本發(fā)明屬于透明質(zhì)酸鈉，具體涉及一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸是一種天然多糖，其分子量巨大，表現(xiàn)出了獨(dú)特的粘彈性、優(yōu)越的生物學(xué)相容性和可降解性，是一種理想的組織工程材料，應(yīng)用于不同的組織工程領(lǐng)域。但是由于天然透明質(zhì)酸水凝膠的穩(wěn)定性差，對(duì)透明質(zhì)酸酶和自由基敏感，在體內(nèi)保持的時(shí)間短，機(jī)械強(qiáng)度差，應(yīng)用受到很大限制。為此，人們對(duì)天然透明質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)修飾或者交聯(lián)，用于增強(qiáng)凝膠力學(xué)強(qiáng)度、穩(wěn)定性和抗降解性能，使其能夠在體內(nèi)維持更長(zhǎng)的時(shí)間，進(jìn)而擴(kuò)大在生物醫(yī)藥和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。

2、其中交聯(lián)透明質(zhì)酸是通過(guò)使用一種或多種組合的化學(xué)交聯(lián)劑，利用交聯(lián)劑本身的官能團(tuán)與透明質(zhì)酸上相關(guān)的極性基團(tuán)之間發(fā)生反應(yīng)，使透明質(zhì)酸分子交聯(lián)在一起，從而增大透明質(zhì)酸凝膠的分子量，在保留原有生物相容性的基礎(chǔ)上，得到分子結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，粘彈性強(qiáng)和機(jī)械性能顯著提升的交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠。

3、但是傳統(tǒng)的透明質(zhì)酸交聯(lián)劑多為化學(xué)試劑，對(duì)皮膚存在刺激性甚至細(xì)胞毒性，在交聯(lián)過(guò)程中的殘留對(duì)使用者也存在較大的潛在危害，而減少交聯(lián)劑的使用量又會(huì)導(dǎo)致得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸耐高溫和抗酶解性能差，限制了其使用，因此使用安全無(wú)毒的天然交聯(lián)劑是一種有效方法，但是目前的一些天然生物交聯(lián)劑得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸的機(jī)械強(qiáng)度一般，交聯(lián)程度不高，抗酶解性能也需要提升。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉及其制備方法，以解決利用天然交聯(lián)劑得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)程度不高以及抗酶解性能不佳的問題。

2、本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的制備方法，包括以下工藝步驟：

4、s1.將透明質(zhì)酸鈉添加到堿性水溶液中攪拌溶解得到透明質(zhì)酸水溶液；

5、s2.在透明質(zhì)酸水溶液中加入預(yù)交聯(lián)單體，室溫下攪拌反應(yīng)1～3h，得到預(yù)反應(yīng)溶液；

6、s3.在預(yù)反應(yīng)溶液中加入交聯(lián)劑，調(diào)節(jié)溶液ph值為8～10，在20～40℃下交聯(lián)反應(yīng)4～8h；

7、s4.所述交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過(guò)透析和冷凍干燥得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉；

8、預(yù)交聯(lián)單體含有支化賴氨酸短肽；交聯(lián)劑為堿性氨基酸。

9、優(yōu)選的，預(yù)交聯(lián)單體的添加量為透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量的0.5～1.5%。

10、優(yōu)選的，交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉的摩爾比為（0.3～0.5）：1。

11、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明采用堿性氨基酸作為透明質(zhì)酸的交聯(lián)劑，堿性氨基酸中含有的氨基和羧基能夠與透明質(zhì)酸中的官能團(tuán)之間反應(yīng)鏈接，幫助形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其側(cè)鏈官能團(tuán)還能夠提供額外的反應(yīng)位點(diǎn)，提高交聯(lián)過(guò)程的多樣性，實(shí)現(xiàn)在更加溫和的條件下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，能夠得到具有特定結(jié)構(gòu)和性能的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉，相較于一般天然交聯(lián)劑，堿性氨基酸作為交聯(lián)劑具有更好的生物相容性和較低的免疫原性，而且氨基酸本身作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，在涉及人體健康的條件下更加安全，可以大大減少由于交聯(lián)劑殘留而導(dǎo)致的安全隱患。

12、而且在交聯(lián)之前，本發(fā)明先對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行預(yù)交聯(lián)，能夠幫助在進(jìn)行堿性氨基酸與透明質(zhì)酸交聯(lián)之前先構(gòu)建一個(gè)較為堅(jiān)固的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，可以讓后續(xù)的交聯(lián)過(guò)程形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，提高交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的交聯(lián)程度，而且能夠更好的調(diào)節(jié)交聯(lián)密度，增強(qiáng)交聯(lián)透明質(zhì)酸對(duì)抗自由基以及體內(nèi)酶等因素的能力，從而延長(zhǎng)有效持續(xù)時(shí)間。

13、其中在預(yù)交聯(lián)過(guò)程中使用的預(yù)交聯(lián)單體中含有支化賴氨酸短肽，支化賴氨酸短肽中含有的多個(gè)反應(yīng)活性位點(diǎn)能夠與透明質(zhì)酸鈉分子之間形成共價(jià)鍵的連接點(diǎn)，并且支化賴氨酸短肽的每個(gè)分支都可以作為獨(dú)立的活性位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，提高交聯(lián)結(jié)構(gòu)中交聯(lián)點(diǎn)的數(shù)量，從而構(gòu)建出更為復(fù)雜和穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高后續(xù)交聯(lián)的交聯(lián)程度，提升得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的機(jī)械強(qiáng)度和彈性，并且支化賴氨酸短肽具有良好的生物相容性，不會(huì)留下有毒的殘留物。

14、其支化結(jié)構(gòu)還能夠增加交聯(lián)點(diǎn)之間的距離，通過(guò)改變交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的空間構(gòu)象，影響透明質(zhì)酸酶對(duì)交聯(lián)點(diǎn)的可及性，從而減緩?fù)该髻|(zhì)酸酶對(duì)其降解的速度，提高交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的抗酶解能力。同時(shí)也減少了原本透明質(zhì)酸鈉中小分子量片段的比例，進(jìn)而降低由小分子透明質(zhì)酸鈉殘留而引起的潛在的炎癥風(fēng)險(xiǎn)。

15、優(yōu)選的，預(yù)交聯(lián)單體的原料包括摩爾比為（0.8～1）：1的多胺化合物和雙叔丁氧基酰基保護(hù)的l-賴氨酸。

16、優(yōu)選的，多胺化合物為二胺化合物和三胺化合物中的一種或兩種的組合。

17、更優(yōu)選的，二胺化合物包括乙二胺、生物基戊二胺、1,2-丙二胺和三乙烯二胺中的一種或多種的組合。

18、更優(yōu)選的，三胺化合物包括二乙烯三胺和三乙胺中的一種或兩種的組合。

19、優(yōu)選的，預(yù)交聯(lián)單體按照以下方法制備得到：

20、將雙叔丁氧基酰基保護(hù)的l-賴氨酸添加到氯仿溶液中，調(diào)節(jié)溫度為0～5℃，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，攪拌混合1～2h，得到預(yù)混液；在預(yù)混液中加入多胺化合物，繼續(xù)在0～5℃下攪拌反應(yīng)15～20h，最后經(jīng)過(guò)過(guò)濾、萃取、干燥得到預(yù)交聯(lián)單體。

21、優(yōu)選的，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽與雙叔丁氧基酰基保護(hù)的l-賴氨酸的摩爾比為（0.6～0.8）:1。

22、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，選用經(jīng)過(guò)雙叔丁氧基酰基保護(hù)的l-賴氨酸，能夠提高賴氨酸的化學(xué)穩(wěn)定性，減少反應(yīng)對(duì)賴氨酸性能的影響。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，是一種碳二亞胺類的縮合劑，能夠幫助形成賴氨酸短肽，與l-賴氨酸中的羧基之間反應(yīng)形成可以與氨基進(jìn)一步反應(yīng)的?；逯虚g體，然后進(jìn)一步與多胺化合物的氨基之間反應(yīng)形成預(yù)交聯(lián)單體。

23、將含有支化賴氨酸短肽的預(yù)交聯(lián)單體先與透明質(zhì)酸鈉之間進(jìn)行預(yù)交聯(lián)，可以有效增強(qiáng)透明質(zhì)酸鈉分子之間的交聯(lián)密度和均勻性，幫助后續(xù)形成穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，可以先得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的框架結(jié)構(gòu)，再利用堿性氨基酸進(jìn)行交聯(lián)，從而提高得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的力學(xué)強(qiáng)度和穩(wěn)定性。而且通過(guò)預(yù)交聯(lián)單體的預(yù)交聯(lián)作用，可以保護(hù)酶識(shí)別位點(diǎn)，減少酶促降解的速率，從而延長(zhǎng)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的有效期。

24、優(yōu)選的，堿性氨基酸包括賴氨酸和精氨酸中的一種或兩種的組合。

25、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，堿性氨基酸包括賴氨酸、精氨酸或者兩者組合，能夠與透明質(zhì)酸鈉之間形成靜電相互作用，其側(cè)鏈的特異性也進(jìn)一步提高了與透明質(zhì)酸鈉的交聯(lián)效果，堿性氨基酸中含有的極性基團(tuán)能夠與透明質(zhì)酸鈉之間形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而且還可以與透明質(zhì)酸分子中的羧基形成離子鍵合，促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。

26、堿性氨基酸具有更好的生物相容性，用堿性氨基酸作為透明質(zhì)酸鈉的交聯(lián)劑能夠更好提高產(chǎn)品的安全性，但是直接采用堿性氨基酸進(jìn)行交聯(lián)會(huì)使得到的產(chǎn)品性質(zhì)不穩(wěn)定，尤其是在溶液狀態(tài)下，加熱或者長(zhǎng)時(shí)間暴露在外都有可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，從而影響產(chǎn)品的流變學(xué)性質(zhì)和粘度。

27、本發(fā)明采用預(yù)交聯(lián)的形式，先對(duì)透明質(zhì)酸鈉進(jìn)行預(yù)交聯(lián)處理，先構(gòu)建得到的透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)框架結(jié)構(gòu)，不僅有利于堿性氨基酸的交聯(lián)作用，而且能夠大大提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性，預(yù)交聯(lián)步驟也為透明質(zhì)酸鈉引入了新的交聯(lián)位點(diǎn)，增加了交聯(lián)點(diǎn)的數(shù)量，使得得到的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)更加致密和堅(jiān)固，從而提高了材料的機(jī)械強(qiáng)度和彈性模量。而且額外的交聯(lián)點(diǎn)也增加了產(chǎn)品的交聯(lián)程度，從而有效防止過(guò)度流動(dòng)，而且由于預(yù)交聯(lián)單體中含有支化賴氨酸短肽，能夠在此基礎(chǔ)上保留一定的水合狀態(tài)，保證交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉良好的注射性和可塑性能力。

28、優(yōu)選的，s2步驟還添加有富勒醇；所述富勒醇的添加量為透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量的0.2～0.8%。

29、通過(guò)采用上述技術(shù)方案，富勒醇是經(jīng)過(guò)醇羥基修飾后的富勒烯衍生物，具有更好的水溶性和較低的細(xì)胞毒性，加入到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉中不會(huì)影響其安全性。最為重要的是，富勒醇具有有效清除自由基的能力，在預(yù)交聯(lián)過(guò)程中，富勒醇中大量的羥基官能團(tuán)能夠與透明質(zhì)酸鈉和預(yù)交聯(lián)單體之間形成化學(xué)鍵合，得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉能夠有效抵抗自由基對(duì)其的分解作用，從而大大增強(qiáng)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，而且還能夠幫助交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉吸收并鎖住水分，形成保護(hù)膜防止水分流失，得到性能更為優(yōu)越的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉。

30、而且在預(yù)交聯(lián)步驟中，富勒醇表面豐富的羥基基團(tuán)能夠與預(yù)交聯(lián)單體中的支化賴氨酸短肽以及透明質(zhì)酸鈉中的極性基團(tuán)之間通過(guò)氫鍵和相互作用強(qiáng)化形成的交聯(lián)框架結(jié)構(gòu)，從而提高得到的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的機(jī)械強(qiáng)度，而且能夠與預(yù)交聯(lián)單體之間協(xié)同配合調(diào)節(jié)產(chǎn)品的流動(dòng)性和粘度，擴(kuò)大交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的應(yīng)用場(chǎng)景。

31、本發(fā)明的有益效果：

32、1、本發(fā)明采用堿性氨基酸作為交聯(lián)劑能夠更好的提高交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的安全性，相較于一般天然交聯(lián)劑具有更好的生物相容性和較低的免疫原性，大大減少由于交聯(lián)劑殘留導(dǎo)致的安全隱患。

33、2、本發(fā)明在交聯(lián)反應(yīng)之前先對(duì)透明質(zhì)酸鈉進(jìn)行預(yù)交聯(lián)處理，其中采用的預(yù)交聯(lián)單體中含有支化賴氨酸短肽，其中含有的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)和支化位點(diǎn)都能夠幫助提高透明質(zhì)酸鈉的交聯(lián)點(diǎn)，然后再在堿性氨基酸的交聯(lián)作用下構(gòu)建得到更為復(fù)雜和穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而解決單獨(dú)采用堿性氨基酸交聯(lián)可能出現(xiàn)的性質(zhì)不穩(wěn)定以及產(chǎn)品結(jié)構(gòu)易破壞的問題，還能夠提高材料的交聯(lián)程度和機(jī)械強(qiáng)度。其支化結(jié)構(gòu)還能夠增加交聯(lián)點(diǎn)之間的距離，影響透明質(zhì)酸酶對(duì)交聯(lián)點(diǎn)的可及性，保護(hù)酶識(shí)別位點(diǎn)，減少酶促降解的速率，提高交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的抗酶解能力。

34、3、本發(fā)明在預(yù)交聯(lián)步驟中還能夠加入富勒醇，一方面能夠強(qiáng)化預(yù)交聯(lián)處理后得到的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，另一方面能夠有效清除自由基，從而有效抵抗自由基對(duì)交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的分解作用，提高交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉的穩(wěn)定性。