安全性至關重要。傳統(tǒng)的物理和化學方法在降低這些化合物時效果有限，且可能引入新的有害物質。近年來，微生物處理技術在煙葉加工中受到重視。利用微生物代謝活動降解煙葉中的刺激性化合物，不僅能降低有害物質含量，還能增加香氣成分，提升煙葉整體品質。

3、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種耐寒類芽孢桿菌及其應用，該耐寒類芽孢桿菌能夠有效降低復烤煙葉中刺激性化合物的含量，并抑制煙葉霉菌，顯著提升煙葉的感官品質，還能夠大幅縮短發(fā)酵時間，從而降低生產(chǎn)成本。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種耐寒類芽孢桿菌(peribacillusfrigoritolerans)，其特征在于，其保藏編號為cgmcc?no.30644。

3、本發(fā)明的耐寒類芽孢桿菌(peribacillus?frigoritolerans)是從成熟煙葉中篩選出的內生菌株，命名為耐寒類芽孢桿菌ns20，已于2024年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.30644，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

4、本發(fā)明的耐寒類芽孢桿菌(peribacillus?frigoritolerans)為革蘭氏陽性菌，菌株大小為0.7-1.5μm×0.4-0.7μm，呈桿狀，具鞭毛；平板上菌落形態(tài)為圓形、中間凸起、邊緣整齊；能夠在低溫條件下良好生長。

5、具體地，所述耐寒類芽孢桿菌16s?rdna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

6、本發(fā)明的第二方面，提供了所述耐寒類芽孢桿菌在煙葉發(fā)酵中的應用。

7、優(yōu)選的，將所述耐寒類芽孢桿菌應用在復烤煙葉發(fā)酵中。

8、本發(fā)明的第三方面，提供一種煙葉發(fā)酵方法，將含有所述耐寒類芽孢桿菌的懸浮液噴灑到煙葉表面，隨后進行發(fā)酵。

9、優(yōu)選的，所述煙葉為復烤煙葉。

10、優(yōu)選的，所述發(fā)酵溫度為28-37℃，發(fā)酵濕度為50％-80％，發(fā)酵時間為24-48h。

11、優(yōu)選的，將懸浮液按(1.0-2.0)×108cfu/g均勻噴灑在煙葉表面，更優(yōu)選按2.0×108cfu/g均勻噴灑在煙葉表面。

12、優(yōu)選的，所述耐寒類芽孢桿菌的懸浮液的制備方法包括：對耐寒類芽孢桿菌進行活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液進行離心，隨后采用無菌水進行復溶，得到懸浮液。

13、本發(fā)明的第四方面，提供一種發(fā)酵煙葉，按照上述的煙葉發(fā)酵方法制得。

14、本發(fā)明的第五方面，提供一種微生物菌劑，所述微生物菌劑含有上述的耐寒類芽孢桿菌。

15、優(yōu)選的，所述微生物菌劑中耐寒類芽孢桿菌的細胞數(shù)量不低于2.0×109cfu/ml。

16、優(yōu)選的，所述微生物菌劑由耐寒類芽孢桿菌的種子液擴培得到。

17、具體地，所述微生物菌劑通過以下步驟制備得到：

18、(1)將耐寒類芽孢桿菌在lb平板進行活化，挑取單菌落接種至lb液體培養(yǎng)基制備種子液；

19、(2)將種子液以1％的比例接入tb液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)；

20、(3)發(fā)酵結束后，離心去除上清液，加水重懸，并調整菌濃度，得到含有耐寒類芽孢桿菌的微生物制劑。

21、優(yōu)選的，步驟(1)的培養(yǎng)條件為：25-35℃、100-250rpm條件下培養(yǎng)24-72h。

22、優(yōu)選的，步驟(2)的培養(yǎng)條件為：25-35℃、100-250rpm條件下培養(yǎng)24-72h至od達到3-5。

23、優(yōu)選的，步驟(3)的離心條件為：4℃、4000-8000rpm離心10-15min。

24、優(yōu)選的，所述微生物菌劑以耐寒類芽孢桿菌為主要微生物。

25、優(yōu)選的，所述微生物菌劑為固體菌劑或液體菌劑。

26、優(yōu)選的，所述微生物菌劑含有所述耐寒類芽孢桿菌菌株的菌體活細胞、冷凍干燥得到的所述耐寒類芽孢桿菌菌株的干菌體、固定化的所述耐寒類芽孢桿菌菌株的細胞，或者以其他任何形式存在的所述耐寒類芽孢桿菌菌株。

27、本發(fā)明的第六方面，提供一種耐寒類芽孢桿菌在煙草制品中的應用，其功效至少包括下列中的一項：

28、(ⅰ)降解煙葉中木質素、纖維素、淀粉、果膠以及亞硝胺類刺激性化合物，改善煙葉品質；

29、(ⅱ)抑制煙葉表面霉菌；

30、(ⅲ)縮短煙葉發(fā)酵時間。

31、優(yōu)選的，所述煙草制品包括：卷煙、雪茄煙、煙絲、復烤煙葉、煙用香料、煙草浸膏、烤煙煙葉和雪茄煙葉。

32、本發(fā)明至少具有如下有益效果：

33、(1)本發(fā)明提供的耐寒類芽孢桿菌能夠有效降低煙葉中木質素、纖維素、淀粉、果膠以及亞硝胺類(nab、nat、nnn和nnk等)刺激性化合物的含量，降低煙葉的雜氣和刺激性，顯著改善煙葉感官品質。

34、(2)本發(fā)明提供的耐寒類芽孢桿菌能夠抑制煙葉表面霉菌，可在煙葉環(huán)境中良好的生存代謝，有效利用不適用或難以利用的煙葉，解決煙葉的品質和倉儲問題。

35、(3)本發(fā)明提供的提供的耐寒類芽孢桿菌應用在煙葉發(fā)酵的過程中，能夠大幅縮短發(fā)酵時間，顯著提高煙葉的醇化效率，從而降低生產(chǎn)成本。

技術特征：

1.一種耐寒類芽孢桿菌(peribacillus?frigoritolerans)，其特征在于，其保藏編號為cgmcc?no.30644。

2.根據(jù)權利要求1所述的耐寒類芽孢桿菌，其特征在于，所述耐寒類芽孢桿菌16s?rdna的核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

3.權利要求1或2所述的耐寒類芽孢桿菌在煙葉發(fā)酵中的應用。

4.一種煙葉發(fā)酵方法，其特征在于，將含有權利要求1或2所述的耐寒類芽孢桿菌的懸浮液噴灑到煙葉表面，隨后進行發(fā)酵。

5.根據(jù)權利要求4所述的煙葉發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為28-37℃，發(fā)酵濕度為50％-80％，發(fā)酵時間為24-48h。

6.根據(jù)權利要求4所述的煙葉發(fā)酵方法，其特征在于，將懸浮液按(1.0-2.0)×108cfu/g均勻噴灑在煙葉表面。

7.一種發(fā)酵煙葉，其特征在于，按照權利要求4-6任一項所述的煙葉發(fā)酵方法制得。

8.一種微生物菌劑，其特征在于，所述微生物菌劑含有權利要求1或2所述的耐寒類芽孢桿菌。

9.權利要求1或2所述的耐寒類芽孢桿菌在煙草制品中的應用，其特征在于，其功效至少包括下列中的一項：

10.權利要求9所述的應用，所述煙草制品包括：卷煙、雪茄煙、煙絲、復烤煙葉、煙用香料、煙草浸膏、烤煙煙葉和雪茄煙葉。

技術總結
本發(fā)明提供了一種耐寒類芽孢桿菌及其應用。本發(fā)明的耐寒類芽孢桿菌(Peribacillus?frigoritolerans)已于2024年5月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.30644。本發(fā)明的耐寒類芽孢桿菌能夠有效降低煙葉中木質素、纖維素、淀粉、果膠以及亞硝胺類刺激性化合物的含量，降低煙葉的雜氣和刺激性，顯著改善煙葉感官品質；而且能夠抑制煙葉表面霉菌，可在煙葉環(huán)境中良好的生存代謝，有效利用不適用或難以利用的煙葉，解決煙葉的品質和倉儲問題；此外，該菌株應用在煙葉發(fā)酵的過程中，能夠大幅縮短發(fā)酵時間，顯著提高煙葉的醇化效率，從而降低生產(chǎn)成本。

技術研發(fā)人員：魏進彬,張建棟,王禎,王志才,宋凱,臧志鵬,韓露,楊紅靜,高玉珍,楊金龍
受保護的技術使用者：甘肅煙草工業(yè)有限責任公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/8