本發(fā)明涉及一種向腫瘤遞送gsdme并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體及其在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用，屬于基因工程與免疫治療領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、溶瘤病毒療法已被證明是一種具有巨大潛能的腫瘤治療方法。溶瘤病毒在正常細(xì)胞內(nèi)不復(fù)制或者復(fù)制數(shù)量很少，但卻能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并直接裂解腫瘤細(xì)胞、激活抗腫瘤免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管生成和腫瘤微環(huán)境、招募免疫細(xì)胞向腫瘤浸潤(rùn)，使腫瘤變成“熱腫瘤”。目前，溶瘤病毒作為臨床用藥所面臨的最主要挑戰(zhàn)包括單藥療效較差、以瘤內(nèi)給藥方式為主等，使溶瘤病毒的臨床應(yīng)用受限。因此，開(kāi)發(fā)抗腫瘤更強(qiáng)、安全性更高的可靜脈和瘤內(nèi)注射的溶瘤病毒是病毒治療的發(fā)展方向。

2、靜脈注射給藥是一種理想的全身給藥方式，能滿足臨床絕大部分腫瘤治療的需求。臨床研究結(jié)果顯示，痘苗病毒(vacciniavirus，vv)非常適合靜脈注射。此外，vv還有表現(xiàn)出其他方面的優(yōu)勢(shì)，比如其整個(gè)感染周期只存在于細(xì)胞質(zhì)，病毒dna不整合到宿主的基因組，臨床使用安全性較高；另外，vv有兩種感染形式，分別為細(xì)胞內(nèi)膜病毒(intracellularmature?virus，imv)和細(xì)胞外包膜病毒(extracellular?envelopedvirus，eev)，其中包裹細(xì)胞膜的eev可以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)。因此，vv是一種很有潛力的溶瘤痘苗病毒載體。

3、細(xì)胞焦亡是一種炎癥性程序性的細(xì)胞死亡，主要靠活化的caspase或顆粒酶切割gasdermin(gsdm，gsdmf除外)家族成員，從而釋放n端結(jié)構(gòu)域并在細(xì)胞膜上打孔，引起細(xì)胞腫脹破裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡，釋放大量的炎性因子(il-1β和il-18)和細(xì)胞內(nèi)容物，并進(jìn)一步招募免疫細(xì)胞擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。gsdme又稱dfna5，在許多腫瘤中的表達(dá)受到抑制；當(dāng)其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)時(shí)，可以被活化的caspase-3或顆粒酶b切割，釋放n端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上打孔，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，即細(xì)胞焦亡，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的吞噬作用、增加腫瘤內(nèi)nk和cd8+t細(xì)胞的浸潤(rùn)，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒功能，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。vv的b13蛋白能抑制caspase-3的活性。因此，刪除b13基因有望增加焦亡的發(fā)生。

4、白介素-12(il-12)在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)出很大的治療潛力。il-12屬于分泌型的促炎細(xì)胞分子，由p35和p40兩個(gè)亞基組成。能激活固有免疫和適應(yīng)性免疫，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞毒功能、增殖水平以及th1分化等途徑提高t細(xì)胞的腫瘤殺傷活性；同時(shí)能使抗腫瘤血管形成；但是，il-12是一把雙刃劍，重組il-12蛋白會(huì)引起致死性毒性，從而限制了il-12的臨床應(yīng)用。因此，降低il-12引起的毒性并保持其抗腫瘤功能是il-12應(yīng)用的研究方向。

5、細(xì)胞焦亡引起il-1β和il-18釋放，但il-1β的高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的侵襲和腫瘤干性。il-18作為炎性細(xì)胞因子，是細(xì)胞因子il-1家族成員之一，其主要作用是引起t細(xì)胞和nk細(xì)胞的ifn-γ分泌。il-12與il-18具有協(xié)同抗腫瘤作用，兩者共表達(dá)在不降低il-12抗腫瘤能力的同時(shí)可以降低il-12的毒性。vv表達(dá)的b15蛋白是il-1β的可溶性受體，表達(dá)的il-18結(jié)合蛋白(il-18bp，原命名c12l)抑制il-18的功能；il-18bp是分泌型免疫檢查點(diǎn)，削弱了il-18的抗腫瘤作用。因此，通過(guò)保留b15r基因、刪除il-18bp基因、同時(shí)表達(dá)il-12對(duì)vv進(jìn)行改造，有望進(jìn)一步增強(qiáng)刪除tk基因和b13基因并同時(shí)表達(dá)gsdme的vv載體的抗腫瘤能力。因此，研究il-12與焦亡的協(xié)同抗腫瘤作用及安全性將為il-12的應(yīng)用提供新的思路。

6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子gm-csf是一種糖蛋白，主要由t細(xì)胞產(chǎn)生。gm-csf通過(guò)活化巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞可以促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)抗腫瘤t細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抑制血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移，從而減少腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移。因此，溶瘤病毒插入gm-csf基因可以增強(qiáng)其抗腫瘤能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種安全有效的可向腫瘤遞送gsdme并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體及其在制備治療腫瘤藥物重的應(yīng)用；

2、第二個(gè)目的是提供一種安全、有效、可全身用藥的通過(guò)誘導(dǎo)焦亡調(diào)節(jié)il-12的重組痘苗病毒載體及其在制備治療腫瘤藥物重的應(yīng)用；

3、第三個(gè)目的是通過(guò)對(duì)痘苗病毒il-18bp基因的刪除來(lái)增強(qiáng)焦亡釋放的il-18和il-12協(xié)同作用的重組痘苗病毒載體及其在制備治療腫瘤藥物重的應(yīng)用；

4、第四個(gè)目的是提供一種在現(xiàn)有治療基因的基礎(chǔ)上聯(lián)合腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體及其在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

5、通過(guò)刪除痘苗病毒的tk基因和b13基因，同時(shí)表達(dá)gsdme，實(shí)現(xiàn)向腫瘤細(xì)胞遞送gsdme并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡。在此載體的基礎(chǔ)上表達(dá)il-12，通過(guò)誘導(dǎo)焦亡發(fā)生(包括其釋放的炎性因子，如il-18等)和il-12的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)抗腫瘤效果的同時(shí)降低il-12毒性的目的，達(dá)到焦亡和il-12的協(xié)同抗腫瘤作用。在此載體的基礎(chǔ)上同時(shí)刪除痘苗病毒il-18bp基因，避免痘苗病毒il-18bp對(duì)焦亡釋放的il-18的抑制，增強(qiáng)il-18和il-12的協(xié)同抗腫瘤作用，進(jìn)一步增強(qiáng)焦亡(包括其釋放的il-18))和il-12的協(xié)同抗腫瘤作用。

6、本發(fā)明能夠選擇性向腫瘤細(xì)胞遞送gsdme并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體，同時(shí)通過(guò)誘導(dǎo)焦亡聯(lián)合表達(dá)il-12，得到抗腫瘤能力更強(qiáng)和安全性更高的新型溶瘤痘苗病毒，為gsdme的抗腫瘤應(yīng)用拓寬思路，還將為提高il-12的安全性并保持其抗腫瘤作用提供新的方法。

7、通過(guò)刪除痘苗病毒il-18bp基因，避免病毒il-18bp對(duì)焦亡產(chǎn)生il-18的抑制，進(jìn)一步提高重組痘苗病毒的抗腫瘤效力和安全性，為焦亡(包括其產(chǎn)生的il-18)和il-12的協(xié)同抗抗腫瘤作用提供新的視角。

8、鑒于表達(dá)治療基因的溶瘤病毒在臨床上的有限抗腫瘤療效，gm-csf作為目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞因子，本發(fā)明在溶瘤痘苗病毒表達(dá)gm-csf的同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，實(shí)現(xiàn)gm-csf和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體的聯(lián)用，來(lái)提高溶瘤痘苗病毒的抗腫瘤療效，也為其他治療基因和本發(fā)明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的重組痘苗病毒載體的聯(lián)用提供數(shù)據(jù)支持。

9、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：

10、一種溶瘤痘苗病毒載體的構(gòu)建方法，刪除痘苗病毒的tk基因和b13基因兩個(gè)內(nèi)在基因，插入gsdme基因，通過(guò)向腫瘤細(xì)胞遞送gsdme誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的殺傷。

11、所述溶瘤痘苗病毒的載體為vvδtk-gsdmeδb13，構(gòu)建方法包括以下步驟：

12、(1)用基因合成方法依次將tk基因的上游序列seq?id?no:1、loxp序列、h5啟動(dòng)子、報(bào)告基因紅色熒光蛋白基因序列seq?id?no:2、loxp序列、h5啟動(dòng)子、人gsdme基因序列seqid?no:3或鼠gsdme基因序列seq?id?no:4和tk基因的下游序列seq?id?no:5連接到載體質(zhì)粒puc57上，構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒ptk-gsdme；用基因合成方法依次將b13基因的上游序列seqid?no:6、loxp序列、h5啟動(dòng)子、報(bào)告基因紅色熒光蛋白基因序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子和b13基因的下游序列seq?id?no:7連接到質(zhì)粒載體puc57上，構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒pb13；

13、(2)根據(jù)tk基因序列設(shè)計(jì)grna序列seq?id?no:8，將grna序列連接到pb-grna載體上構(gòu)建載體質(zhì)粒pb-grna-tk；根據(jù)b13基因設(shè)計(jì)grna序列seq?id?no:9，將grna序列連接到pb-grna載體上構(gòu)建載體質(zhì)粒pb-grna-b13；

14、(3)將cv1細(xì)胞接種到六孔板上，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒cas9和載體質(zhì)粒pb-grna-tk，24小時(shí)后感染野生型痘苗病毒vv，2小時(shí)后轉(zhuǎn)染穿梭載體質(zhì)粒ptk-gsdme；再經(jīng)48小時(shí)收集上清和細(xì)胞的混合液，凍融1次，按1微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中；48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下挑取紅色熒光的單克隆細(xì)胞；將單克隆溶液凍融后按5微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中，48小時(shí)后再次挑取單克隆細(xì)胞，直至熒光顯微鏡下全部為紅色熒光，即為病毒載體vvδtk-gsdme-rfp；

15、(4)將cv1細(xì)胞接種到六孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，轉(zhuǎn)染cre質(zhì)粒，再經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdme-rfp；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)挑取無(wú)紅色熒光的單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多輪挑選，直至熒光顯微鏡下全部無(wú)熒光，即為病毒載體vvδtk-gsdme；

16、(5)將cv1細(xì)胞接種到六孔板上，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒cas9和載體質(zhì)粒pb-grna-b13，經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdme，2小時(shí)后轉(zhuǎn)染穿梭載體質(zhì)粒pb13；再經(jīng)48小時(shí)收集上清和細(xì)胞的混合物，凍融1次，按1微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中；48小時(shí)后在熒光顯微鏡下挑取紅色熒光的單克隆細(xì)胞；將單克隆溶液凍融后按5微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中，48小時(shí)后再次挑取單克隆細(xì)胞，直至熒光顯微鏡下全部為紅色熒光；獲得重組溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13。

17、所述痘苗病毒為wr株痘苗病毒，在病毒載體vvδtk-gsdmeδb13的基礎(chǔ)上插入il-12基因，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的同時(shí)表達(dá)il-12，進(jìn)一步得到病毒載體。

18、所述溶瘤痘苗病毒的載體為vvδtk-gsdmeδb13-il-12，構(gòu)建方法包括以下步驟：

19、(1)用基因合成方法依次將b13基因的上游序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子、報(bào)告基因紅色熒光蛋白基因序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子、人il-12基因序列seq?id?no:10或鼠il-12基因序列seq?id?no:11和b13基因的下游序列連接到載體質(zhì)粒puc57上，構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒pb13-il12；

20、(2)將cv1細(xì)胞接種到六孔板上，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒cas9和載體質(zhì)粒pb-grna-b13，經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdme，2小時(shí)后轉(zhuǎn)染穿梭載體質(zhì)粒pb13-il12；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)，收集上清和細(xì)胞的混合物，凍融1次，按1微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中；48小時(shí)后在熒光顯微鏡下挑取紅色熒光的單克隆細(xì)胞；將單克隆溶液凍融后按5微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中，48小時(shí)后再次挑取單克隆細(xì)胞，直至熒光顯微鏡下全部為紅色熒光；獲得重組溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il12-rfp；

21、(3)將cv1細(xì)胞接種到六孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，轉(zhuǎn)染cre質(zhì)粒，再經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il12-rfp；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)挑取無(wú)紅色熒光的單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多輪挑選，直至熒光顯微鏡下全部無(wú)熒光，即為病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il12。

22、所述痘苗病毒為wr株痘苗病毒，在vvδtk-gsdmeδb13-il12載體的基礎(chǔ)上刪除il-18bp基因得到的。

23、所述溶瘤痘苗病毒的載體為vvδtk-gsdmeδb13-il-12δil-18bp，構(gòu)建方法包括以下步驟：

24、(1)用基因合成方法依次將il-18bp基因的上游序列seq?id?no:12、loxp序列、h5啟動(dòng)子、報(bào)告基因紅色熒光蛋白基因序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子和il-18bp基因的下游序列seq?id?no:13連接到載體質(zhì)粒puc57上，構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒pil-18bp；

25、(2)根據(jù)il-18bp基因序列設(shè)計(jì)grna序列seq?id?no:14，將grna序列連接到pb-grna載體上構(gòu)建載體質(zhì)粒pb-grna-il-18bp；

26、(3)將cv1細(xì)胞接種到六孔板上，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒cas9和載體質(zhì)粒pb-grna-il-18bp，經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il-12，2小時(shí)后轉(zhuǎn)染穿梭載體質(zhì)粒pil-18bp；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)，收集上清和細(xì)胞的混合物，凍融1次，按1微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中；48小時(shí)后在熒光顯微鏡下挑取紅色熒光的單克隆細(xì)胞；將單克隆溶液凍融后按5微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中，48小時(shí)后再次挑取單克隆細(xì)胞，直至熒光顯微鏡下全部為紅色熒光；獲得重組溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il-12δil-18bp-rfp；

27、(4)將cv1細(xì)胞接種到六孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，轉(zhuǎn)染cre質(zhì)粒，再經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il-12δil-18bp-rfp；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)挑取無(wú)紅色熒光的單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多輪挑選，直至熒光顯微鏡下全部無(wú)熒光，即為病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il-12δil-18bp。

28、所述痘苗病毒為wr株痘苗病毒，在vvδtk-gsdmeδb13載體的基礎(chǔ)上插入gm-csf基因得到的。

29、所述溶瘤痘苗病毒載體為vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf，構(gòu)建方法包括以下步驟：

30、(1)用基因合成方法依次將b13基因的上游序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子、rfp基因序列、loxp序列、h5啟動(dòng)子、人gm-csf基因序列seq?id?no:15或鼠gm-csf基因序列seq?id?no:16和b13基因的下游序列連接到載體質(zhì)粒puc57上，構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒pb13-gmcsf；

31、(2)將cv1細(xì)胞接種到六孔板上，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒cas9和載體質(zhì)粒pb-grna-b13，經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdme，2小時(shí)后轉(zhuǎn)染穿梭載體質(zhì)粒pb13-gmcsf；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)，收集上清和細(xì)胞的混合物，凍融1次，按1微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中；48小時(shí)后在熒光顯微鏡下挑取紅色熒光的單克隆細(xì)胞；將單克隆溶液凍融后按5微升/孔加入鋪滿cv1細(xì)胞的六孔板中，48小時(shí)后再次挑取單克隆細(xì)胞，直至熒光顯微鏡下全部為紅色熒光；獲得重組溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf-rfp；

32、(3)將cv1細(xì)胞接種到六孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％以上的融合度時(shí)，轉(zhuǎn)染cre質(zhì)粒，再經(jīng)過(guò)24小時(shí)后感染病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf-rfp；再經(jīng)過(guò)48小時(shí)挑取無(wú)紅色熒光的單克隆細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多輪挑選，直至熒光顯微鏡下全部無(wú)熒光，即為病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf。

33、所述方法得到的溶瘤痘苗病毒載體在制備治療腫瘤或感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。

34、所述腫瘤為實(shí)體瘤，感染性疾病為病毒、細(xì)菌或真菌感染性疾病。

35、所述實(shí)體瘤包括胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌、宮頸癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌和腎癌。

36、本發(fā)明的腫瘤靶向性溶瘤痘苗病毒載體的構(gòu)建方法，刪除該病毒的tk基因和b1基因3兩個(gè)內(nèi)在基因，同時(shí)在tk區(qū)插入gsdme基因，從而構(gòu)建選擇性向腫瘤細(xì)胞遞送gsdme并誘導(dǎo)其發(fā)生焦亡的溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13。此載體還可插入任意有助于治療腫瘤的基因或用于感染性疾病疫苗的基因。

37、本發(fā)明在該載體vvδtk-gsdmeδb13的基礎(chǔ)上插入il-12基因，從而構(gòu)建誘導(dǎo)焦亡同時(shí)表達(dá)il-12的溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il12，相對(duì)于僅表達(dá)il-12的對(duì)照病毒載體vvδtkδb13-il12，該載體能大大降低il-12毒性，同時(shí)能發(fā)揮更好抗腫瘤效果。

38、為避免焦亡產(chǎn)生的il-18被病毒il-18bp結(jié)合，接著刪除il-18bp基因，從而構(gòu)建vvδtk-gsdmeδb13-il12δil-18bp重組痘苗病毒載體，可進(jìn)一步提高抗腫瘤療效。

39、在腫瘤靶向性病毒載體vvδtk-gsdmeδb13的基礎(chǔ)上插入gm-csf基因，構(gòu)建重組載體vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf，實(shí)現(xiàn)gm-csf和誘導(dǎo)焦亡痘苗病毒載體的聯(lián)用，進(jìn)一步提高重組痘苗病毒的抗腫瘤效果。

40、本發(fā)明的重組載體vvδtk-gsdmeδb13-il12和vvδtk-gsdmeδb13-il12δil-18bp，能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并在進(jìn)入腫瘤后表達(dá)gsdme誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡同時(shí)表達(dá)il-12；隨著腫瘤細(xì)胞焦亡和裂解，釋放炎性物質(zhì)、腫瘤相關(guān)抗原和病毒粒子，病毒粒子可繼續(xù)感染臨近的腫瘤細(xì)胞，釋放的炎性物質(zhì)和腫瘤相關(guān)抗原與il-12協(xié)同作用，使機(jī)體產(chǎn)生高效、特異的抗腫瘤免疫反應(yīng)，進(jìn)一步殺傷未被病毒感染的腫瘤細(xì)胞，包括遠(yuǎn)端腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

41、vvδtk-gsdmeδb13在成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的同時(shí)，具有良好安全性。vvδtk-gsdmeδb13-il12誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡的同時(shí)，降低了il-12分泌水平，該重組載體能夠持續(xù)穩(wěn)定和相對(duì)低水平表達(dá)il-12，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有il-12重組蛋白半衰期短、以及高水平表達(dá)易引起毒副作用的不足。另外，il-12、il-18協(xié)同作用，焦亡產(chǎn)生了il-18，為避免病毒產(chǎn)生的il-18bp對(duì)焦亡產(chǎn)生的il-18的抑制作用，vvδtk-gsdmeδb13-il12δil-18bp重組載體刪除了病毒il-18bp基因，可觀察到更強(qiáng)的抗腫瘤療效。vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf表達(dá)gm-csf的同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡，提高了重組痘苗病毒的抗腫瘤療效。

42、本發(fā)明的有益效果：

43、(1)本發(fā)明構(gòu)建的腫瘤靶向性病毒載體vvδtk-gsdmeδb13，在表達(dá)gsdme的同時(shí)刪除病毒tk基因和b13基因，得到一種向腫瘤細(xì)胞遞送gsdme并引起腫瘤細(xì)胞焦亡的安全有效方法，展現(xiàn)出更好的腫瘤抑制效果，提高了荷瘤小鼠的生存期。

44、(2)本發(fā)明的vvδtk-gsdmeδb13-il12重組載體，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的同時(shí)表達(dá)il-12，實(shí)現(xiàn)了il-12持續(xù)穩(wěn)定和相對(duì)低水平表達(dá)，在發(fā)揮il-12卓越抗腫瘤效果的同時(shí)其毒性大大降低，解決了il-12重組蛋白毒性和半衰期短的難題。另外，病毒il-18bp基因的刪除避免了病毒il-18bp對(duì)焦亡產(chǎn)生il-18的抑制作用，進(jìn)一步提高治療的安全性和有效性，實(shí)現(xiàn)了vvδtk-gsdmeδb13-il12δil-18bp重組載體治療小鼠皮下移植瘤的優(yōu)越抗腫瘤效果。

45、(3)本發(fā)明的溶瘤痘苗病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-il12，不僅可用于腫瘤內(nèi)注射，還可用于靜脈注射，兩種治療方式均展現(xiàn)出良好安全性，靜脈注射作為理想的全身給藥方式，降低了給藥難度，擴(kuò)大了腫瘤治療范圍，對(duì)于非體表腫瘤、多發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤等均適用，滿足臨床絕大部分腫瘤治療需求。

46、(4)本發(fā)明的腫瘤靶向性病毒載體vvδtk-gsdmeδb13-gmcsf，在刪除病毒b13基因同時(shí)表達(dá)gsdme、gm-csf基因，通過(guò)焦亡聯(lián)合應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞因子gm-csf實(shí)現(xiàn)抗腫瘤療效的大幅提高，為焦亡和更多治療基因的聯(lián)用提供數(shù)據(jù)支持和新視角，具有良好應(yīng)用前景。