一種綠色木霉菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種綠色木霉菌菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne)是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲(chóng)。已知危害蔬 菜的線蟲(chóng)主要有花生根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)、南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)W及甜菜根結(jié) 線蟲(chóng)等。線蟲(chóng)寄主范圍廣泛，常危害瓜類、茄果類、豆類及蘿K葫蘿K窩宦、白菜等30多 種蔬菜，還能傳播一些真菌和細(xì)菌性病害。根結(jié)線蟲(chóng)是一種重要的農(nóng)作物病原物，每年造成 大約數(shù)十億的損失。根結(jié)線蟲(chóng)主要侵染農(nóng)作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根結(jié)， 可互連接形成串珠狀，由于根部被破壞，影響正常的吸收機(jī)能，所W地上部生長(zhǎng)發(fā)育受阻， 被侵染后的植株地上部表現(xiàn)矮化，葉部黃化，結(jié)果小而且少。天氣干燥時(shí)易萎黨或枯萎。長(zhǎng) 期連作的溫室中，特別是西甜瓜、黃瓜、番茄等作物上甚至造成絕產(chǎn)。
[0003] 由于抗根結(jié)線蟲(chóng)病的種質(zhì)資源稀少，所W在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是防治根結(jié)線蟲(chóng) 的重要措施，如棉隆、氯化苦和百畝威等，運(yùn)些藥劑雖然殺蟲(chóng)快，但是會(huì)嚴(yán)重降低蔬菜質(zhì)量， 污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，使用過(guò)程中對(duì)人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人們的 關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)防治存在的污染環(huán)境、不安全的問(wèn)題， 提供一種綠色木霉菌菌株及其應(yīng)用。 陽(yáng)0化]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種綠色木霉菌菌株，其微生物保藏編號(hào)為CGMCC NO. 10922 ;分類命名是：Trichodermavirens;保藏時(shí)間：2015年5月27日；保藏地址：北 京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡(jiǎn)稱CGMCC)。
[0006] 本發(fā)明還提供了綠色木霉菌菌株制備的生防種衣劑。
[0007] 本發(fā)明還提供了綠色木霉菌菌株制備的生防種衣劑在防治根結(jié)線蟲(chóng)中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，所述根結(jié)線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)和/或北方根結(jié)線蟲(chóng)。
[0009] 本發(fā)明還提供了綠色木霉菌菌株用于制備生防種衣劑的方法，該方法包括W下步 驟：
[0010] (1)將綠色木霉菌菌株Tvir-6接種于PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，獲得抱子濃度為 l〇7-l〇i〇/ml的抱子懸浮液；
[0011] (2)將步驟（1)的抱子懸浮液1-化與娃藻± 500-700g、玉米粉200-400g、麥教 50-150g混合均勻后，進(jìn)行固體發(fā)酵，得到固體發(fā)酵物；
[0012] (3)將步驟（2)的固體發(fā)酵物粉碎，過(guò)60目篩，得到抱子粉，抱子粉與粘著劑、分散 劑、防腐劑混合后，制備得到生防種衣劑。
[0013] 優(yōu)選的，步驟（1)中PDB培養(yǎng)基配方為：馬鈴馨200g/l，葡萄糖20g/l，余量為水。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（I)中培養(yǎng)條件為25-28°C，振蕩培養(yǎng)6-8天。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（2)中，在28-30°C條件下進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵6-8天后，于室溫條件 下干燥3-5天，得到固體發(fā)酵物。
[0016] 優(yōu)選的，步驟（3)中，抱子粉、粘著劑、分散劑、防腐劑的質(zhì)量比為85-90 :1-3 : 8-10 :1-2O
[0017] 優(yōu)選的，步驟（3)中，粘著劑為簇甲基纖維素鋼，分散劑為木質(zhì)素橫酸鋼，防腐劑 為鏈霉素。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：
[0019] (1)綠色木霉菌Tvir-6菌株為從±壤中分離到的真菌，對(duì)作物安全無(wú)害，且對(duì)根 結(jié)線蟲(chóng)具有防治作用，在應(yīng)用中具有安全性，適合用于根結(jié)線蟲(chóng)的生物防治。
[0020] (2)使用方法簡(jiǎn)單實(shí)用：將綠色木霉菌菌株制成生防種衣劑，對(duì)種子進(jìn)行丸化包 衣，工藝簡(jiǎn)單實(shí)用。
[0021] (3)防治效果高且穩(wěn)定：綠色木霉菌Tvir-6菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的致 死率達(dá)到99 %W上，在溫室中的防治效果達(dá)到79. 5 %，防治效果高且穩(wěn)定，適于農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 需求。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明的綠色木霉菌菌株Tvir-6的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明的綠色木霉菌菌株Tvir-6的菌落形態(tài)圖；
[0024] 圖3為本發(fā)明的綠色木霉菌菌株Tvir-6的ITS和TEF片段PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[00巧]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地解釋說(shuō)明。 陽(yáng)0%] 實(shí)施例1
[0027] 綠色木霉菌的分離、純化及鑒定： 陽(yáng)02引從順義番茄種植田塊中均勻取±壤樣品，每IOg±壤分別與100mL滅菌水進(jìn)行混 合制成懸浮液，然后依次進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋10000倍的±壤混液100y1涂布于PDA培 養(yǎng)基平板上（即馬鈴馨200g，葡萄糖20g，瓊脂17g，蒸饋水定容至1000ml。將此培養(yǎng)基在 12rC滅菌，在培養(yǎng)皿中鋪制成平板）。PDA培養(yǎng)基中含有75yg/ml氨節(jié)青霉素，抑制細(xì)菌 生長(zhǎng)。將培養(yǎng)基置于25°C培養(yǎng)，待組織塊長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行單抱分離，挑取單菌落在PDA培 養(yǎng)基上純化，用于分類鑒定。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定。
[0029] 挑取菌落上菌絲，放入盛有300y1真菌裂解液FPCB的EP管中，65°C裂解2小時(shí)， 然后用真菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取真菌DNA，WDNA為模 板，用引物口SUITS4和EF1H、邸2T分別進(jìn)行ITS和ten序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20^1，含有IOylPCRMasterMix，lyl正向引物，Iyl反向引物 2,2ylDNA模板，hq 酶0.5^1，無(wú)菌水5.5^1。擴(kuò)增條件：941：4111111，941：553,551：303,721：503,30個(gè)循環(huán)； 72°C7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序。
[0030] 結(jié)果：參見(jiàn)附圖1-2,獲得Tvir-6菌株在PDA培養(yǎng)基平板上，25°C，培養(yǎng)3天后，菌 落直徑為40-60mm，菌落綠色。菌絲分隔，透明，表面光滑，氣生菌絲少，直徑為1-7ym。在主 分枝底部著生許多粗短的次級(jí)分枝。分生抱子梗對(duì)生或互生呈樹(shù)枝狀分枝，頂端小梗呈瓶 形，小梗頂端生分生抱子團(tuán)，分生抱子梗主軸上部彎曲。分生抱子梗長(zhǎng)度可達(dá)60ym，基部 寬5ym，尖端下部產(chǎn)生1-2個(gè)輪生瓶狀抱子梗，抱子梗長(zhǎng)6. 8-13. 2ym，最寬為2. 5-3. 5ym， 基部為2. 0-3. 0ym。分生抱子多為楠球形，呈淡綠色，大小為2. 5-4. 5X2-4ym。依照《真 菌鑒定手冊(cè)》對(duì)Tvir-G菌株形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，確定該菌株綠色木霉菌（Trichodermavirens)。
[0031] 用引物口SUITS4和EF1H、邸2T分別進(jìn)行ITS和ten序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像參見(jiàn)附圖3所示。經(jīng)測(cè)序分析菌株擴(kuò)增的ITS和ten序列長(zhǎng)約 為570bp和88化P。將菌株的ITS和ten序列進(jìn)行BLAST分析后，結(jié)果顯示，Tvir-6菌株 與綠色木霉菌（Trichodermavirens)相似度達(dá)到了 100%。鑒定Tvir-G菌株為綠色木霉 菌（Trichodermavirens)。 陽(yáng)0巧實(shí)施例2
[0033] 綠色木霉菌種衣劑的制備及應(yīng)用：
[0034] 將Tvir-6菌株分別接種到250ml的S角瓶中，每瓶含有PDB液體培養(yǎng)基125ml，在 25°C中震蕩（ieOrpm)培養(yǎng)8天，得到大量的菌絲體和分生抱子。液體發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴馨 葡萄糖液體（PDB)培養(yǎng)基，即馬鈴馨200g，葡萄糖20g，蒸饋水定容至1000ml。
[0035] 將液體搖菌培養(yǎng)（發(fā)酵）所得的抱子菌絲體混合液，抱子濃度為IO7個(gè)/ml)，加 入W下成分：比例如下：抱子液1L、娃藻± 500g、玉米粉200g、麥教50g，混合均勻后，置于 28°C條件下進(jìn)行固體二次發(fā)酵，發(fā)酵6d結(jié)束后，將固體發(fā)酵物放在室溫條件下自然干燥 3d(發(fā)酵物含水量控制在15-25%之間）、粉碎、過(guò)60目篩，得到抱子粉。將抱子粉與粘著劑 (簇甲基纖維素鋼）、分散劑（木質(zhì)素橫酸鋼）、防腐劑（鏈霉素）混合，制備得到生防種衣 劑，其中，抱子粉、粘著劑、分散劑、防腐劑的質(zhì)量比為85 :3 :10 :2,然后種衣劑與種子攬拌 均勻，使抱子粉均勻包衣在種子表面，即完成生防種衣劑對(duì)黃瓜種子的丸化包衣處理，種衣 劑與種子的重量比為1:10 (w/w)。
[0036] 實(shí)施例3 陽(yáng)037] 綠色木霉菌種衣劑的制備及應(yīng)用：
[0038] 將Tvir-6菌株分別接種到250ml的S角瓶中，每瓶含有PDB液體培養(yǎng)基125ml，在 28°C中震蕩（ieOrpm)培養(yǎng)6天，得到大量的菌絲體和分生抱子。液體發(fā)酵培養(yǎng)基為馬鈴 馨葡萄糖液體（PDB)培養(yǎng)基，即馬鈴馨200g，葡萄糖20g，蒸饋水定容至1000ml。
[0039] 將液