抗鮭魚甲病毒e1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗鮭魚甲病毒(SAV)E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體及其應用，屬于生物技術領域。本發(fā)明所提供的抗鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No.12289的小鼠雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。本發(fā)明針對SAV六個基因型的高度保守區(qū)(436?1137bp)制備出了抗鮭魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體，研究表明，該單克隆抗體能夠與鮭魚甲病毒及E1重組蛋白發(fā)生特異性反應，而與傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)、傳染性胰腺壞死病病毒(IPNV)不反應。因此，本發(fā)明的提出為SAV的檢測或診斷提供了一種新的，有效的技術手段。CGMCC No.1228920160427
【專利說明】
抗結魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種單克隆抗體及其用途，特別設及一種抗娃魚甲病毒E1基因高保守 區(qū)蛋白的單克隆抗體，還設及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其在檢測娃魚甲病毒中 的用途，本發(fā)明屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 娃魚甲病毒(salmonid al曲avirus，SAV)是嚴重危害歐洲大西洋娃和虹縛養(yǎng)殖業(yè) 的疫病病原之一，大西洋娃（salmo salar)和虹縛(化corhynchus mykiss)感染該病毒后引 起膜腺、屯、肌炎癥和昏睡等癥狀，致死率達1 %~48%，此病在娃縛養(yǎng)殖的各個階段均有爆 發(fā)。SAV是披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒屬(Alphavirus)內的一個新成員，目前已發(fā)現(xiàn) 六個基因型（SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV5、SAV 6)。其中，SAV 1、SAV 3、SAV 4、SAV 5、 SAV 6可感染大西洋娃引起膜腺?。⊿almon pancreas disease，PD);SAV 2可感染虹縛引起 睡?。⊿leeping disease，SD)。目前，在國際動物衛(wèi)生組織(ΟΙΕ)和我國進境動物一、二類傳 染病名錄中均被列為必報疫病(世界動物衛(wèi)生組織，2014)。
[0003] SAV是單股正鏈RNA病毒，基因組長11-1化b，且含有兩個開放閱讀框(0RF)。第一個 0RF編碼4種非結構蛋白，稱為NSP1、NSP2、NSP3和NSP4，nsPs的作用可能是同宿主蛋白一起 構成了復制復合體(RC)，復制病毒的基因組并轉錄第二個0RF。第二個0RF編碼26S子基因的 mRNA，最終產(chǎn)生5個結構蛋白，即衣殼蛋白、63、62、61(、和61，已被證實衣殼蛋白、61和62在病 毒復制時被表達。病毒粒子具有囊膜，大小為65nm，其中E1為跨膜蛋白暴露于病毒粒子表 面。E1基因全長1383bp，編碼461個氨基酸，各基因型之間E1蛋白具有很強的保守性，其中 436-1137bp運段基因在各基因型之間100%保守。
[0004] 近年來，我國一些地方，特別是北方地區(qū)，大規(guī)模發(fā)展了冷水魚類(如:虹縛)養(yǎng)殖， 且取得了巨大的經(jīng)濟效益。目前該病廣泛流行于蘇格蘭、挪威、愛爾蘭、法國等歐洲國家，據(jù) 統(tǒng)計從1995年至2007年發(fā)病率逐年增加高達90%，每年由此疫病造成巨大的經(jīng)濟損失。雖 然我國目前尚未發(fā)現(xiàn)該病毒，但是隨著近年我國對娃科魚類進口的增加，該病傳入我國的 風險也日益增大，因此有必要盡早建立對娃魚甲病毒快速靈敏的檢測方法，防止該病傳入 我國，SAV的有效預報或者診斷是我們必須解決的問題。對其檢測或者鑒定的方法有:細胞 培養(yǎng)方法、傳統(tǒng)血清學方法和分子生物學方法，他們都受限于各自的特點，細胞培養(yǎng)方法和 傳統(tǒng)血清學方法檢測時，費時費力；分子生物學方法存在著假陽性，可信度比較低。單克隆 抗體技術的引進，為建立一種簡單快速的檢測方法提供了新的技術手段。
[0005] 本發(fā)明通過分析比對SAV六個基因型基因組，發(fā)現(xiàn)SAV六個基因型各基因型之間E1 蛋白具有很強的保守性，其中436-1137bp運段基因在各基因型之間100%保守。因此，本發(fā) 明針對運一區(qū)域制備出抗娃魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體，本發(fā)明的提出為 建立一種簡單、快速和準確的SAV診斷技術提供了物質基礎。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一種抗娃魚甲病毒El基因高保守區(qū)蛋 白的單克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供一種檢測娃魚甲病毒雙抗體夾屯屯LISA 檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明所要解決的第Ξ個技術問題是提供了抗娃魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白 的單克隆抗體在檢測娃魚甲病毒和制備檢測娃魚甲病毒試劑中的應用。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術手段：
[0010] -種病毒含有多種抗原，一種抗原又可能含有多個抗原位點。因此針對一種抗原 可W獲得不止一種抗體，而且運些抗體對抗原的結合特性可能是不同的。為了找到能與抗 原特異性結合的單克隆抗體，需要進行大量反復比較、篩選和鑒定工作。本發(fā)明通過大量的 工作，獲得了能分泌特異性結合娃魚甲病毒E1蛋白的雜交瘤細胞株;并在此基礎上首次建 立了檢測娃魚甲病毒的雙抗體夾屯、化ISA檢測方法，并制備了檢測病娃魚甲病毒雙抗體夾 屯、ELISA檢測試劑盒，可用于大規(guī)模娃魚甲病毒的檢測，具有很廣闊的應用前景。
[0011] 具體的，本發(fā)明所提供的抗娃魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白單克隆抗體，是由保 藏編號為CGMCC No. 12289的小鼠雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。該小鼠雜交瘤細胞株命名為 26E9C2，分類命名為抗娃魚甲病毒雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、（簡稱CGMCC)，地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物 研究所，其保藏編號為CGMCC No. 12289,保藏時間為2016年4月27日。
[0012] 進一步的，本發(fā)明還提出了所述的單克隆抗體在制備檢測娃魚甲病毒試劑中的用 途。
[0013] 特異性實驗表明，本發(fā)明的單克隆抗體能夠與娃魚甲病毒發(fā)生特異性反應，而與 傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)、傳染性膜腺壞死病病毒(IPNV)不反應。
[0014] 再進一步的，本發(fā)明還提出了一種用于檢測娃魚甲病毒的雙抗體夾屯、化ISA檢測 試劑盒，其含有本發(fā)明所述的單克隆抗體。
[0015] 在本發(fā)明所述的雙抗體夾屯屯LISA檢測試劑盒中，優(yōu)選的，還含有抗SAV E1重組蛋 白的多克隆抗體。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的單克隆抗體作為檢測抗體，工作濃度為1.3Uig/mL，所 述的多克隆抗體作為包被抗體，工作濃度為1.26yg/mL。
[0017] 使用本發(fā)明的試劑盒檢測SAV，其SAV最低檢出量為1.41ug/mL。W〇D490nm> 0.170949作為陽性判定標準，該檢測方法與經(jīng)春病毒血癥病毒(SVCV)、傳染性造血器官壞 死病病毒(IHNV)、病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)和傳染性膜腺壞死病病毒(IPNV)無交叉 反應，多次重復性試驗穩(wěn)定性較好。
[0018] 最后，本發(fā)明還提出了所述的雙抗體夾屯、化ISA檢測試劑盒在制備檢測娃魚甲病 毒試劑中的用途。
[0019] 綜上，本發(fā)明針對SAV六個基因型的高度保守區(qū)（436-1137bp)制備出了抗娃魚甲 病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體，研究表明，該單克隆抗體能夠與娃魚甲病毒發(fā)生 特異性反應，而與其他病毒不反應。本發(fā)明的提出為SAV的檢測或診斷提供了一種新的技術 手段。
【附圖說明】
[0020] 圖1為26E9C2與重組蛋白El的Western blot鑒定圖，其中，Μ為蛋白Marker; 1: pCold-El/^L21誘導前菌體，2:pCold-El/^L21誘導后菌體；
[0021] 圖2為26E9C2與SAV的間接免疫巧光試驗，其中，A為接種SAV的CHSE-214細胞，B為 C服E-214細胞對照；
[0022] 圖3為雜交瘤細胞的染色體計數(shù)，其中，A為SP2/0骨髓瘤細，B為雜交瘤細胞 2 犯 9C2。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修 改或替換，但運些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0024] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0025] 實施例1抗娃魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體的制備
[00%] 1、抗原的制備
[0027] 根據(jù)GenBank中公布的SAV各基因型中E1基因，選擇高保守序列（436-1137bp，共 70化P)合成基因，命名為SAV E1，將其克隆到原核表達載體pProEX-HTa中構建重組質粒。將 重組質粒轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞化21中，經(jīng)終濃度為1. Ommol/L的IPTG誘導表達，獲得 大量表達的重組蛋白pProEX-HTa-El。用切膠純化的方法純化重組蛋白pProEX-HTa-El。
[002引 2、免疫小鼠
[0029] 免疫用的小鼠為SPF級5周齡雌性BALB/c小鼠。每只小鼠 W上述純化后的表達重組 蛋白（30微克)與弗氏完全佐劑1:1混合，腹腔注射;在一免后第14同劑量進行第二次免疫； 二免后第7天，小鼠尾部采血檢測血清抗體效價;在二免后第14天重復二免過程，免疫部位 和劑量同前，為第Ξ次免疫;7天后尾部采血測定效價，并加強免疫，由腹腔直接注射2倍劑 量免疫原，不加佐劑，劑量同前，第4次免疫后第3天，將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾臟用于細 胞融合。
[0030] 3、細胞融合
[0031 ]常規(guī)的細胞融合技術:取免疫小鼠的脾臟和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合后，加入小 鼠的胸腺細胞與融合細胞在HAT培養(yǎng)系中共培養(yǎng)。
[0032] 所述技術中應用的HAT培養(yǎng)基的配制：將50倍濃縮的HAT(2ml，GIBC0公司）及特級 胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司）加入到改良型RPMI1640培養(yǎng)基(80ml， hyclone公司）中混勻。
[0033] 4、雜交瘤細胞的篩選與克隆
[0034] 融合細胞培養(yǎng)10天后，收取細胞培養(yǎng)上清，W娃魚甲病毒為檢測抗原，應用間接 ELISA方法檢測細胞上清液中的特異性抗體，同時設置SP2/0細胞培養(yǎng)上清液作為陰性對照 和融合前眼球采血所得陽性血清作為陽性對照，并設空白對照，WP/N〉2判定為陽性，反之 則為陰性。
[0035] 經(jīng)篩選，最終獲得一株能夠穩(wěn)定分泌抗娃魚甲病毒El基因高保守區(qū)蛋白單克隆抗 體的雜交瘤細胞株，命名為26E9C2,該雜交瘤細胞株已于2016年4月27日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，其保藏編號為CGMCC No. 12289。
[0036] 實施例2抗娃魚甲病毒El基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體特性鑒定
[0037] 1 .Western blot鑒定單抗的反應性
[0038] 提取pCold-El/BL21誘導前菌體蛋白W及pCold-El/BL21誘導后的菌體蛋白，經(jīng) SDS-PAGE電泳后進行半干轉印，轉印結束后將轉印膜放入5%脫脂乳中4°C封閉過夜，用 PBST洗涂3次，每次5min; W實施例1獲得的陽性雜交瘤細胞26E9C2的培養(yǎng)上清液作為一抗， 室溫作用化，用PBST洗涂3次，每次5min;再WHRP標記山羊抗鼠 IgG( 1:2000)為二抗，室溫作 用化，用PBST洗涂3次，每次15min，E化顯色液顯色。
[0039] Western blot鑒定結果如圖1所示，從該結果可W看出實施例1獲得的陽性雜交瘤 細胞培養(yǎng)上清液能夠與pCold-El/化21誘導后的菌體蛋白發(fā)生反應，而與pCold-El/^L21誘 導前菌體蛋白不發(fā)生反應，說明該雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體能夠與娃魚甲病毒E1重 組蛋白發(fā)生特異性反應。
[0040] 2.間接免疫巧光試驗
[0041] 放無菌爬片于6孔板中，將C服E-214細胞接種于6孔板，使其長成致密單層。常規(guī)方 法接種SAV，同時未接種SAV的細胞作為對照。15°C培養(yǎng)7d后棄去細胞培養(yǎng)液，用4%多聚甲 醒室溫固定30min，PBS洗涂3次，每次5min;每孔加入2 % Tr i ton-100，37 °C lOmin，PBS洗涂3 次，每次5min;每孔加入1 % BSA，37 °C封閉化，PBS洗涂3次，每次5min;加入實施例1獲得的雜 交瘤細胞株26E9C2的培養(yǎng)上清液，37 °C解育化，PBS洗涂3次，每次5min;加入FITC標記的山 羊抗鼠 IgG( 1:5000)，37°C避光解育化，PBST洗涂3次，每次5min;在免疫巧光顯微鏡下觀察 結果。
[0042] 間接免疫巧光試驗結果如圖2所示，從該結果可W看出實施例1獲得的雜交瘤細胞 株26E9C2的培養(yǎng)上清液能夠與接種SAV的CHSE-214細胞發(fā)生反應，而與CHSE-214細胞對照 不反應，說明該雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體能夠與SAV結合。
[0043] 3.單抗亞類鑒定
[0044] 通過單抗亞類鑒定試劑盒來鑒定單抗的亞型。將試劑盒中的IgGl、IgG2a、IgG化、 IgG3、IgA和IGM 6類亞類試劑按1:1000用PBS稀釋，加入化ISA板中，每孔200yL，37°C作用 化;PBST洗涂3次，每孔20化L，每次5min，每孔加入10化L雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，室溫作用 化;PBST洗涂3次，每孔20化L，每次5min，每孔加入10化L辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠 IgG (PBST 1:600稀釋），常溫作用30min; PBST洗涂3次，每孔200yL，每次5min，0PD顯色，37 °C避 光顯色15min，再加入終止液終止反應。
[0045] 經(jīng)抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，實驗結果顯示制備的單克隆抗體中，26E9C2株雜交 瘤細胞所產(chǎn)生抗體為IgGl型。
[0046] 4.雜交瘤細胞染色體數(shù)的鑒定
[0047] 采用秋水仙素法進行染色體數(shù)鑒定。選生長旺盛的雜交瘤細胞26E9C2和SP2/0細 胞傳代培養(yǎng)，4化后往細胞培養(yǎng)瓶加入終濃度為0.化g/mL的秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)化后用吸管 將細胞吹落轉移到離屯、管中，1000巧m離屯、15min，棄上清;加入37°C預熱的0.075mol/L KC1 溶液5mL，混勻后37°C水浴作用25min;往細胞懸液中加入新鮮配制的固定液(冰醋酸：甲醇 =1:3) 1血，混勻后1000巧m離屯、15min，棄上清;加入5mL固定液使細胞懸浮，輕輕混勻，室溫 靜置40min，1000巧m離屯、15min，棄上清，重復此步驟依次;加入固定液5mL，使細胞懸浮并混 勻，封好管日，置4°C冰箱過夜；WlOOOrpm離屯、15min，吸去上清液，保留微量固定液與細胞 混勻后滴于預冷玻片，待其自然干燥，Giemsa染色液染色15min，清水沖洗后放置室溫自然 干燥。油鏡下進行觀察，進行染色體記數(shù)分析。結果如圖3所示。
[0048] 5.單克隆抗體的特異性試驗
[0049] W間接免疫巧光法測定雜交瘤細胞株26E9C2培養(yǎng)上清液與接種SAV、傳染性造血 器官壞死病病毒（IHNV)、傳染性膜腺壞死病病毒（IPNV)的細胞的反應性。接種SAV、傳染性 造血器官壞死病病毒（IHNV)、傳染性膜腺壞死病病毒（IPNV)的細胞作為抗原，雜交瘤細胞 株26E9C2培養(yǎng)上清液作為一抗，同時取小鼠陰性血清作陰性對照。在免疫巧光顯微鏡下觀 察結果。
[0050] 結果顯示，26E9C2與SAV反應產(chǎn)生特異的綠色巧光，而與其他病毒不產(chǎn)生特異的綠 色巧光，說明雜交瘤細胞株26E9C2所分泌單抗能特異性識別SAV，而與IHNP、IPNV不發(fā)生交 叉反應。
[0051 ] 6.雜交瘤細胞分泌單抗的穩(wěn)定性測定
[0052] 將獲得的陽性雜交瘤細胞株26E9C2連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月，收集細胞培養(yǎng)上清液，再 將細胞株進行凍存及復蘇，將凍存前后的細胞培養(yǎng)上清液W間接化ISA方法檢測抗體效價， W評價其分泌抗體的穩(wěn)定性。
[0053] 結果顯示，凍存前后0D490nm值相差較小，且明顯高于SP2/0對照，說明雜交瘤細胞 分泌單抗的性能較為穩(wěn)定(表1)。
[0054] 表1雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性鑒定結果
[0化5]
[0化6] 7.腹水的誘生
[0057] 取6~8周齡雌性Balb/C小鼠，腹腔內注射無菌的液體石蠟0.5ml/只；1周后，腹腔 內注射陽性雜交瘤細胞26E9C2;接種雜交瘤細胞后7~10天，見小鼠腹部明顯膨大，抽腹水， 離屯、后收集上清，-80°C凍存?zhèn)溆?。W純化的重組pProEX化a-El蛋白為檢測抗原，采用間接 ELISA方法測定腹水效價，同時設立SP2/0細胞陰性對照，WP/N>2.0的抗體最大稀釋倍數(shù) 作為相應效價值。腹水效價為1: 1〇5。
[0058] 實施例3抗娃魚甲病毒E1基因高保守區(qū)蛋白的單克隆抗體的應用
[0059] W純化的抗SAV E1重組蛋白多抗作為包被抗體，單克隆抗體26E9C2作為檢測抗 體，進行了雙抗體夾屯、化ISA方法檢測娃魚甲病毒。對多克隆抗體利用辛酸-飽和硫酸錠法 進行了抗體的純化，純化后的多抗?jié)舛葹?.07mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈 區(qū)帶明顯，純度為100%。通過將純化后的多抗和26E9C2細胞上清經(jīng)方陣法確定26E9C2單抗 最佳工作濃度為1.31yg/mL( 1:200)，兔抗SAVE1多抗的最佳工作濃度為1.26yg/mL( 1:800)， 建立的方法其最低SAV檢出量為1.41ug/mLDW〇D490皿>0.170949作為陽性判定標準。該檢 測方法與SVCV、IPNV、VHSV和IHNV無交叉反應，多次重復性試驗穩(wěn)定性較好。
【主權項】
1. 一株能夠穩(wěn)定分泌抗鮭魚甲病毒El基因高保守區(qū)蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株， 命名為26E9C2,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為 CGMCC No.12289。2. -種抗鮭魚甲病毒El基因高保守區(qū)蛋白單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體 由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生。3. 權利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測鮭魚甲病毒試劑中的用途。4. 一種用于檢測鮭魚甲病毒的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于含有權利要 求2所述的單克隆抗體。5. 如權利要求4所述的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于還含有抗SAV E1重組 蛋白的多克隆抗體。6. 如權利要求5所述的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述的單克隆抗體作 為檢測抗體，工作濃度為1.3 lyg/mL，所述的多克隆抗體作為包被抗體，工作濃度為1.26yg/ mL〇7. 權利要求4-6任一項所述的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒在制備檢測鮭魚甲病毒試 劑中的用途。
【文檔編號】G01N33/569GK106011075SQ201610348833
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】劉敏, 李經(jīng), 李一經(jīng), 唐麗杰, 徐義剛, 喬薪瑗, 蔣燁, 高帥
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學