一種高熒光強(qiáng)度微球及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微球的制備方法，尤其涉及一種高熒光強(qiáng)度微球的制備方法，屬于納米生物材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]基于熒光編碼微球的懸浮微陣列技術(shù)具有對(duì)同一種樣品中的多種蛋白、細(xì)胞因子等進(jìn)行同時(shí)篩選和定量的能力，在疾病診斷領(lǐng)域具有很高的研究和應(yīng)用價(jià)值。懸浮微陣列技術(shù)的核心技術(shù)是在檢測(cè)過程具有獨(dú)特標(biāo)記信號(hào)的編碼微球，該微球可以通過有機(jī)熒光基團(tuán)、拉曼探針、或者量子點(diǎn)納米晶等發(fā)光材料標(biāo)記獲得。相比其他發(fā)光材料，量子點(diǎn)因具有寬激發(fā)譜、窄發(fā)射譜、發(fā)射波長(zhǎng)可通過尺寸調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是理想的熒光編碼材料。因此，自從Nie等(Nature B1technology, 2001, 19, 631-635)首先提出以量子點(diǎn)為原料制備多色編碼微球以來，應(yīng)用于多指標(biāo)檢測(cè)體系，基于量子點(diǎn)進(jìn)行多色編碼的概念得到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。
[0003]為了將量子點(diǎn)微球應(yīng)用于高通量的多指標(biāo)檢測(cè)體系，大量的研究都集中到如何將量子點(diǎn)裝載入微球內(nèi)部，從而獲得高熒光強(qiáng)度、尺寸均一、表面功能化、生物相容性良好的量子點(diǎn)編碼微球。目前制備量子點(diǎn)編碼微球的方法主要有三種:
[0004]—、通過溶脹法直接將量子點(diǎn)包埋于聚合物微球中。Nie等(NatureB1technology，2001, 19，631-635)首先利用溶脹法制備多色量子點(diǎn)微球，證明其可應(yīng)用于生物檢測(cè)，但該種方法制備得到的熒光微球量子點(diǎn)裝載數(shù)量有限，熒光強(qiáng)度低，不能實(shí)現(xiàn)高通量的多指標(biāo)檢測(cè)。為了提高量子點(diǎn)編碼微球性能，Gao和Ni e (Ana1.Chem.2004, 76, 406-2410)利用15 μm的介孔聚苯乙烯微球?yàn)榛|(zhì)，合成了尺寸均一、高熒光強(qiáng)度的量子點(diǎn)微球，該多孔微球相比于無孔微球，微球內(nèi)部裝載的量子點(diǎn)數(shù)量大，其熒光強(qiáng)度提高了近1000倍。然而，由于該溶脹法采用氯仿/正丁醇作為混合溶劑進(jìn)行溶脹與裝載，而正丁醇會(huì)影響量子點(diǎn)的表面結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其熒光淬滅，因此采用該方法制備得到的熒光微球內(nèi)部的量子點(diǎn)的熒光性能會(huì)受到影響，得到的微球總體熒光強(qiáng)度與熒光編碼能力仍無法滿足多指標(biāo)檢測(cè)的編碼需求。最近，Wang等(Iangmuir 2012，28，6141-6150)發(fā)展了一種溶脹-蒸發(fā)法，通過在微球溶脹裝載量子點(diǎn)的過程中不斷蒸發(fā)氯仿來提高溶脹溶劑中量子點(diǎn)濃度，以此為推動(dòng)力使量子點(diǎn)更有利于擴(kuò)散進(jìn)入微球孔道，避免使用傳統(tǒng)溶脹法中正丁醇等不良溶劑對(duì)量子點(diǎn)表面結(jié)構(gòu)的破壞，從而獲得高熒光強(qiáng)度的量子點(diǎn)微球。但是由于蒸發(fā)氯仿的過程難控制，極易引起量子點(diǎn)自身團(tuán)聚粘附于微球表面，最終獲得的熒光微球的焚光均一"性變差。
[0005]二、在微球合成過程中通過化學(xué)接枝或者包埋法裝載量子點(diǎn)，其中包括種子生長(zhǎng)法與微乳液聚合法。前者是以聚合物微球?yàn)榉N子，加入單體、引發(fā)劑以及量子點(diǎn)在種子表面進(jìn)行聚合反應(yīng)，Bawendi等(Langmuir 2006, 22:3782 - 3790)通過在乙醇相中聚合制備得單色量子點(diǎn)微球，量子點(diǎn)能夠均勻分布于微球內(nèi)部，但聚合獲得的微球尺寸不均一，且不能有效控制量子點(diǎn)的裝載數(shù)量，因此認(rèn)為該法不適合制備編碼微球。Joumaa等(Langmuir2006，22，1810-1816)采用微乳液聚合法雖然能夠保證量子點(diǎn)在微球內(nèi)部分布，但由于量子點(diǎn)與聚苯乙烯在制備過程兩相分離，透射電鏡結(jié)果顯示量子點(diǎn)在微球內(nèi)部成團(tuán)聚狀分布，影響微球的熒光強(qiáng)度與均一性。
[0006]三、通過層層自組裝的方法在微球表面包覆量子點(diǎn)。Rogach等(Colloids andSurfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 163 (2009): 39 - 44)通過利用相反電荷間的靜電作用，將水溶性量子點(diǎn)CdTe包覆于聚合物微球表面，Pang等(Anal.Chem.2013,85, 11929-11935)以聚苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米微球?yàn)槟０澹ㄟ^層層自組裝的方法將熒光量子點(diǎn)與磁性納米氧化鐵顆粒組裝到微球表面，通過在包覆過程中調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的種類以及兩種納米粒子的包覆量，來制備不同熒光發(fā)射和磁響應(yīng)性的雙編碼微球。但水溶性量子點(diǎn)相比油溶性量子點(diǎn)，其量子產(chǎn)率低，且層層自組裝法的制備過程復(fù)雜，不易獲得具有高熒光強(qiáng)度的量子點(diǎn)熒光微球。
[0007]因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于開發(fā)一種高熒光強(qiáng)度微球及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高熒光強(qiáng)度微球的制備方法。將油溶性量子點(diǎn)與高分子介孔微球分散于氯仿，以馬來酸酐共聚物為表面活性介導(dǎo)分子，加入堿性水溶液或胺類化合物，使油溶性量子點(diǎn)進(jìn)入高分子介孔微球的孔道內(nèi)部，從而獲得高熒光強(qiáng)度的微球。本發(fā)明制備的熒光微球的熒光強(qiáng)度比現(xiàn)有溶脹方法制得的微球熒光強(qiáng)度提高至少10倍以上，且微球表面具有豐富的功能基團(tuán)，更有利于其在下游生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0009]進(jìn)一步地，所述高分子介孔微球?yàn)榫郾揭蚁〗榭孜⑶?，粒徑為I?100 μ m，優(yōu)選粒徑為3-10 μ m ;微球的介孔孔徑為10_50nm，優(yōu)選為30_40nm。
[0010]進(jìn)一步地，本發(fā)明中所述的馬來酸酐聚合物包括均聚物或者共聚物，包括兩個(gè)單元形成的聚合物，還包括三個(gè)或多個(gè)單體單元形成的聚合物，聚合物可以是交替、無規(guī)嵌段和接枝共聚物，優(yōu)選疏水性馬來酸酐無規(guī)聚合物。具體包括但不限于:聚馬來酸酐或其任意的高級(jí)脂肪類聚合物或芳香類聚合物，如聚馬來酸酐十八醇酯、聚馬來酸酐十六醇酯、聚馬來酸酐十四醇酯、聚馬來酸酐十八醇醚、聚馬來酸酐十六醇醚和聚馬來酸酐十四醇醚、聚馬來酸酐十八碳烯、聚馬來酸酐十六碳烯、聚馬來酸酐十四碳烯、聚(乙烯-alt-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-alt-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-Co-馬來酸酐)、聚(乙烯基甲醚-alt-馬來酸酐)、聚(異丁稀-alt-馬來酸酐)、聚(乙稀-Co-乙酸乙稀酯)-graft-馬來酸酐。
[0011]進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的胺類化合物包括分子鏈中含有伯胺、仲胺、叔胺中任意一種或多種的胺類化合物，具體包括但不限于:水合氨、氨基烷烴如2-氨基己烷；氨基硅烷如3-氨基三甲氧基硅烷；氨基醇類如氨基乙醇；氨基酸類如3-氨基丁酸；烷胺類如乙胺、丁胺、乙醇胺；亞胺類如聚乙烯亞胺、馬來酰亞胺。
[0012]進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的量子點(diǎn)為球形或類球形，是由半導(dǎo)體材料(通常由IIB?VIA或IIIA?VA元素組成)制成的、粒徑在2?20nm的納米粒子。優(yōu)選粒徑在2?6nm的納米粒子，如包括含鎘的油溶性納米晶CdS、CdSe, CdTe ;不含鎘的油溶性納米晶InP、CuInS ;含鎘的油溶性核殼結(jié)構(gòu)納米晶CdSSe/ZnS、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS ;不含鎘的油溶性核殼結(jié)構(gòu)納米晶InP/ZnS、CuInS/ZnS。
[0013]進(jìn)一步地，本方法具體包括以下步驟:
[0014]a)準(zhǔn)備聚苯乙稀介孔微球；
[0015]b)配制溶液；
[0016]c)制備量子點(diǎn)分散液；
[0017]d)制備高熒光強(qiáng)度的聚苯乙烯介孔微球。
[0018]進(jìn)一步地，所述步驟(a)具體為:將聚苯乙烯介孔微球加入離心管中，聚苯乙烯介孔微球的質(zhì)量與離心管的體積比為:1:2-5: lmg/mL。
[0019]進(jìn)一步地，所述步驟(b)所述的溶液包括馬來酸酐共聚物溶液，配制方法為:稱取馬來酸酐共聚物，分散于氯仿中，超聲溶解，其中馬來酸酐共聚物的質(zhì)量與氯仿的體積比為:20:1-80: lmg/mL，超聲頻率為 80-500W。
[0020]進(jìn)一步地，所述步驟(b)所述的溶液還包括堿性水溶液A、堿性水溶液B、3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES或3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液，配制方法為:
[0021 ] 堿性水溶液A:將氫氧化鈉溶于水，配制成0.5mM-50mM濃度的氫氧化鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH范圍在10?12 ;
[0022]堿性水溶液B:將聚乙烯亞胺(PEI)溶于水，聚乙烯亞胺水溶液的濃度為:0.5_80mg/mL，,調(diào)節(jié) pH 范圍在 9 ?12 ;
[0023]3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES溶液配制方法:取30 μ L APTES，加入170 μ L氯仿，充分溶解得到APTES氯仿溶液；
[0024]3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS溶液配制方法:取30 yL APTMS，加入170 yL氯仿，充分溶解得到APTMS氯仿溶液。
[0025]進(jìn)一步地，所述步驟(C)具體為:取30 μ M的CdSe/ZnS正己烷分散液10-200 μ L于離心管中，加入20-500 yL乙醇，將CdSe/ZnS乙醇混合液離心，離心后棄去上清液，得到沉淀，沉淀為量子點(diǎn)顆粒，室溫敞口放置離心所得沉淀lOmin，揮發(fā)去表面殘余的乙醇溶劑，再將所得沉淀重新分散于20-100 μ L氯仿中，超聲分散，得到量子點(diǎn)分散液，離心轉(zhuǎn)速為:5000-10000rpm,離心時(shí)間為3_5min ;超聲功率為80-500W，時(shí)間為2?3分鐘。
[0026]進(jìn)一步地，所述步驟(d)包括以下步驟:
[0027]I)將步驟(c)中獲得的量子點(diǎn)分散