低毒介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低毒介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法及其應(yīng)用；1)羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒的合成：利用正硅酸乙酯為原料，制備出粒徑為80～150納米的二氧化硅納米顆粒；2)低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備：羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒表面連接分子量大小為600的低分子量聚醚酰亞胺；制備方法最終制備的介孔二氧化硅基因納米載體的直徑為85～155納米。3)細胞轉(zhuǎn)染:二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染Hela細胞。本發(fā)明操作便捷，快速，反應(yīng)條件溫和；基因納米載體的形貌均勻，細胞毒性低，具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率；在生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用情景。
【專利說明】
低毒介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種制備便捷，反應(yīng)條件無毒無害，轉(zhuǎn)染效率高的一種低毒介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法及其應(yīng)用，屬生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]基因轉(zhuǎn)染是一種非常常規(guī)的生物和醫(yī)藥技術(shù)，但是通常的基因轉(zhuǎn)染用的試劑是相對分子質(zhì)量為25，000的聚醚酰亞胺(PEI)，雖然該PEI比相對分子質(zhì)量為600的PEI的轉(zhuǎn)染效率高，但是其細胞毒性也比相對分子質(zhì)量為600的PEI大得多，因此將相對分子質(zhì)量為600的PEI連接至一納米微球上便可以成功制備出一種轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低的新型基因轉(zhuǎn)染載體。
[0003]此外，用常規(guī)的基因轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染細胞時，很難方便的示蹤基因載體的具體位置，也就無法判定目標細胞是否有外源基因的的進入。于是可以通過先合成一種含有介孔的基因納米載體，然后裝載有機染料(如可以對細胞質(zhì)進行著色的紅色羅丹明)來對細胞質(zhì)進行著色，以達到示蹤基因載體和對靶向細胞著色的目的，并評估目的基因是否進入了靶向細胞。因此，研制出一種具有轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性小，并且可以實時跟蹤外源基因的納米載體等優(yōu)勢的新型基因載體具有重大的意義，在生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域具有重要的科研和臨床應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，我們提出具有轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性小，并且可以實時跟蹤外源基因的納米載體等優(yōu)勢的新型基因載體的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案包括:
[0006]I)羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒的合成:利用正硅酸乙酯為原料，制備出粒徑為80?150納米的二氧化娃納米顆粒；
[0007]2)低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備:羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒表面連接分子量大小為600的低分子量聚醚酰亞胺；制備方法最終制備的介孔二氧化硅基因納米載體的直徑為85?155納米。
[0008]3)細胞轉(zhuǎn)染:二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染Hela細胞。
[0009]具體技術(shù)方案如下:
[0010]1.羧基化介孔二氧化娃納米顆粒的合成步驟如下:
[0011]I)在反應(yīng)容器中配制濃度為I %?2%的十六烷基三甲基溴化銨的溶液10?20毫升；
[0012]2)加入5?10毫升的無水乙醇和100?200微升I摩爾/升的氫氧化鈉，于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60°C加熱條件下，攪拌反應(yīng)10?30分鐘；
[0013]3)向反應(yīng)容器中加入200?300微升的正硅酸乙酯于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60°C加熱條件下攪拌反應(yīng)10?20分鐘，然后關(guān)閉加熱再于400?500轉(zhuǎn)/分鐘條件下，攪拌反應(yīng)30?40分鐘；
[0014]4)反應(yīng)結(jié)束后，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀，產(chǎn)物真空干燥后得到二氧化硅納米顆粒；
[0015]5)取制得的二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中；
[0016]6)向反應(yīng)容器中加入0.5?0.6克氯化鈉，于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60 °C加熱條件下攪拌反應(yīng)3?5小時；
[0017]7)反應(yīng)結(jié)束后，靜止20?30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一離心管中，以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀I?3遍，得到介孔二氧化娃納米顆粒；
[0018]8)取介孔二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中；
[0019]9)加入10?20毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超聲完全溶解3-溴丙酸；
[0020]10)于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?20°C條件下攪拌反應(yīng)6?8小時；
[0021]11)待反應(yīng)結(jié)束后，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到羧基化的介孔二氧化娃納米顆粒。
[0022]2.低毒介孔二氧化硅基因納米的載體制備步驟如下:
[0023]I)取羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中；
[0024]2)加入200?300微升，相對分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺，并于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?20 °C條件下攪拌反應(yīng)6?8小時；
[0025]3)反應(yīng)結(jié)束后，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即得到低毒的介孔二氧化硅基因納米載體。
[0026]3.二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染Hela細胞的方法如下:
[0027]I)取二氧化硅基因納米載體10?20毫克，用無菌去離子水配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一無菌管中，冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0028]2)取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50?100微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3?0.5微克的綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并充分混勻；
[0029]3)加入步驟I)的二氧化硅基因納米載體I?2微升，并混勻后靜止20?30分鐘，SP得到吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體；
[0030]4)將吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體50?100微升加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細胞中；
[0031 ] 5)于37°C，5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?8小時后吸取培養(yǎng)液，加入200?300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液；
[0032]6)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?24小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率。
[0033]本發(fā)明的優(yōu)勢:制備過程不涉及任何有毒有害的試劑，操作便捷，快速，反應(yīng)條件溫和;無毒害。制備的基因納米載體的形貌均勻，細胞毒性低，細胞存活率達到80%?95%。具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率;制備的基因納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率為40?70%。在生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用情景。
【附圖說明】
[0034]圖1:用溶膠凝膠法制備的介孔二氧化硅基因納米載體的透射電子顯微鏡照片(形貌分析)。
[0035]圖2:低毒介孔二氧化硅基因納米載體的細胞毒性分析。
[0036]圖3:低毒介孔二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因至人宮頸癌細胞(Hela細胞)后的表達結(jié)果。
【具體實施方式】
[0037]下面的實施例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0038]實施例1:
[0039]—種低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0040]I)利用溶膠凝膠法制備二氧化硅納米顆粒:取一反應(yīng)容器，向其中配制濃度為1%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的溶液1毫升。加入5毫升的無水乙醇和100微升I摩爾/升的氫氧化鈉，于400轉(zhuǎn)/分鐘，50°C加熱條件下，攪拌反應(yīng)10分鐘。向反應(yīng)容器中量取200微升的正硅酸乙酯于400轉(zhuǎn)/分鐘，60°C加熱條件下攪拌反應(yīng)20分鐘，然后關(guān)閉加熱再于400轉(zhuǎn)/分鐘條件下，攪拌反應(yīng)40分鐘。待反應(yīng)結(jié)束后，立即以13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀I遍，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0041 ] 2) 二氧化硅納米顆粒除去模板CTAB:取步驟I)中制得的二氧化硅納米顆粒1毫克，用無水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。向該反應(yīng)容器中稱取0.5克氯化鈉，于400轉(zhuǎn)/分鐘，50 0C加熱條件下攪拌反應(yīng)3小時。待反應(yīng)結(jié)束后，靜止30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一離心管中，以13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀I遍，得到介孔二氧化硅納米顆粒，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0042 ] 3) 二氧化硅納米顆粒的羧基化:取步驟2)所述的制備方法制備的二氧化硅納米顆粒10毫克，用無水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入10毫克的3-溴丙酸，以50W的功率超聲完全溶解3-溴丙酸。于400轉(zhuǎn)/分鐘，15°C條件下攪拌反應(yīng)6小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I遍。
[0043]4)羧基化二氧化娃納米顆粒表面接PEI:取步驟3)所述的制備方法制備的羧基化的二氧化硅納米顆粒10毫克，用無水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入200微升，相對分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于400轉(zhuǎn)/分鐘，15°C條件下攪拌反應(yīng)6小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I遍，即得到可以吸附DNA的基因納米載體，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0044]實施例2:
[0045]—種低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0046]I)利用溶膠凝膠法制備二氧化硅納米顆粒:取一反應(yīng)容器，向其中配制濃度為1.5 %的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的溶液15毫升。加入7毫升的無水乙醇和150微升I摩爾/升的氫氧化鈉，于450轉(zhuǎn)/分鐘，550C加熱條件下，攪拌反應(yīng)20分鐘。向反應(yīng)容器中量取250微升的正硅酸乙酯于450轉(zhuǎn)/分鐘，55°C加熱條件下攪拌反應(yīng)15分鐘，然后關(guān)閉加熱再于450轉(zhuǎn)/分鐘條件下，攪拌反應(yīng)35分鐘。待反應(yīng)結(jié)束后，立即以12，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀2遍，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0047]2) 二氧化硅納米顆粒除去模板CTAB:取步驟I)中制得的二氧化硅納米顆粒15毫克，用無水乙醇配制成10毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。向該反應(yīng)容器中稱取0.55克氯化鈉，于450轉(zhuǎn)/分鐘，55 V加熱條件下攪拌反應(yīng)4小時。待反應(yīng)結(jié)束后，靜止25分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一離心管中，以12，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀2遍，得到介孔二氧化硅納米顆粒，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0048]3) 二氧化硅納米顆粒的羧基化:取步驟2)所述的制備方法制備的二氧化硅納米顆粒15毫克，用無水乙醇配制成15毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入15毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超聲完全溶解3-溴丙酸。于450轉(zhuǎn)/分鐘，18°C條件下攪拌反應(yīng)6?8小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以12，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心25分鐘，并用去離子水洗滌沉淀2遍。
[0049]4)羧基化二氧化娃納米顆粒表面接PEI:取步驟3)所述的制備方法制備的羧基化的二氧化硅納米顆粒15毫克，用無水乙醇配制成10毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入250微升，相對分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于450轉(zhuǎn)/分鐘，18°C條件下攪拌反應(yīng)7小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以12，500轉(zhuǎn)/分鐘，離心250分鐘，并用去離子水洗滌沉淀2遍，即得到可以吸附DNA的基因納米載體，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0050]實施例3:
[0051 ] 一種低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法，具體步驟如下:
[0052]I)利用溶膠凝膠法制備二氧化硅納米顆粒:取一反應(yīng)容器，向其中配制濃度為2%的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的溶液20毫升。加入10毫升的無水乙醇和200微升I摩爾/升的氫氧化鈉，于500轉(zhuǎn)/分鐘，60 0C加熱條件下，攪拌反應(yīng)30分鐘。向反應(yīng)容器中量取300微升的正硅酸乙酯于500轉(zhuǎn)/分鐘，60°C加熱條件下攪拌反應(yīng)20分鐘，然后關(guān)閉加熱再于500轉(zhuǎn)/分鐘條件下，攪拌反應(yīng)40分鐘。待反應(yīng)結(jié)束后，立即以12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀3遍，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0053]2) 二氧化硅納米顆粒除去模板CTAB:取步驟I)中制得的二氧化硅納米顆粒20毫克，用無水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。向該反應(yīng)容器中稱取
0.6克氯化鈉，于500轉(zhuǎn)/分鐘，60 0C加熱條件下攪拌反應(yīng)5小時。待反應(yīng)結(jié)束后，靜止20分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一離心管中，以12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀3遍，得到介孔二氧化硅納米顆粒，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0054]3) 二氧化硅納米顆粒的羧基化:取步驟2)所述的制備方法制備的二氧化硅納米顆粒20毫克，用無水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入20毫克的3-溴丙酸，以60W的功率超聲完全溶解3-溴丙酸。于4500轉(zhuǎn)/分鐘，20°C條件下攪拌反應(yīng)8小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀3遍。
[0055]4)羧基化二氧化娃納米顆粒表面接PEI:取步驟3)所述的制備方法制備的羧基化的二氧化硅納米顆粒20毫克，用無水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中。加入300微升，相對分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI)，并于500轉(zhuǎn)/分鐘，20°C條件下攪拌反應(yīng)8小時。待反應(yīng)結(jié)束后，以12，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，并用去離子水洗滌沉淀3遍，即得到可以吸附DNA的基因納米載體，產(chǎn)物真空干燥處理后保存。
[0056]實施例4:
[0057]二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)DNA至動物細胞，具體步驟如下:
[0058]I)二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA:取上述步驟的制備方法制備的二氧化硅基因納米載體10毫克，用無菌去離子水配制成5毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一無菌管中，冰箱保存?zhèn)溆?。另取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻。加入I微升二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止20分鐘，即得到吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體。
[0059]2)吸附有綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA的二氧化硅納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細胞:將步驟I)所述的制備方法制備的含有外源基因質(zhì)粒DAN和二氧化硅納米載體的復(fù)合物50微升加入至一48孔板的海拉(Hela)細胞中。于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后吸取培養(yǎng)液，加入200毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。于37 °C，5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖3所示。
[0060]實施例5:
[0061 ] 二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)DNA至動物細胞，具體步驟如下:
[0062]I)二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA:取上述步驟的制備方法制備的二氧化硅基因納米載體15毫克，用無菌去離子水配制成10毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一無菌管中，冰箱保存?zhèn)溆?。另取一無菌的1.5毫升的離心管，加入75微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.4微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻。加入1.5微升二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止25分鐘，即得到吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體。
[0063]2)吸附有綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA的二氧化硅納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細胞:將步驟I)所述的制備方法制備的含有外源基因質(zhì)粒DAN和二氧化硅納米載體的復(fù)合物75微升加入至一48孔板的海拉(Hela)細胞中。于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時后吸取培養(yǎng)液，加入250毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。于37 °C，5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖3所示。
[0064]實施例6:
[0065]二氧化硅基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)DNA至動物細胞，具體步驟如下:
[0066]I)二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA:取上述步驟的制備方法制備的二氧化硅基因納米載體20毫克，用無菌去離子水配制成20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一無菌管中，冰箱保存?zhèn)溆?。另取一無菌的1.5毫升的離心管，加入100微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.5微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻。加入2微升二氧化硅基因納米載體，并混勻后靜止30分鐘，即得到吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體。
[0067]2)吸附有綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA的二氧化硅納米載體轉(zhuǎn)染基因至動物細胞:將步驟I)所述的制備方法制備的含有外源基因質(zhì)粒DAN和二氧化硅納米載體的復(fù)合物100微升加入至一24孔板的海拉(Hela)細胞中。于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時后吸取培養(yǎng)液，加入300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。于37 °C，5 % 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率，基因表達效率如圖3所示。
[0068]實施例7:
[0069]形態(tài)觀察、粒徑及其分布測定。取介孔二氧化硅基因納米載體溶液經(jīng)離心分離后，取出沉淀物，加蒸餾水少量使分散，滴于碳支持膜上制樣，在透射電鏡下觀察其形貌狀態(tài)并拍照。透射電鏡下觀察到介孔二氧化硅基因納米載體呈均勻規(guī)則的球形粒子，其直徑在80?150nm范圍內(nèi)可控。所制得的納米載體如圖1所示。
[0070]實施例8:
[0071]介孔二氧化硅基因納米載體的細胞生物安全性測定。用DMEM培養(yǎng)基配制0.05?I毫克每毫升的不同濃度介孔二氧化硅基因納米載體溶液，并與Hela細胞于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24小時。然后用MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞存活效率。MTT檢測結(jié)果顯示:當介孔二氧化硅基因納米載體濃度達到I毫克每毫升時，其細胞存活仍率在78 %以上。MTT檢測介孔二氧化硅基因納米載體的細胞存活率結(jié)果如圖2所示。
[0072]本發(fā)明公開和提出的一種低毒介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過借鑒本文內(nèi)容，適當改變條件路線等環(huán)節(jié)實現(xiàn)，盡管本發(fā)明的方法和制備技術(shù)已通過較佳實施例子進行了描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和技術(shù)路線進行改動或重新組合，來實現(xiàn)最終的制備技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
【主權(quán)項】
1.一種低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備方法;其特征是包括如下步驟: 1)羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒的合成:利用正硅酸乙酯為原料，制備出粒徑為80?150納米的二氧化娃納米顆粒； 2)低毒的介孔二氧化硅基因納米載體的制備:羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒表面連接分子量大小為600的低分子量聚醚酰亞胺；制備方法最終制備的介孔二氧化硅基因納米載體的直徑為85?155納米。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒的合成步驟如下: 1)在反應(yīng)容器中配制濃度為I%?2%的十六烷基三甲基溴化銨的溶液10?20毫升； 2)加入5?10毫升的無水乙醇和100?200微升I摩爾/升的氫氧化鈉，于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60°C加熱條件下，攪拌反應(yīng)10?30分鐘； 3)向反應(yīng)容器中加入200?300微升的正硅酸乙酯于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60°C加熱條件下攪拌反應(yīng)10?20分鐘，然后關(guān)閉加熱再于400?500轉(zhuǎn)/分鐘條件下，攪拌反應(yīng)30?40分鐘； 4)反應(yīng)結(jié)束后，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀，產(chǎn)物真空干燥后得到二氧化硅納米顆粒； 5)取制得的二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中； 6)向反應(yīng)容器中加入0.5?0.6克氯化鈉，于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，50?60°C加熱條件下攪拌反應(yīng)3?5小時； 7)反應(yīng)結(jié)束后，靜止20?30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一離心管中，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用無水乙醇洗滌沉淀I?3遍，得到介孔二氧化娃納米顆粒； 8)取介孔二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中； 9)加入10?20毫克的3-溴丙酸，以50?60W的功率超聲完全溶解3-溴丙酸； 10)于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?20°C條件下攪拌反應(yīng)6?8小時； 11)待反應(yīng)結(jié)束后，以12,000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，得到羧基化的介孔二氧化娃納米顆粒。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是低毒的基因納米載體制備步驟如下: 1)取羧基化的介孔二氧化硅納米顆粒10?20毫克，用無水乙醇配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一反應(yīng)容器中； 2)加入200?300微升，相對分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺，并于400?500轉(zhuǎn)/分鐘，15?20°C條件下攪拌反應(yīng)6?8小時； 3)反應(yīng)結(jié)束后，以12，000?13，000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20?30分鐘，并用去離子水洗滌沉淀I?3遍，即得到低毒的介孔二氧化硅基因納米載體。4.低毒的二氧化硅基因納米載體應(yīng)用于吸附DNA及細胞轉(zhuǎn)染。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征是二氧化硅基因納米載體吸附綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染Hela細胞的方法如下: I)取二氧化硅基因納米載體10?20毫克，用無菌去離子水配制成5?20毫克/毫升的溶液并轉(zhuǎn)移至一無菌管中，冰箱保存?zhèn)溆茫? 2)取一無菌的1.5毫升的離心管，加入50?100微升無血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3?0.5微克的綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并充分混勻； 3)加入步驟I)的二氧化硅基因納米載體I?2微升，并混勻后靜止20?30分鐘，即得到吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體； 4)將吸附有質(zhì)粒DNA的基因納米載體50?100微升加入至一24孔板或48孔板的海拉(Hela)細胞中; 5)于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?8小時后吸取培養(yǎng)液，加入200?300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液； 6)于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?24小時后，用熒光顯微鏡觀察并計算基因表達效率。
【文檔編號】C12N15/87GK105861560SQ201610209588
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】常津, 鄭斌, 王漢杰, 諶紅彬, 潘慧卓, 常天賜
【申請人】天津大學(xué)