本發(fā)明屬于外泌體，具體涉及一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體是一種由細(xì)胞分泌的小囊泡，直徑大約在30-150納米之間，它們可以攜帶蛋白質(zhì)、rna和dna等分子，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。

2、現(xiàn)有技術(shù)中專利號為cn112190592b的發(fā)明專利公開了mirna在制備防治骨關(guān)節(jié)炎藥物的應(yīng)用、mirna高表達(dá)的外泌體和應(yīng)用，其公開了利用mirna高表達(dá)的外泌體防治骨關(guān)節(jié)炎，但是mir-155-5p是一類起調(diào)控作用的微小rna；在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(ra)患者中存在mirna表達(dá)差異，導(dǎo)致自身免疫性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，因此mir-155-5p只是從炎癥方面進(jìn)行單項修復(fù)，對骨關(guān)節(jié)炎的治療效果十分有限，如何進(jìn)一步提高外泌體在治療疾病方面的效果是本領(lǐng)域需要探究的難題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中如何進(jìn)一步提高外泌體在治療疾病方面的效果的問題，本發(fā)明提供了一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體及其制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體，外泌體來源于經(jīng)過gp96預(yù)處理后過表達(dá)了gp96抗原信息的干細(xì)胞。

4、采用該技術(shù)方案后，當(dāng)gp96與外泌體結(jié)合時，可以增強(qiáng)外泌體的功能，使它們能夠更有效地將gp96攜帶的抗原信息分子傳遞到特定的細(xì)胞中，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生理功能。這種結(jié)合體在炎癥相關(guān)疾病中具有潛在的應(yīng)用價值。

5、進(jìn)一步地，所述干細(xì)胞為人體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，gp96由hsp90b1基因編碼，蛋白序列號為：p14625.1。

6、進(jìn)一步地，所述外泌體為杯托樣結(jié)構(gòu)，粒徑為30-200nm。

7、一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，包括以下步驟：

8、s1：分離出含有干細(xì)胞的組織塊，并將含有干細(xì)胞的組織塊與含gp96抗原復(fù)合物一起進(jìn)行培養(yǎng)；

9、s2：按照設(shè)定時間進(jìn)行換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到設(shè)定值后進(jìn)行傳代，回收第3-5代的培養(yǎng)上清液；

10、s3：將外泌體從培養(yǎng)上清液中分離，得到含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體。

11、采用該技術(shù)方案后，傳代過程中從形態(tài)上看，隨著代數(shù)的增加，干細(xì)胞可能會逐漸失去其原始的形態(tài)和生長特性。p3代的干細(xì)胞通常具有較為均一的形態(tài)和較快的生長速度，p5代以后，細(xì)胞的形態(tài)可能會變得更為多樣，生長速度也可能有所減慢。從功能上看，p3代的干細(xì)胞通常具有較高的多能性，可以分化成多種類型的細(xì)胞。而p5代以后，干細(xì)胞的多能性可能會受到一定影響，其分化能力可能會受到一定限制。從穩(wěn)定性上看，p3代的干細(xì)胞通常較為穩(wěn)定，不易發(fā)生突變或異常分化過高或過低的代次都會影響干細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性，尤其是過低的代次(如p1、p2)可能伴隨著細(xì)胞的不穩(wěn)定性和不適應(yīng)性，因此本發(fā)明中選擇第3-5代干細(xì)胞。

12、進(jìn)一步地，含gp96抗原復(fù)合物為來自于人體胎盤組織的蛋白復(fù)合物，含gp96抗原復(fù)合物含有的抗原信息包括arhgap33、actr5、maml1、muc3b、mamdc4、lrp2、kcnt1、itpr2、fbxo34、flrt3、dhcr24、c1orf115。

13、進(jìn)一步地，s1的具體步驟如下：

14、s101：獲得新鮮完整的孕婦胎盤，并對胎盤進(jìn)行清洗后剝離胎盤上的羊膜組織；

15、s102：對羊膜組織進(jìn)行清洗，并將其裁剪為0.5～1.0cm2的組織塊；

16、s103：將組織塊平鋪至t75培養(yǎng)瓶中，并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置1-3h使組織塊貼壁；

17、s104：加入10～15ml添加有含gp96抗原復(fù)合物的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基與組織塊一起進(jìn)行培養(yǎng)。

18、進(jìn)一步地，s104中的培養(yǎng)基包括以下組分：干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基450～475ml、體積分?jǐn)?shù)為5～10％血小板裂解液25-50ml，0.5～2％青-鏈霉素2.5-10ml，培養(yǎng)基中含gp96抗原復(fù)合物的使用終濃度為3ug/ml～15ug/ml。

19、進(jìn)一步地，s2中每3-5天進(jìn)行一次換液，當(dāng)組織塊周圍貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80-90％時進(jìn)行傳代，傳代時利用胰蛋白酶回收細(xì)胞，將傳代的細(xì)胞以1.5x104/cm2的密度培養(yǎng)在25cm2培養(yǎng)瓶中，每3-5天換液，當(dāng)細(xì)胞生長密度為80％-90％時按1:2或1:3比例傳代。

20、進(jìn)一步地，s3的具體步驟如下：

21、s301：將s2得到的上清液于2-8℃，300～500g離心5～10分鐘后，取上清液；

22、s302：將s301得到的上清液于2-8℃，2000～4000g離心10～20分鐘后，取上清液；

23、s303：將s302得到的上清液于2-8℃，10000～13000g離心30～60分鐘后，取上清液；

24、s304：將s303得到的上清液進(jìn)行超濾濃縮處理，得到超濾液；

25、s305：對超濾液進(jìn)行2-8℃，5000～10000g離心20～30分鐘后，得到上清液；

26、s306：對s305得到的上清液進(jìn)行過濾除菌處理，得到含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的濃縮液。

27、采用該技術(shù)方案后，提取濃縮操作方便，不需要超離設(shè)備和超離耗材，就能提取濃縮，能夠滿足普通實驗室的基礎(chǔ)需求，富集效率比較高。整個操作均可在gmp環(huán)境下進(jìn)行，保證無菌環(huán)境的同時，提取工藝中不參雜外源試劑，殘留風(fēng)險可控，保證了后期應(yīng)用的安全性。

28、一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用。

29、綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

30、富含gp96抗原信息胎盤羊膜干細(xì)胞來源的外泌體，對骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)行多方面干預(yù)，首先，gp96以一種協(xié)同有效的方式觸發(fā)了病原體防御的天然和特異性防御系統(tǒng)。gp96具有天然免疫佐劑的作用：gp96能非特異地激活抗原提呈細(xì)胞表達(dá)tnf-α、il-12等細(xì)胞因子和上調(diào)cd86、cd80共刺激分子及mhc類分子，給細(xì)胞毒性t細(xì)胞提供一個促炎性細(xì)胞因子環(huán)境和共刺激分子，激發(fā)免疫應(yīng)答，提高機(jī)體自身的抗炎反應(yīng)；其次，gp96攜帶的豐富的腫瘤抗原信息可以主動激活t淋巴細(xì)胞，靶向治療病理部位，提高殺傷活性；最后，胎盤羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體具有與胎盤羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞相同的屬性，相比其他來源干細(xì)胞，能分泌更多的抗炎因子和組織修復(fù)因子，能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)等降解酶的活性，減少軟骨基質(zhì)的破壞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。

技術(shù)特征：

1.一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體，其特征在于：外泌體來源于經(jīng)過gp96預(yù)處理后過表達(dá)了gp96抗原信息的干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體，其特征在于：所述干細(xì)胞為人體胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，gp96由hsp90b1基因編碼，蛋白序列號為：p14625.1。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體，其特征在于：所述外泌體為杯托樣結(jié)構(gòu)，粒徑為30-200nm。

4.一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：含gp96抗原復(fù)合物為來自于人體胎盤組織的蛋白復(fù)合物，含gp96抗原復(fù)合物含有的抗原信息包括arhgap33、actr5、maml1、muc3b、mamdc4、lrp2、kcnt1、itpr2、fbxo34、flrt3、dhcr24、c1orf115。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：s1的具體步驟如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：s104中的培養(yǎng)基包括以下組分：干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基450～475ml、體積分?jǐn)?shù)為5～10％血小板裂解液25-50ml，0.5～2％青-鏈霉素2.5-10ml，培養(yǎng)基中含gp96抗原復(fù)合物的使用終濃度為3ug/ml～15ug/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：s2中每3-5天進(jìn)行一次換液，當(dāng)組織塊周圍貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80-90％時進(jìn)行傳代，傳代時利用胰蛋白酶回收細(xì)胞，將傳代的細(xì)胞以1～2.5x104/cm2的密度培養(yǎng)在25cm2培養(yǎng)瓶中，每3-5天換液，當(dāng)細(xì)胞生長密度為80％-90％時按1:2或1:3比例傳代。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體的制備方法，其特征在于：s3的具體步驟如下：

10.一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用，其特征在于：外泌體為權(quán)利要求1-3任一項所述的外泌體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種含有g(shù)p96抗原信息的工程化外泌體及其制備方法和應(yīng)用，屬于外泌體技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明解決了如何進(jìn)一步提高外泌體在治療疾病方面的效果的問題。本發(fā)明的外泌體來源于經(jīng)過gp96預(yù)處理后過表達(dá)了gp96抗原信息的干細(xì)胞。當(dāng)gp96與外泌體結(jié)合時，可以增強(qiáng)外泌體的功能，使它們能夠更有效地將gp96攜帶的抗原信息分子傳遞到特定的細(xì)胞中，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生理功能。這種結(jié)合體在治療骨關(guān)節(jié)炎等炎癥相關(guān)疾病中具有潛在的應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：王剛,黃剛輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：和泓尚醫(yī)（成都）生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8