一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體及其應用。本發(fā)明通過分析魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列，將原始25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變（K8R、V16K和L21R），同時為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N。將魚源抗菌肽pleurocidin突變體基因進行畢赤酵母偏愛密碼子優(yōu)化后人工合成，克隆于畢赤酵母中表達，結(jié)果重組表達的魚源抗菌肽pleurocidin突變體與原始抗菌肽相比抗菌效力獲得顯著提高。將重組菌株發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，發(fā)酵液進一步純化后可制成抗菌肽制劑，用于水產(chǎn)動物疾病的預防和治療。
【專利說明】
一種魚源抗菌肽PI euroc i d i n突變體及其應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因改造技術(shù)領域，具體涉及一種魚源抗菌肽pleurocidin突變 體及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)是生物體經(jīng)誘導產(chǎn)生的一類具有多種生 物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性 及毒副作用等優(yōu)點。近年來，人們發(fā)現(xiàn)抗菌肽存在多種動物體內(nèi)，且具有抑菌機制獨特、抑 菌譜廣、抑菌活性高以及宿主不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，應用前景廣闊。魚類抗菌肽是一類小分子 蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與組成復雜多樣，從已報道的序列來分析，它們并沒有很高的同源性，但存 在一些共同特征，如含有較多精氨酸或賴氨酸而使分子帶正電;含有較多疏水氨基酸，可使 分子折疊成疏水或雙親性a螺旋結(jié)構(gòu)等。魚類抗菌肽是魚體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成 部分，當魚體受到損傷或病原微生物侵襲時，能迅速產(chǎn)生抗菌肽以預防和殺傷病原微生物 的入侵，其合成速度快，在體內(nèi)擴散迅速、靈活的特點是其他大分子蛋白質(zhì)(如抗體等)和免 疫細胞所不具備的，在防御海水性細菌和病毒入侵方面起著重要作用。
[0003] 抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中替代抗生素的應用前景非常廣闊，但在工業(yè)化應用方面存在 很多問題需要解決。如抗菌肽的來源問題，由于抗菌肽在動物體內(nèi)含量很低，直接從動物體 內(nèi)提取成本太高;天然抗菌肽抑菌效果較差，直接應用效果不理想;天然抗菌肽帶有一定的 細胞毒性，需要重新設計其結(jié)構(gòu)才具有臨床應用價值等。以其空間結(jié)構(gòu)的模擬為基礎，天然 抗菌肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化的一種方式是通過抗菌肽親水性和疏水性氨基酸替換來調(diào)整抑菌活性 的高低，另一種方式是將不同抗菌肽的活性部位進行雜合，合成一種新的雜合抗菌肽來提 高其抑菌活性，降低其毒性。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，原核、真核表達系統(tǒng)的成熟應用也 為抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)提供了可能。
[0004] 魚源抗菌肽pleurocidin是由25個氨基酸殘基組成的多肽，是從美洲擬蝶皮膚分 泌液中分離得到的，與樹娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果繩的抗菌肽ceratotoxin具有 序列同源性。魚源抗菌肽pleurocidin的抑菌機理是通過形成兩親性的a螺旋結(jié)構(gòu)，穿透細 菌的細胞膜來行使抑菌功能的。魚源抗菌肽pleurocidin帶有較高的陽離子電荷，這些結(jié)構(gòu) 與其起始的細胞膜結(jié)合相關。本發(fā)明通過氨基酸替換的方法對魚源抗菌肽pleurocidin進 行改造，獲得一種新型魚源抗菌肽pleurocidin突變體，大大提高了其抑菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，即通過生物軟件對魚 源抗菌肽pleurocidin(GenBank登錄號:AAF17252)的氨基酸序列進行空間結(jié)構(gòu)分析，分別 將魚源抗菌肽pleurocidin的25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變(K8R、V16K和L21R)，同時 為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力獲得顯著提高。 [000 6]本發(fā)明首先提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，其編碼蛋白的氨基酸序列 為SEQ ID N0:1; 上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2; 本發(fā)明還提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體的重組畢赤酵母的制備方法，其制 備步驟如下： 1) 根據(jù)魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因 序列，連入重組酵母表達載體中，構(gòu)建成表達重組質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的表達重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主酵母菌，構(gòu)建能表達魚源抗菌肽突變體的重組基 因工程酵母菌;用該重組基因工程菌高密度發(fā)酵表達出魚源抗菌肽突變體； 3) 對重組表達的魚源抗菌肽突變體進一步濃縮、純化后，測定效價達12000U/ml。稀釋 分裝，即為抗菌肽制劑。
[0007] 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了能表達一種魚源抗菌肽突變體的重組酵母菌株。 將重組魚源抗菌肽突變體制備成抗菌肽制劑，其抑菌效價高、抑菌譜廣，具有廣闊的市場前 景和開發(fā)價值。
【具體實施方式】
[0008] 下面結(jié)合【具體實施方式】來進一步描述本發(fā)明，但本領域技術(shù)人員應該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對本發(fā)明的技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
[0009] 實施例1新型魚源抗菌肽突變體及其基因的獲得 1、魚源抗菌肽pleurocidin(GenBank登錄號:AAF17252)是由25個氨基酸殘基組成的抗 菌肽，與樹娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果繩的抗菌肽ceratotoxin具有序列同源性。 為了進一步提高其抑菌活性，通過生物軟件對魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列進行 空間結(jié)構(gòu)分析，分別將魚源抗菌肽pleurocidin的25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變 (K8R、V16K和L21R)，同時為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其 抗菌效力獲得顯著提高，獲得一種新型魚源抗菌肽突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0010] 2、根據(jù)獲得的新型魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照畢赤酵母 基因密碼子偏好性進行重新設計，獲得編碼新型魚源抗菌肽突變體的核苷酸序列SEQ ID N0:2。并在其N端引入Kex2酶切位點。兩端引入Xhol和Xbal酶切位點，以便于克隆入畢赤酵 母表達載體中。
[0011] 實施例2基因工程魚源抗菌肽突變體表達載體的構(gòu)建與工程菌的獲得 1、將含抗菌肽基因的載體和酵母表達載體均用XAol和Zhl雙酶切，酶切產(chǎn)物回收并 連接，進行PCR鑒定、測序。
[0012] 2、陽性質(zhì)粒經(jīng)SacI單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中。電轉(zhuǎn)化后均 勻涂布于含l〇〇yg/mL Zeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的陽性轉(zhuǎn) 化子生長較大，將各轉(zhuǎn)化子依次點種至含Zeocin 200yg/mL、500yg/mL、1000yg/mL的YPDS選 擇平板，以在高濃度Zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株。
[0013] 3、將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100yg/mL Zeocin的Yro培養(yǎng)液中，28°C 振搖培養(yǎng)18個小時。取此菌液按5%體積比轉(zhuǎn)接于5mL BMGY培養(yǎng)基中，28°C搖振培養(yǎng)18-24h 左右，0D值約為5-6。培養(yǎng)物直接轉(zhuǎn)接于25mL BMMY培養(yǎng)基中，28°C繼續(xù)搖振培養(yǎng)。為了維持 誘導表達，每隔24h補加100%甲醇使終濃度達1%。4811后，4°C 5000r/min離心10min，收集上 清，進行抑菌活性測定。能產(chǎn)生抑菌活性的重組酵母菌株即為能產(chǎn)生新型魚源抗菌肽突變 體的陽性菌株，命名為YA株。
[0014]實施例3新型魚源抗菌肽突變體的發(fā)酵、純化制備 1、發(fā)酵工藝 1)將篩選得到的陽性重組子活化后按1%_1〇%接種量接種于三角瓶，28-30°C，200r/min 搖床培養(yǎng)16-24h后以5%-20%接種量接入10L發(fā)酵罐（實裝培養(yǎng)基7L)，溫度28-30°C，轉(zhuǎn)速 500-1500r/min，培養(yǎng)基pH值5.0-6.0，通氣量0.1-1. OVVM( 1L發(fā)酵液lmin通入的氧氣量），溶 氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時流加甲醇 至發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵持續(xù)48-72h。
[0015] 2)發(fā)酵結(jié)束后原罐蒸汽100°C滅菌10_20min，放料，5000r/min離心10min，收集發(fā) 酵上清即為抗菌肽半成品。
[0016] 3)新型抗菌肽制劑 抗菌肽半成品經(jīng)微濾、超濾、噴霧干燥、凍干等生產(chǎn)的粉劑和以生化方法精制、純化后 得到液體制劑。
[0017] 上述基因工程抗菌肽可開發(fā)成水產(chǎn)動物飼料添加劑或水產(chǎn)動物疾病的預防和治 療制劑。
[0018] 實施例4新型魚源抗菌肽突變體的最小抑菌濃度測定(MIC) 1、試驗菌株 金黃色葡萄球菌(CowanI)、鰻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌。
[0019] 2、菌株處理:將菌種復蘇，在固體培養(yǎng)基中劃線，在28°C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將過 夜培養(yǎng)的細菌挑單菌落于含有25mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶放于搖床28°C培養(yǎng) 12-18h。將培養(yǎng)后的菌液在600nm處測其吸光度值，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度，使其處于0.6-0.8之間。之后將菌液稀釋成濃度為5 X 105CFU/mL，依次取90yL加入到96孔板的各孔內(nèi)。
[0020] 3、抗菌肽定量后用培養(yǎng)基依次做倍比稀釋。將稀釋好的抗菌肽各取10此依次加入 到96孔板的各個孔中，此時每個孔的反應體系為100此。96孔板蓋蓋后，28°C振蕩培養(yǎng)24h 后，觀察并用酶標儀測量〇D_值并記錄實驗結(jié)果。抗菌肽樣品經(jīng)過二倍稀釋后，成一系列濃 度，以抑制細菌生長的最小濃度來定義最小抑菌濃度(MIC)。菌液和培養(yǎng)基分別用來做陰性 和陽性對照，各自代表抑菌率為0和100%。同時設立魚源抗菌肽pleurocidin標準品試驗組 作為對照，用于觀察抗菌肽改造前后的抑菌活性變化。
[0021 ] 4、用微量稀釋法測定重組魚源抗菌肽pleurocidin及其突變體對多種細菌的最低 抑菌濃度，結(jié)果表明其對水產(chǎn)常見病害菌均有顯著的抑制效果，特別是改造的新型魚源抗 菌肽突變體與魚源抗菌肽pleurocidin標準品相比，對暢弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏 菌的抑菌能力均得到廣泛提高，顯示了本發(fā)明對魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸突變效 果顯著。
[0022]表1抗菌肽對多種水產(chǎn)病害菌的最低抑菌濃度
【主權(quán)項】
1 · 一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，其特征在于，所述的魚源抗菌肽pleurocidin 突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。2. -種核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于編碼權(quán)利要求1所述的魚源抗 菌肽pleurocidin突變體。3. 如權(quán)利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:2〇4. 權(quán)利要求1所述的魚源抗菌肽pleurocidin突變體在制備水產(chǎn)動物飼料添加劑或疾 病的預防和治療制劑中的應用。
【文檔編號】A23K50/80GK105968179SQ201610363295
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】侯竹美
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學