本發(fā)明屬于分子遺傳，具體涉及一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、綿羊是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，綿羊的繁殖效率是盈利的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，開發(fā)新的策略來提高生殖效率一直是許多研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。新疆是我國牧區(qū)之一，其獨(dú)特的地理優(yōu)勢及飲食習(xí)慣為養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展提供了得天獨(dú)厚的條件。經(jīng)過長期經(jīng)營畜牧業(yè)的過程中，新疆本地居民具有游牧放養(yǎng)的習(xí)俗，偏好飼養(yǎng)這些適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、生長發(fā)育快的地方品種，如哈薩克羊，是新疆北疆特色地方品種，生長發(fā)育快，對(duì)產(chǎn)區(qū)具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，然而其季節(jié)性發(fā)情、排卵、產(chǎn)羔等是養(yǎng)殖業(yè)效率低下的主要原因；多浪羊是新疆南疆的特色地方品種，其具有體型較大，產(chǎn)肉量較多，繁殖率高，遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn)；策勒黑羊也是新疆南疆的特色地方品種，以全年發(fā)情和繁殖率高著稱，平均一胎可產(chǎn)2～3羔，全年發(fā)情，是新疆地區(qū)綿羊養(yǎng)殖業(yè)的重要品種之一。近年來，羊產(chǎn)業(yè)的規(guī)模和效益實(shí)現(xiàn)了快速增長，產(chǎn)羔數(shù)是決定養(yǎng)羊業(yè)效益最主要的性狀之一，也是綿羊多產(chǎn)高產(chǎn)的基礎(chǔ)。因此，研究新疆地方品種綿羊的高繁殖力基因與繁殖性狀的關(guān)系，了解這些基因在繁殖過程中的遺傳機(jī)制，對(duì)于改良和選育品種具有重要作用。

2、繁殖性狀在綿羊三大經(jīng)濟(jì)性狀中通常被認(rèn)為是最重要的指標(biāo)，受外界環(huán)境和內(nèi)部基因的調(diào)控，遺傳力為低到中等。insl3基因包含2個(gè)外顯子，insl3編碼一種叫做胎兒睪丸肽的蛋白質(zhì)，在胚胎發(fā)育期間發(fā)揮重要作用，特別是在睪丸的發(fā)育和下降過程中發(fā)揮重要作用。有研究提出insl3可能是影響綿羊繁殖性狀的重要候選基因，insl3基因編碼的睪丸激素對(duì)綿羊的繁殖性狀具有重要影響，包括睪丸發(fā)育、精子生成、性激素水平和發(fā)情等方面。因此，研究綿羊insl3基因與繁殖性狀之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)于進(jìn)一步了解綿羊繁殖機(jī)制、提高生產(chǎn)性能具有重要意義。

3、單核苷酸多態(tài)性(snp)是一種重要的分子遺傳標(biāo)記，是基因組中單個(gè)核苷酸變異引起的dna序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、插入及缺失等形式。pcr-sscp技術(shù)的基本原理是pcr擴(kuò)增后的dna片段經(jīng)變性成單鏈dna，單鏈dna在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率，相同長度的dna單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。因此，可以通過pcr-sscp技術(shù)檢測基因組是否存在snp位點(diǎn)，并且準(zhǔn)確的鑒別snp位點(diǎn)的基因型?，F(xiàn)在已經(jīng)公認(rèn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)可作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于育種中。該方法不僅具有dna測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點(diǎn)，而且檢測序列位點(diǎn)無特殊要求。

4、目前，對(duì)綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的研究未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，本發(fā)明利用dna混池測序以及pcr-sscp技術(shù)，檢測了insl3基因的單核苷酸多態(tài)性，通過對(duì)新疆當(dāng)?shù)夭呃蘸谘?、哈薩克羊和多浪羊三個(gè)具有不同繁殖性狀的綿羊群體的insl3基因進(jìn)行了遺傳變異研究，發(fā)現(xiàn)insl3基因的遺傳變異，分析了繁殖性狀與這些基因之間的關(guān)系，為尋找不同品種綿羊繁殖性狀的遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，該方法為：以待測綿羊全基因組dna為模板，以引物對(duì)p為引物，pcr擴(kuò)增綿羊insl3基因片段，將pcr擴(kuò)增的片段變性成單鏈dna，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判定綿羊insl3基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；所述綿羊insl3基因的單核苷酸多態(tài)性為綿羊insl3基因第120位a>t突變的單核苷酸多態(tài)性；

4、所述引物對(duì)p的核苷酸序列為：

5、正向引物f：seq?id?no.1，

6、反向引物r：seq?id?no.2。

7、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：0.5μl?dna，正向引物和反向引物各0.5μl，7.5μl?pcr?mix和6μl?ddh2o，總體積15μl；所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。

8、優(yōu)選地，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測條件為：140v，10min，隨后120v，10h。

9、優(yōu)選地，所述綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性表現(xiàn)為aa、at和tt三種基因型，其中at是優(yōu)勢基因型，有利于提高綿羊的繁殖性狀。

10、本發(fā)明還提供了一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法在綿羊繁殖性狀相關(guān)輔助選擇和分子育種中的應(yīng)用，所述綿羊選自新疆當(dāng)?shù)夭呃蘸谘颉⒐_克羊和多浪羊。

11、本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果：

12、1、本發(fā)明提供了一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，利用dna混池測序以及pcr-sscp技術(shù)，檢測了新疆當(dāng)?shù)夭呃蘸谘?、哈薩克羊和多浪羊三個(gè)具有不同繁殖性狀的綿羊群體insl3基因的單核苷酸多態(tài)性(snp)，發(fā)現(xiàn)在綿羊insl3基因組第120位存在a>t的突變，綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性表現(xiàn)為aa、at和tt三種基因型。該方法能夠簡單、快速、低成本、精確度高的鑒定基因的單核苷酸多態(tài)性。

13、2、本發(fā)明將綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)at是策勒黑羊、哈薩克羊和多浪羊三個(gè)品種的優(yōu)勢基因型，且這三個(gè)品種的insl3基因單核苷酸多態(tài)性處于哈代-溫伯格平衡，試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了insl3基因多態(tài)性可以影響不同品種綿羊的季節(jié)性發(fā)情和產(chǎn)羔數(shù)，證明了insl3基因單核苷酸多態(tài)性與繁殖性能有一定的相關(guān)性，可作為綿羊常年發(fā)情和產(chǎn)羔數(shù)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，用于輔助選擇育種，以提高綿羊的繁殖性狀。

14、下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

技術(shù)特征：

1.一種利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以待測綿羊全基因組dna為模板，以引物對(duì)p為引物，pcr擴(kuò)增綿羊insl3基因片段，將pcr擴(kuò)增的片段變性成單鏈dna，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判定綿羊insl3基因上單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型；所述綿羊insl3基因的單核苷酸多態(tài)性為綿羊insl3基因第120位a>t突變的單核苷酸多態(tài)性；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：0.5μldna，正向引物和反向引物各0.5μl，7.5μlpcr?mix和6μl?ddh2o，總體積15μl；所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測條件為：140v，10min，隨后120v，10h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性表現(xiàn)為aa、at和tt三種基因型，其中at是優(yōu)勢基因型，有利于提高綿羊的繁殖性狀。

5.權(quán)利要求1～4所述的利用pcr-sscp快速檢測綿羊insl3基因單核苷酸多態(tài)性的方法在綿羊繁殖性狀相關(guān)輔助選擇和分子育種中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述綿羊選自新疆當(dāng)?shù)夭呃蘸谘?、哈薩克羊和多浪羊。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種利用PCR?SSCP快速檢測綿羊INSL3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以綿羊全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增INSL3基因片段，然后變性成單鏈DNA，再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果鑒定綿羊INSL3基因第120位單核苷酸多態(tài)性，該方法能夠簡單、快速、低成本、精確度高的鑒定基因的單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明將綿羊INSL3基因單核苷酸多態(tài)性與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證了INSL3基因多態(tài)性可以影響不同品種綿羊的季節(jié)性繁殖，進(jìn)而影響產(chǎn)羔數(shù)，表明INSL3基因單核苷酸多態(tài)性可作為綿羊常年發(fā)情和高育性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，用于輔助選擇育種，以提高綿羊的繁殖性狀。

技術(shù)研發(fā)人員：朱夢(mèng)婷,依明·蘇來曼,鄭文新,吳偉偉,畢經(jīng)棟,齊·阿拉達(dá)爾,李夢(mèng)妮,曹琴琴,李若禪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8