專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)和分離磷酸化分子的組合物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和分離磷酸化靶分子的金屬螯合組合物及方法。本發(fā)明已應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、高通量篩選和診斷學(xué)等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磷酸化和去磷酸化是將磷酸根基團(tuán)加成到靶分子及將磷酸根基團(tuán)從靶分子上去除的過(guò)程，其中靶分子通常為蛋白質(zhì)?？赡媪姿峄^(guò)程是細(xì)胞調(diào)控的主要特征，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞骨架調(diào)控和細(xì)胞凋亡，參見(jiàn)(例如)PROTEINPHOSPHORYLATION(Marks F.ed.，1996)；Hunter之“Signaling-2000 and beyond，”(Cell100113-127(2000))。主要有兩類(lèi)酶(激酶和磷酸酶)用來(lái)調(diào)節(jié)可逆蛋白質(zhì)磷酸化，分別將磷酸根基團(tuán)加成到分子上及從分子上去除磷酸根基團(tuán)。磷酸化反應(yīng)是蛋白質(zhì)功能的主要特征，因此，如果完全明了蛋白質(zhì)組，則應(yīng)該能鑒別磷酸化蛋白質(zhì)。但是，迄今還沒(méi)有可對(duì)涉及細(xì)胞和組織調(diào)控線路的大量蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)平行性分析的實(shí)踐方法，參見(jiàn)Wilkins等人之Genetic Eng.Rev.1319(1995)。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是涉及對(duì)細(xì)胞調(diào)控至關(guān)重要的蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程的一個(gè)實(shí)例。當(dāng)細(xì)胞外刺激因子與其細(xì)胞表面識(shí)別受體結(jié)合后，通常由一組特定的細(xì)胞蛋白激酶啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些激酶隨后磷酸化靶分子，引起活性變化和對(duì)該信號(hào)的連續(xù)細(xì)胞應(yīng)答，參見(jiàn)(例如)Nishizuka之“Studies and perspectives of protein kinase C”(Science233305-312(1986))。對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)，僅僅鑒別一蛋白質(zhì)是否為磷酸化蛋白質(zhì)還不夠。鑒別蛋白質(zhì)上的磷酸化位點(diǎn)和確定磷酸化的化學(xué)計(jì)量比已成為研究人員的另一研究要點(diǎn)。在真核細(xì)胞中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的氨基酸殘基是最常見(jiàn)的磷酸化位點(diǎn)。參見(jiàn)(例如)Guy等人之“Analysis of Cellular Phosphoproteins by Two-DemensionalGel ElectrophoresisApplications for Cell Signaling in Normal and Cancer Cells”(Electrophoresis 15417-440(1994))。因此，在了解蛋白質(zhì)磷酸化現(xiàn)象方面，研究人員關(guān)注兩個(gè)層次。第一分析層次需要確定一種蛋白質(zhì)是否為磷蛋白，包括鑒別引起磷酸化的分子；第二分析層次需要鑒別哪一種氨基酸被磷酸化及多少氨基酸被磷酸化。本發(fā)明提供了用于所述兩個(gè)分析層次的材料和方法。本發(fā)明還提供了用于分析一些其它含磷酸根和硫代磷酸根的物質(zhì)(包括糖酯、核苷酸和脂類(lèi))的材料和方法。
目前，最常用的磷蛋白檢測(cè)方法是將32P或33P摻入到培養(yǎng)細(xì)胞中或通過(guò)蛋白激酶摻入到亞細(xì)胞部分中后進(jìn)行放射自顯影，參見(jiàn)(例如)Yan等人之“ProteinPhosphorylationTechnologies for the Identification of Phosphoamino Acids，”(J.Chromatogr.A.80823-41(1998))；Guy，G.，Phillip，R.和Tan，Y.之Electrophoresis15417-440(1994)。這些方法受到有限的生物材料范圍的制約，例如，組織培養(yǎng)樣品和臨床樣品分析要求對(duì)患者進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記，這是不可行的。在過(guò)去幾年內(nèi)已經(jīng)提出了放射標(biāo)記的若干種替代項(xiàng)。
磷蛋白也可通過(guò)免疫印跡和免疫沉淀來(lái)檢測(cè)，參見(jiàn)(例如)Soskic等人之“Functional Proteomics Analysis of Signal Transduction Pathwasys of the Platelet-DerivedGrowth Factor Beta Receptor”(Biochemistry.381757-1764(1999))；Watty等人之“TheIn Vitro and In Vivo Phosphotyrosine Map of Activated MuSK”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.974585-4590(2000))。免疫印跡最好是在用蛋白質(zhì)溶液封閉了固相載體上的未占用位點(diǎn)后進(jìn)行，因?yàn)檫@些位點(diǎn)會(huì)干擾微量化學(xué)分析。去除抗體和染色需要較為苛刻的處理(即，加熱至65℃，用0.1％SDS和1mM DTT培育)。這也會(huì)導(dǎo)致隨后使用蛋白質(zhì)定序和質(zhì)譜分析發(fā)生問(wèn)題。對(duì)于免疫沉淀而言，僅抗磷酸酪氨酸抗體顯示出足夠緊密以允許有效分離的結(jié)合。雖然抗磷酸酪氨酸的優(yōu)質(zhì)抗體可購(gòu)買(mǎi)到，但能夠特異性識(shí)別磷酸絲氨酸殘基和磷酸蘇氨酸殘基的抗體存在更多問(wèn)題，它們通常對(duì)相鄰的氨基酸序列很敏感。由于這些抗體和磷蛋白相互作用時(shí)存在潛在的空間位阻，因此這些抗體的可靠性受到質(zhì)疑。另外，當(dāng)用抗體檢測(cè)前沒(méi)有對(duì)磷蛋白進(jìn)行富集時(shí)，不相關(guān)蛋白與目標(biāo)蛋白共遷移現(xiàn)象的存在會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)。因此，用免疫印跡和免疫沉淀技術(shù)鑒別磷酸化蛋白質(zhì)實(shí)際上限于含有磷酸化酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)，參見(jiàn)上述McLachlin & Chait之文獻(xiàn)。
作為選擇，磷酸化蛋白質(zhì)可通過(guò)發(fā)色染料來(lái)鑒別，但成功率有限。陽(yáng)離子羰花青染料“全染色料(Stains-All)”(溴化1-乙基-2-[3-(3-乙基萘并[1，2d]噻唑啉-2-亞基)2-甲基丙烯基]-萘并[1，2d]噻唑鎓)可將DNA、RNA、磷蛋白和鈣結(jié)合蛋白質(zhì)染成藍(lán)色，而將非磷酸化蛋白質(zhì)染成紅色，參見(jiàn)(例如)Green等人之“DifferentialStaining of Phosphoproteins on Polyacrylamide Gels with a Cationic Carbocyanine Dye”(Anal.biochem.5643-51(1973))；Hegenauer等人之“Staining Acidic Phosphoproteins(Phosvitin)in Electrophoretic Gels”(Anal.Biochem.78308-311(1977))；Debruyne之“Staining of Alkali-Labile Phosphoproteins and Alkaline Phosphatases on PolyacrylamideGels”(Anal.Biochem.133110-115(1983))；“Staining of Phosphoproteins in Polyacrylamidegels with acridine orange”(Seikagaku 45327-35(1973))。全染色料因?yàn)樘禺愋圆詈挽`敏度低而通常不用于磷蛋白檢測(cè)。全染色料的靈敏度至少比常用的蛋白質(zhì)染色劑考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)低10倍，而與32P放射自顯影或本專(zhuān)利所述技術(shù)相比則其靈敏度低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。另一種發(fā)色方法，即GelCodeTM磷蛋白檢測(cè)試劑盒(PierceChemical公司，Rockfod，IL)，設(shè)計(jì)用于在凝膠中檢測(cè)磷蛋白；但這種方法有許多局限性。根據(jù)這種方法，磷蛋白在凝膠中通過(guò)堿水解絲氨酸或蘇氨酸的磷酸酯，用鈣離子沉淀釋放的無(wú)機(jī)磷酸根，形成一種不溶的磷鉬酸鹽絡(luò)合物，然后用諸如甲基綠、孔雀綠或羅丹明B(Rhodamine B)[如Cutting and Roth(1973)所述]等染料對(duì)其進(jìn)行染色來(lái)觀察。該染色方法的檢測(cè)靈敏度顯著低于考馬斯亮藍(lán)染色法(80到160納克含有大約100個(gè)磷酸絲氨酸殘基的卵黃高磷蛋白可用該市售試劑盒檢測(cè)出來(lái))。該方法的染色步驟相當(dāng)復(fù)雜(涉及七種不同的試劑)，并且堿水解要求將凝膠加熱至65℃，這會(huì)引起凝膠基質(zhì)較大程度的水解和膨脹。由于磷酸酪氨酸殘基不能通過(guò)堿處理來(lái)水解，因此，在這一氨基酸殘基位點(diǎn)磷酸化的蛋白質(zhì)就逃過(guò)了該方法的檢測(cè)。磷酸根選擇性熒光標(biāo)記染料(其中BODIPY染料共價(jià)結(jié)合于咪唑反應(yīng)基)已被開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)胃蛋白酶的磷酸化，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,512,486號(hào)；Wang及Giese之“Phosphate-SpecificFluorescence Lableling of Pepsin by BO-IMI”(Anal.Biochem.230329-332(1995))。
除了檢測(cè)磷蛋白外，還存在兩種通過(guò)對(duì)磷酸肽進(jìn)行化學(xué)衍生和富集而使磷酸肽從復(fù)雜混合物中分離出來(lái)的方法，參見(jiàn)(例如)Goshe等人之“PhosphoproteinIsotope-Coded Affinity Tag Approach For Isolating and Quantitating Phosphopeptides inProteome-Wide Analyses”(Anal.chem.732578-2586(2001))。第一種方法涉及以下步驟用過(guò)甲酸來(lái)氧化半胱氨酸殘基，通過(guò)堿水解來(lái)誘導(dǎo)來(lái)自磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸殘基的磷酸根基團(tuán)的β-消去反應(yīng)，乙二硫醇加成反應(yīng)，用生物素來(lái)偶聯(lián)所產(chǎn)生的游離巰基殘基，通過(guò)親和素親和色譜來(lái)純化磷蛋白，對(duì)洗脫的磷蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)水解消化，進(jìn)行第二輪親和純化，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析(Oda，Y.，Nagasu，T.及Chait，B.NatureBiotechnol.19379(2001))。第一種方法使用β-消去反應(yīng)去除磷酸根基團(tuán)，用一標(biāo)記來(lái)取代此等基團(tuán)，以生物素化硫醇基團(tuán)為例，其中多肽可隨后通過(guò)親和素樹(shù)脂色譜進(jìn)行分離。另一替代方法要求對(duì)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)水解消化，還原和烷基化半胱氨酸殘基，保護(hù)多肽N-末端和C-末端，通過(guò)碳二酰亞胺與胱胺縮合在磷酸化殘基部位形成磷酰胺化加成物，用與碘乙酸偶聯(lián)的玻璃珠捕獲磷酸肽，用三氟乙酸洗脫，并用質(zhì)譜分析來(lái)評(píng)估結(jié)果(Zhou等人之“A Systematic Approach to the Analysis of ProteinPhosphorylation”，Nat.Biotechnol.19375-378(2001))。這些方法費(fèi)時(shí)且需要純化磷酸肽，且能被分離的物質(zhì)很有限。兩種方法都可從試驗(yàn)蛋白質(zhì)β-酪蛋白中鑒別單磷酸化胰蛋白酶肽片斷，但兩種方法均不能檢測(cè)出四磷酸化肽片斷。
作為選擇，出現(xiàn)了一種將化學(xué)修飾同親和純化聯(lián)合的方法來(lái)定性蛋白質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸肽，其基于通過(guò)β-消去反應(yīng)/1，2-乙二硫醇加成反應(yīng)并隨后對(duì)經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行可逆生物素化而將磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸殘基轉(zhuǎn)換為S-(2-巰基乙基)半胱氨酰基或β-甲基-S-(2-巰基乙基)半胱氨?；鶜埢＝?jīng)胰蛋白酶消化后，經(jīng)生物素化的肽被親和分離和富集，接著用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC/MS/MS)對(duì)其進(jìn)行隨后的結(jié)構(gòu)鑒定，參見(jiàn)Adamczyk等人之“Selective Analysis of Phosphopeptides Within aProtein Mixture by Chemical Modification，Reversible Biotinylation and MassSpectrometry”(Rapid.Commun.Mass Spectrom.151481-1488(2001))。
熒光檢測(cè)方法的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)組學(xué)中球蛋白的定量分析提供了最好的解決方法。然而，目前還沒(méi)有令人滿意的方法來(lái)對(duì)復(fù)雜樣品中經(jīng)凝膠分離的磷蛋白進(jìn)行特異性和可逆的熒光檢測(cè)。通過(guò)用碘乙酸或過(guò)甲酸封閉游離巰基、磷酸根殘基的堿性β-消去反應(yīng)、乙二硫醇加成反應(yīng)以及使所產(chǎn)生的游離巰基與6-碘乙酰胺熒光劑發(fā)生反應(yīng)來(lái)對(duì)磷酸絲氨酸殘基進(jìn)行衍生和熒光團(tuán)標(biāo)記之方法已在毛細(xì)管電泳中使用激光激發(fā)熒光檢測(cè)得到了驗(yàn)證，且在蛋白質(zhì)微量測(cè)序膜中也進(jìn)行了相似的反應(yīng)。但是，沒(méi)有一種方法表明可適于直接在凝膠中檢測(cè)磷蛋白。該方法存在的一個(gè)問(wèn)題是，必須打破堿和乙二硫醇之間的微妙平衡，以此達(dá)成從絲氨酸殘基中消除磷酸根基團(tuán)并將乙二硫醇加成到所得的脫氫丙氨酸殘基上而不需水解肽骨架。
還可使用幾種基于儀器的方法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)磷酸化以及蛋白質(zhì)測(cè)序，例如31P-NMR、質(zhì)譜分析[參見(jiàn)例如Resing及Ahn之″Protein Phosphorylation Analysis byElectrospray lonization-Mass Spectrometery″，Methods Enzymol.28329-44(1997)；Aebersold和Goodlett之″Mass Spectrometry in Proteomics，″Chem.Rev.101269-295(2001).Affolter，M.，Watts，J.，Krebs，D.，和Aebersold，R.Anal.Biochem.22374(1994)；Liao，P.，Leykam，J.，Andrews，P.，Gage，D.及Allison，J.Anal.Biochem.2199(1994)；Oda，Y.，Huang，K.，Cross，F(xiàn).，Cowburn，D.和Chait，B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 966591(1999)]。質(zhì)譜分析已用于通過(guò)比較非磷酸化蛋白質(zhì)與磷酸化蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量來(lái)提供完整的磷酸化蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，參見(jiàn)(例如)McLachlin及Chait之″Analysis ofPhosphorylated Proteins and Peptides by Mass Spectrometry″(Current Opin.Chem.Biol.5591-602(2001))。這一方法的局限性在于研究人員必須純化一定量的兩種蛋白質(zhì)。雖然這些方法可精確定性蛋白質(zhì)和肽的磷酸化狀態(tài)，但其不適合用于高通量篩選磷酸化底物。這些技術(shù)通常是在用放射自顯影或用抗磷酸酪氨酸抗體免疫印跡鑒別磷蛋白后使用。盡管最近引入了多種方法通過(guò)對(duì)在富含14N和15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的細(xì)胞群進(jìn)行質(zhì)譜分析來(lái)直接定量?jī)煞N不同樣品中磷蛋白相對(duì)豐度，但已清楚地證明，這些方法的線性動(dòng)態(tài)范圍僅為10倍范圍。伴隨質(zhì)譜分析的離子抑制現(xiàn)象會(huì)妨礙使用這些技術(shù)對(duì)不同磷蛋白進(jìn)行化學(xué)計(jì)量比較。
為了分析分子上的磷酸化位點(diǎn)，需要對(duì)磷酸根結(jié)合位點(diǎn)和化學(xué)計(jì)量進(jìn)行更詳盡的分析，而此詳盡分析通常需要檢測(cè)目標(biāo)磷蛋白的肽片段。這些片段通常是由蛋白酶例如胰蛋白酶消化磷蛋白而產(chǎn)生的。然而，蛋白質(zhì)的蛋白酶解消化質(zhì)譜分析很少能全面覆蓋蛋白質(zhì)序列，且通常檢測(cè)不到目標(biāo)區(qū)域。另外，蛋白質(zhì)磷酸化通常具有亞化學(xué)計(jì)量比(sub-stoichiometric)，因此，磷蛋白的豐度低于來(lái)自目標(biāo)蛋白質(zhì)的其它肽。因此，在質(zhì)譜分析之前通過(guò)高度選擇性磷酸肽富集方法會(huì)極大改善對(duì)磷蛋白的鑒別和定性。此特別適用于使用不改變磷蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)和質(zhì)量的試劑來(lái)檢測(cè)磷蛋白。
目前，從復(fù)雜混合物中選擇性富集磷酸肽采用的是固定金屬親和色譜法，又稱(chēng)為IMAC。使用該技術(shù)時(shí)，金屬離子如Fe3+或Ga+3會(huì)在加入肽或蛋白質(zhì)復(fù)雜混合物之前先結(jié)合到螯合載體上，參見(jiàn)(例如)Posewitz及Tempst之″Immobilized Gallium(lll)Affinity Chromatography of Phosphopeptides″(Anal.Biochem.712883-2892(1999))。結(jié)合到管柱上的磷酸肽可使用高pH或磷酸鹽緩沖液釋放，但后者步驟中通常在質(zhì)譜分析之前需要一進(jìn)一步脫鹽步驟。含有亞胺基二乙酸螯合劑和氨三乙酸螯合劑的樹(shù)脂已為大家所熟知并有市售，參見(jiàn)(例如)Neville等人之″Evidence for Phosphorylation ofSerine 753 in CFTR Using a Novel Metal-Ion Affinity Resin and Matrix-Assisted LaserDesorption Mass Spectrometry″(Protein Sci.62436-2445(1997))。但是，使用當(dāng)前技術(shù)時(shí)存在幾個(gè)難題，包括未與管柱結(jié)合的磷酸肽(低親和力)的損失、隨后洗脫磷酸化肽的困難以及對(duì)固定金屬離子有親和性的非磷酸化肽本底(低特異性)。
已經(jīng)證實(shí)，可用基于質(zhì)譜分析的方法來(lái)檢測(cè)分離的肽，且可用介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化(MALDI)技術(shù)來(lái)直接分析結(jié)合到IMAC載體上的磷酸肽，參見(jiàn)Zhou等人之″Detection and Sequencing of Phosphopeptides Affinity Bound to Immobilized Metal IonBeads by Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization Mass Spectrometry″(J.Am.Soc.Mass.Spectrom.11273-283(2000))。為了檢測(cè)和分析磷酸肽，IMAC亦可直接與質(zhì)譜分析儀器在線連接，或與替代分離技術(shù)例如HPLC和毛細(xì)管電泳(CE)聯(lián)合。
本發(fā)明通過(guò)使用一陽(yáng)離子過(guò)渡金屬和一包含金屬螯合部分及一化學(xué)部分的化合物來(lái)檢測(cè)磷蛋白和磷酸肽而克服當(dāng)前方法的局限性，其中該化學(xué)部分通常為一反應(yīng)基團(tuán)或標(biāo)記(例如熒光團(tuán))或其一組合。有多種螯合部分皆使用聚羧酸根結(jié)合位點(diǎn)來(lái)選擇性結(jié)合單價(jià)和二價(jià)金屬陽(yáng)離子，且其通常用于熒光鈣離子指示劑中。這些指示劑的實(shí)例為quin-2(喹因-2)、fura-2(呋喃-2)、indo-1(吲哚-1)(美國(guó)專(zhuān)利第4,603,209號(hào))；fluo-3和rhod-2(羅丹-2)(美國(guó)專(zhuān)利第5,049,673號(hào))以及FURA REDTM(美國(guó)專(zhuān)利第4,849,362號(hào))。對(duì)鈣離子具有選擇性且以BAPTA為主的一族指示劑闡述于HAUGLAND之HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCHCHEMICALS(第九版，CD-ROM，2002年9月)中。以BAPTA為主的金屬螯合劑的實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利第5,773,227號(hào)、第5,453,517號(hào)、第5,516,911號(hào)、第5,501,980號(hào)、第6,162,931號(hào)和第5,459,276號(hào)中也有描述。
任意鈣濃度的指示劑皆基于鈣與熒光染料的選擇性結(jié)合。盡管已知BAPTA化合物可作為常用EGTA螯合劑的類(lèi)似物結(jié)合某些二價(jià)陽(yáng)離子例如鈣離子，但亦知BAPTA化合物可結(jié)合幾乎所有的無(wú)機(jī)多價(jià)陽(yáng)離子，且其親和力可高于或低于此化合物對(duì)鈣離子的親和力。它們對(duì)測(cè)量生物細(xì)胞中的鈣具有選擇性和有效性是因?yàn)樯锵到y(tǒng)中這些其它多價(jià)陽(yáng)離子全部缺失或豐度很低。以BAPTA為主的指示劑對(duì)多價(jià)陽(yáng)離子(包括鎵和對(duì)本發(fā)明有用的類(lèi)似金屬)的親和力和選擇性可以通過(guò)改變pH、溶劑組成、離子強(qiáng)度和其它實(shí)驗(yàn)變量來(lái)改進(jìn)。這種對(duì)陽(yáng)離子的選擇性和親和力的改變對(duì)本發(fā)明所揭示的各方面來(lái)說(shuō)都是至關(guān)重要的，包括檢測(cè)和分離磷酸化靶分子兩方面。
本發(fā)明克服了當(dāng)前揭示的一些用于鑒別、分離、分析和定量磷酸化蛋白質(zhì)的方法的局限性和缺點(diǎn)，因此提供了若干方法、化合物和組合物以緩解人們長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)快速高效的高通量檢測(cè)及為進(jìn)一步分析而分離磷蛋白的需要。本發(fā)明能精確鑒別包含少至一個(gè)磷酸根基團(tuán)的磷酸肽和磷蛋白，且所用方法簡(jiǎn)單，不需要多個(gè)步驟和對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。重要的是，已知本發(fā)明方法第一個(gè)提供了精確鑒別磷酸化蛋白質(zhì)組的手段，且允許定量識(shí)別增加的蛋白質(zhì)磷酸化。本發(fā)明是一種重要的用于鑒別蛋白質(zhì)組中的新穎磷酸化蛋白質(zhì)的工具。該技術(shù)具有最佳的定量分析特點(diǎn)，尤其當(dāng)與總蛋白檢測(cè)試劑聯(lián)合使用時(shí)。另外，如下所述，本發(fā)明的材料和方法并不限于檢測(cè)及/或分離磷酸化蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于特異性檢測(cè)、分離及/或定量磷酸化靶分子的磷酸根結(jié)合化合物和方法。在一溫和的酸性環(huán)境中且存在合適的金屬離子時(shí)，這些化合物將選擇性結(jié)合磷酸化靶分子上的磷酸根基團(tuán)以形成三元絡(luò)合物，這些靶分子可固定在例如凝膠中或吸附于固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上，或者溶解或懸浮于幾乎水性的溶液中。
磷酸根結(jié)合化合物的通式為(A)m(L)n(B)，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)。不受理論的約束，看來(lái)這些特定的磷酸根結(jié)合化合物的金屬螯合部分在反應(yīng)中同時(shí)會(huì)與三價(jià)金屬離子和靶分子上的磷酸根基團(tuán)結(jié)合形成三元絡(luò)合物。在這一方式中，金屬離子在磷酸根基團(tuán)和金屬螯合部分之間起橋梁作用，其中化學(xué)部分A通過(guò)離子作用有效結(jié)合于磷酸化靶分子上。因此，本發(fā)明的一必要條件是，金屬螯合部分在合適條件下與一種同時(shí)對(duì)磷酸化靶分子有親和力的金屬離子結(jié)合。
本發(fā)明組合物和方法的效用主要是化學(xué)部分A通過(guò)一連接體共價(jià)連接到金屬螯合部分以形成本發(fā)明磷酸根結(jié)合化合物的結(jié)果?；瘜W(xué)部分A通常是一種標(biāo)記物或一反應(yīng)基團(tuán)。
倘若為了達(dá)到檢測(cè)目的，A通常是一種可檢測(cè)的標(biāo)記物，其可為染料(包括著色劑、發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán))、半抗原、酶或放射性同位素，當(dāng)然屬于本發(fā)明范圍的更廣泛類(lèi)別的其它可檢測(cè)標(biāo)記物已為大家所熟知。倘若為了達(dá)到分離含磷酸根的靶分子之目的，A通常是一種標(biāo)記物或反應(yīng)基團(tuán)，其可與聚合物(例如瓊脂糖)、一表面、磁性顆?；蛭⑶蝮w結(jié)合。與金屬螯合部分及金屬離子結(jié)合在一起的聚合物被選擇用于與磷酸化靶分子結(jié)合形成可溶或不溶的三元絡(luò)合物。此等三元絡(luò)合物尤其可用于從復(fù)合混合物中選擇性分離磷酸化靶分子，或作為各種檢測(cè)方案的組成成分。在本發(fā)明的另一方面中，A是一種可改變?nèi)j(luò)合物溶解性的化學(xué)部分，或者可包含一胺-反應(yīng)基團(tuán)，以與含胺分子(包括聚合物及磷酸化靶分子)形成一共價(jià)鍵。
本發(fā)明的“結(jié)合液”(我們定義其包括真正的溶液、懸浮液、乳液、分散液和其固定化變型)包含一種其式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物、一種包含選定金屬離子的鹽及一種酸。較佳的鹽和金屬離子組成以及結(jié)合液或懸浮液的濃度在某種程度上要依化合物的金屬螯合部分而定。一種特別有用的結(jié)合液是磷酸根結(jié)合化合物中以BAPTA為主的螯合部分與鎵鹽的組合。意外地，我們已確定三價(jià)鎵離子僅在溫和的酸性環(huán)境存在時(shí)以有效的親和力同時(shí)結(jié)合BAPTA部分及磷酸化靶分子形成三元絡(luò)合物。但是，我們同時(shí)也證明了其它金屬螯合部分例如DTPA、IDA和菲咯啉(phenanthroline)可同時(shí)結(jié)合三價(jià)鎵離子和磷酸根基團(tuán)。因此，結(jié)合液的一個(gè)必要條件是存在一種酸，其中結(jié)合液的pH值較佳為大約3到大約6，此pH值通常為大約3到大約4。用來(lái)得到此pH值的酸的性質(zhì)看來(lái)似乎無(wú)關(guān)緊要；但不應(yīng)該用磷酸、膦酸或多磷酸來(lái)得到此pH值，因?yàn)樗鼈儠?huì)降低三元絡(luò)合物的穩(wěn)定性。磷酸根結(jié)合化合物在結(jié)合液或懸浮液中通常是游離的；但亦可將磷酸根結(jié)合化合物固定在一固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上，以便當(dāng)加入金屬離子及酸時(shí)可形成結(jié)合液，且如果樣品中存在磷酸化靶分子則隨后可形成本發(fā)明的三元絡(luò)合物。
本發(fā)明的方法包含用含有磷酸根結(jié)合化合物、金屬離子和酸的結(jié)合液來(lái)接觸樣品，將樣品及結(jié)合液培育足夠的時(shí)間以使結(jié)合液中的化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合，由此所述磷酸化靶分子形成一種三元絡(luò)合物。
為檢測(cè)目的，通常照射得到的包含該化合物的三元絡(luò)合物來(lái)測(cè)量化學(xué)部分A的可檢測(cè)光學(xué)性質(zhì)，由此可檢測(cè)到磷酸化靶分子是否存在。磷酸化靶分子可在溶液中或當(dāng)固定在固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的組合物和方法可用于檢測(cè)含磷酸化和非磷酸化靶分子的復(fù)合樣品中的磷酸化靶分子，或用于檢測(cè)靶分子上磷酸根基團(tuán)數(shù)目的變化。磷酸化程度的差異可由生物聚合物磷酸化程度的內(nèi)在差異(其可引起蛋白質(zhì)折疊差異)所致，或由體內(nèi)過(guò)程(例如疾病狀態(tài))或其與用來(lái)鑒別特異性激酶和磷酸酶的體外分析共同所致。
作為選擇，當(dāng)使用本發(fā)明方法從溶液中選擇性分離磷酸化靶分子時(shí)，可不必觀察絡(luò)合物。為分離磷酸化靶分子，可將三元絡(luò)合物沉淀、固定、通過(guò)色譜或電泳技術(shù)或通過(guò)磁場(chǎng)分離或仍保留在溶液中。在某些情況下，可使用有機(jī)萃取法將金屬螯合部分從磷酸化靶分子中分離出來(lái)。當(dāng)將三元絡(luò)合物沉淀或以其它方式固定時(shí)，磷酸化靶分子可通過(guò)親和色譜與樣品中的非磷酸化靶分子及其它組份分離，例如通過(guò)用水性洗液或有機(jī)洗液或水性/有機(jī)混合洗液簡(jiǎn)單地進(jìn)行洗滌。在某些情況下，當(dāng)萃取的磷酸化靶分子仍然固定在基質(zhì)上時(shí)有利于進(jìn)行進(jìn)一步分析。磷酸化靶分子的分離有利于對(duì)該等靶分子進(jìn)行進(jìn)一步分析，此分析例如可通過(guò)液相色譜/質(zhì)譜法、電泳分離技術(shù)、通過(guò)檢測(cè)結(jié)合抗體的靶分子(該抗體可以與靶分子的任何部分結(jié)合)、或通過(guò)各種其它技術(shù)來(lái)進(jìn)行。具體而言，由于磷酸化靶分子的分離可去除原始樣品中的干擾組份，故可簡(jiǎn)化對(duì)樣品的后續(xù)分析。


圖1所示為用包含氯化鎵及化合物2的結(jié)合液在聚丙烯酰胺凝膠中對(duì)磷酸化靶分子(卵白蛋白)(1A)進(jìn)行選擇性檢測(cè)的結(jié)果，與同樣的凝膠用總蛋白染色劑(1B)(SYPRORuby蛋白凝膠染色劑)染色后的結(jié)果比較(見(jiàn)實(shí)例2)。蛋白質(zhì)混合物以約500微克上樣，共含有9種蛋白質(zhì)，其中之一為含有兩個(gè)磷酸根基團(tuán)的磷蛋白(卵白蛋白)。本圖證明對(duì)照一由8種已知為非磷酸化蛋白質(zhì)構(gòu)成的經(jīng)非常低或未經(jīng)染色的本底可選擇性檢測(cè)出卵白蛋白。
圖2所示為用包含氯化鎵及化合物1的結(jié)合液在PVDF薄膜上對(duì)磷酸化靶分子(卵白蛋白)(2A)進(jìn)行選擇性檢測(cè)的結(jié)果與同樣的薄膜用總蛋白染色劑(2B)(SYPRORuby蛋白印跡染色劑)染色后的結(jié)果比較(見(jiàn)實(shí)例8)。本圖證明對(duì)照一含有5種非磷酸化蛋白質(zhì)的經(jīng)非常低或未經(jīng)染色的本底可選擇性檢測(cè)出卵白蛋白。
圖3所示為用包含氯化鎵及化合物2的結(jié)合液在凝膠中檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)的靈敏度和線性動(dòng)態(tài)范圍(見(jiàn)實(shí)例2)；圖(3A)是具有不同磷酸根基團(tuán)比率的5種蛋白質(zhì)的比較，圖(3B)是胃蛋白酶和牛血清白蛋白(BSA)的比較。蛋白質(zhì)以2倍稀釋系列自2納克至1000納克上樣于SDS聚丙烯酰胺微型凝膠；在四個(gè)相同的凝膠中對(duì)每一蛋白質(zhì)樣品系列進(jìn)行操作。磷蛋白為α-酪蛋白(7或8個(gè)磷酸根基團(tuán))、去磷酸化α-酪蛋白(1或2個(gè)磷酸根)、β-酪蛋白(5個(gè)磷酸根)、卵白蛋白(2個(gè)磷酸根)及胃蛋白酶(1個(gè)磷酸根)。BSA不含磷酸根，用作陰性對(duì)照。結(jié)果證明本發(fā)明的方法及結(jié)合液能檢測(cè)出低至1到2納克的五磷酸化蛋白質(zhì)(β-酪蛋白)及8納克的單磷酸化蛋白質(zhì)(胃蛋白酶)。
圖4所示為蛋白質(zhì)磷酸酶活性的檢測(cè)，其中α-酪蛋白和胃蛋白酶用作磷酸酶底物。將凝膠與包含氯化鎵及化合物2的結(jié)合液一起培育，結(jié)果證明在底物和蛋白質(zhì)磷酸酶一起培育后磷酸根基團(tuán)比對(duì)照減少，見(jiàn)實(shí)例6。
圖5所示為當(dāng)將肽溶液與包含氯化鎵及化合物5的結(jié)合液一起培育時(shí)磷酸肽(pT/pY及RII，分子量為1670和2193)(B圖和C圖)自含有非磷酸化肽(血管緊張素I和II，分子量為1297和1046)(A圖)的溶液中分離的結(jié)果。將混合物培育1小時(shí)并離心5分鐘。用MALDI-TOF質(zhì)譜法分析所得上清液(各圖中的下部圖譜)和塊狀沉淀物(各圖中的上部圖譜)。A圖所示為上清液中唯一存在的的非磷酸化肽，B和C圖所示為沉淀中純度大于95％的兩種磷酸肽。
圖6所示為從親和色譜基質(zhì)管柱上洗脫的磷酸化肽(α-酪蛋白)的分析，該基質(zhì)管柱包含具有鎵離子的化合物13或化合物14。圖A所示為純化的α-酪蛋白磷酸絲氨酸肽在去磷酸化(左側(cè)的一對(duì)峰)并接著用甲胺衍生后(右側(cè)的一對(duì)峰)的MALDI-TOFMS分析結(jié)果差異。結(jié)果顯示所有三種肽都是添加甲胺后產(chǎn)生的磷酸絲氨酸衍生物。圖A中的A及B受到單磷酸化(+31amu，甲胺)而C受到三磷酸化(+93amu，3個(gè)甲胺)。圖B所示為從BAPTA-瓊脂糖(化合物13或化合物14)管柱洗脫的磷酸肽與市售金屬親和色譜管柱(Pierce Chemical公司)洗脫的磷酸肽的MALDI-TOF MS圖。在所用條件下，BAPTA-瓊脂糖管柱顯示可以從復(fù)雜肽混合物中純化所有預(yù)期的磷酸肽(箭頭)。圖C所示為用強(qiáng)堿(-98amu)和甲胺處理后帶有一個(gè)磷酸蘇氨酸和一個(gè)磷酸酪氨酸殘基的對(duì)照肽(分子量＝1870)。結(jié)果證明在沒(méi)有隨后添加甲胺(+32amu)時(shí)只消除了一個(gè)單磷酸根(-98amu，來(lái)自蘇氨酸)，確證了單一的磷酸蘇氨酸殘基。磷酸酪氨酸在這些消除條件下因未受到修飾因而可測(cè)定出來(lái)。
圖7所示為水凝膠微陣列(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)上磷蛋白(β-酪蛋白)的檢測(cè)，其時(shí)該微陣列與包含化合物2及氯化鎵的結(jié)合液一起培育，見(jiàn)實(shí)例18。蛋白質(zhì)以2倍稀釋系列自166皮克至0.324皮克上樣于此微陣列上。結(jié)果證明可在水凝膠微陣列上檢測(cè)到0.65皮克的五磷酸化蛋白質(zhì)。
圖8所示為水凝膠微陣列(Perkin Elmer)上磷酸肽(pDISP)的檢測(cè)，其時(shí)該微陣列與包含化合物2及氯化鎵的結(jié)合液一起培育，見(jiàn)實(shí)例19。肽以2倍稀釋系列自12皮克至0.18皮克上樣于此微陣列上。結(jié)果證明可在水凝膠微陣列上檢測(cè)到少至300飛克的單磷酸化肽。
圖9所示為蛋白質(zhì)激酶活性(9ACaMPKII及9BAbI酪氨酸激酶)的檢測(cè)，其通過(guò)檢測(cè)在水凝膠微陣列(Perkin Elmer)上磷酸化的肽來(lái)進(jìn)行，其時(shí)該微陣列與包含化合物2及氯化鎵的結(jié)合液一起培育，見(jiàn)實(shí)例20和實(shí)例21。檢測(cè)肽糖原合成酶1-10以證明CaMPKII激酶的活性，檢測(cè)肽AbI以證明AbI酪氨酸激酶的活性。
圖10所示為通過(guò)比較偏振值來(lái)檢測(cè)磷蛋白(10A)和磷酸肽(10B)，其通過(guò)單獨(dú)用結(jié)合液及使用含磷酸化及非磷酸化蛋白質(zhì)或肽、卵白蛋白及δ睡眠誘導(dǎo)肽的結(jié)合液來(lái)進(jìn)行，見(jiàn)實(shí)例14。結(jié)果證明單獨(dú)使用結(jié)合液和使用含非磷酸化蛋白質(zhì)或肽的結(jié)合液時(shí)其熒光偏振和各向異性都很相似。但當(dāng)結(jié)合液中存在磷蛋白或磷酸肽時(shí)熒光偏振值顯著增加。這一結(jié)果證明磷蛋白和磷酸肽在溶液中可選擇性地與化合物2-Ga3+絡(luò)合物結(jié)合，而不是與非磷酸化蛋白質(zhì)或肽結(jié)合。
圖11所示為用本發(fā)明結(jié)合液和SYPRORuby蛋白凝膠染色劑標(biāo)記的蛋白質(zhì)的參比分析，證明了非特異性染色和低豐度磷蛋白可與非磷酸化蛋白質(zhì)區(qū)分，見(jiàn)實(shí)例22。用聚丙烯酰胺凝膠分離含有磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的混合物，磷蛋白用包含化合物2及氯化鎵的結(jié)合液檢測(cè)。當(dāng)用SYPRORuby蛋白凝膠染色劑染色后可檢測(cè)到所有蛋白質(zhì)。圖11A)所示為磷酸化蛋白質(zhì)的三元絡(luò)合物與總蛋白的熒光強(qiáng)度比率。圖11B)所示為磷酸化蛋白質(zhì)絡(luò)合物及總蛋白的熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度所繪制的曲線，得到一恒定的Y截距值。圖11C)所示為當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖時(shí)Y截距值的比率，得到的磷蛋白比率值較非磷酸化蛋白質(zhì)的比率值要大50到100倍。
具體實(shí)施例方式
I.定義在詳細(xì)闡述本發(fā)明之前，應(yīng)理解的是，本發(fā)明并不局限于具體的組合物或方法步驟，而是可改變的。應(yīng)注意的是，本說(shuō)明書(shū)和隨附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”亦包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有明確規(guī)定。因此，例如，提及“一種磷酸化蛋白質(zhì)”包括多種蛋白質(zhì)，提及“一種化合物”包括多種化合物，如此等等。
除非另外定義，否則，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與熟習(xí)本項(xiàng)技術(shù)者通常理解的意義相同。下列術(shù)語(yǔ)是為闡釋本發(fā)明的目的而定義的。
本文所用術(shù)語(yǔ)“親和力”指兩分子間結(jié)合作用的強(qiáng)度，例如金屬螯合物和金屬離子之間。
本文所用術(shù)語(yǔ)“烷基”指含1到20個(gè)碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴鏈，其通常含約1到約10個(gè)碳原子(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、環(huán)丁基、金剛烷基、降金剛烷基(noradamantyl)等等)，此等烴鏈通過(guò)碳原子連接到化合物上。具有8個(gè)或更少碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀烴鏈在本文中亦稱(chēng)為“低烷基”。這些烴鏈可以是飽和的或者包括一或多個(gè)不飽和鍵，即具有一或多個(gè)雙鍵或三鍵。
本文所用術(shù)語(yǔ)“氨基”或“胺基”指基團(tuán)-NR′R″(或NRR′R″)，其中R、R′及R″各獨(dú)立選自由氫、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、雜芳基和取代雜芳基組成之群。取代胺是胺基，其中R′或R″不為氫。在伯胺基中，R′和R″兩者都是氫，而在仲胺基中R′或R″中只有一個(gè)(而不是兩個(gè))是氫。另外，術(shù)語(yǔ)“胺”及“氨基”可包括氮的質(zhì)子化和季銨化形式，其包含基團(tuán)-NRR′R″及其生物學(xué)上相容的陰離子反荷離子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“芳基”指具有20或更少碳原子的芳香環(huán)碳鏈，例如，苯基、萘基、聯(lián)苯基和蒽基。芳基中的一或多個(gè)碳原子亦可被例如烷基、芳基、雜芳基、鹵素、硝基、氰基、羥基、烷氧基或芳氧基等取代。
本文所用術(shù)語(yǔ)“水性溶液”指其中主要是水并保持水的溶液特性的一種溶液。倘使水性溶液中含有除水之外的溶劑，則通常水是主要溶劑。
本文所用術(shù)語(yǔ)“BAPTA”指一種金屬螯合化合物，其為1，2-二(2-胺基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸或其類(lèi)似物、衍生物、稠環(huán)變體和共軛體及其所有的金屬或非金屬鹽、亞鹽及其水合物，包括美國(guó)專(zhuān)利第4,603,209號(hào)、第4,849,362號(hào)、第5,049,673號(hào)、第5,453,517號(hào)、第5,459,276號(hào)、第5,516,911號(hào)、第5,501,980號(hào)、第6,162,931號(hào)及第5,773,227號(hào)(如上述)中揭示的任何相應(yīng)化合物。一般在使用時(shí)，“BAPTA”指通過(guò)以氧原子為終止的C1到C3烴鍵橋連接的兩個(gè)苯環(huán)，這些橋基包括亞甲基二氧基(-OCH2O-)、亞乙基二氧基(-OCH2CH2O-)或亞丙基二氧基(-OCH2CH2CH2O-)，其中的每個(gè)苯環(huán)視需要可經(jīng)一或多個(gè)取代基取代，以調(diào)整該化合物的金屬離子結(jié)合親和力、溶解性、化學(xué)反應(yīng)性、光譜特性或其它物理特性。在本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，“BAPTA”共價(jià)連接于一化學(xué)部分A上，該化學(xué)部分A與一合適的三價(jià)金屬離子和一種酸結(jié)合后可對(duì)作為三元絡(luò)合物的磷酸化靶分子進(jìn)行檢測(cè)和分離。BAPTA衍生物還包括其中BAPTA結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)被其它芳香環(huán)或雜芳環(huán)取代或與其它芳香環(huán)或雜芳環(huán)形成稠環(huán)的化合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物素”指任何生物素衍生物，包括但不限于經(jīng)取代和未經(jīng)取代的生物素、及其類(lèi)似物和衍生物，以及己酰胺生物素、生物胞素、脫硫生物素、脫硫生物胞素、亞胺基生物素和磺化生物素的經(jīng)取代和未經(jīng)取代衍生物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物素結(jié)合蛋白質(zhì)”指任何選擇性結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)，包括但不限于生物素抗體、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的親和素、及其類(lèi)似物和衍生物、以及抗體、鏈霉親和素、鐵蛋白親和素、硝化親和素、硝化鏈霉親和素及NeutravidinTM親和素(一種等電點(diǎn)接近中性的脫糖化修飾親和素)的經(jīng)取代和未經(jīng)取代衍生物及其經(jīng)染料、酶或聚合物修飾的變型和生物素結(jié)合蛋白質(zhì)的固定化形式。
本文所用術(shù)語(yǔ)“緩沖液”指一種其作用為將因添加或減少化學(xué)物質(zhì)而引起的溶液酸堿度的變化減小到最低程度的體系。
本文所用術(shù)語(yǔ)“羰基”指官能團(tuán)-(C＝O)-。但是要認(rèn)識(shí)到該基團(tuán)可以被其它熟知的與羰基具有相似電子及/或空間特性的基團(tuán)取代，如硫代羰基(-(C＝S)-)、亞磺酰基(-S(O)-)、磺酰基(-SO2)-)、膦?；?-PO2-)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“羧基”(″carboxy″或″carboxyl″)指基團(tuán)-R′(COOR13)，其中R′為烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、雜芳基或取代雜芳基。R13為氫或一種鹽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“化學(xué)部分A”或“化學(xué)部分”指一共價(jià)連接于具有式(A)m(L)n(B)的金屬螯合化合物上以形成本發(fā)明之磷酸根結(jié)合化合物的部分?！盎瘜W(xué)部分A”包括一種如下定義的標(biāo)記物，即一種便于檢測(cè)和分離磷酸化靶分子的可檢測(cè)部分。術(shù)語(yǔ)“化學(xué)部分A”為一種天然或合成部分，其通常是一種標(biāo)記物，但也可以(并不限于)是一種反應(yīng)基團(tuán)，其通常為胺反應(yīng)基，如琥珀酸亞胺酯，該基團(tuán)的功能是通過(guò)共價(jià)鍵使一種聚合物(包括瓊脂糖)、丙烯酰胺、微粒子、蛋白質(zhì)(例如抗體或抗原)、磷酸化靶分子及配體以及那些熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的物質(zhì)與本發(fā)明之磷酸根結(jié)合化合物結(jié)合。另外，化學(xué)部分A也可以是本發(fā)明的一金屬螯合部分，通常，一金屬螯合部分將通過(guò)一反應(yīng)基團(tuán)連接到本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物上(共軛反應(yīng))，但是，當(dāng)未使用其中的反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，該金屬螯合部分可通過(guò)一連接體共價(jià)結(jié)合于本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物上。
本文所用術(shù)語(yǔ)“絡(luò)合物”指兩或多個(gè)分子與(例如)金屬離子螯合劑及絡(luò)合有(即非共價(jià)鍵結(jié)合)蛋白質(zhì)的金屬離子的結(jié)合體，或者指(例如)抗體與抗原、酶與酶底物、配體與受體(例如生物素與親和素)、核酸與其互補(bǔ)鏈、一種蛋白質(zhì)與另外一種蛋白質(zhì)或與對(duì)此第一種蛋白質(zhì)有親和力的核酸、及諸如此類(lèi)的結(jié)合體，其通常皆通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合。
本文所用術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)響應(yīng)”指一可通過(guò)觀察或者儀器直接或間接檢測(cè)到的信號(hào)發(fā)生或變化?？蓹z測(cè)響應(yīng)通常是一種光學(xué)響應(yīng)，其會(huì)導(dǎo)致波長(zhǎng)分布形式或者吸收或熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，或者會(huì)導(dǎo)致光散射、熒光壽命、熒光偏振或這些參數(shù)之組合發(fā)生變化?；蛘撸蓹z測(cè)響應(yīng)是一信號(hào)的發(fā)生，其中染料本身可發(fā)出熒光且當(dāng)染料與金屬離子或磷酸化靶分子結(jié)合時(shí)不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)變化?；蛘?，可檢測(cè)響應(yīng)是一種因形成本發(fā)明三元絡(luò)合物(包含磷酸化靶分子)而使可檢測(cè)標(biāo)記物空間定位于一樣品集合物(例如在凝膠中、印跡上或陣列上、在微孔板孔內(nèi)、在微流室內(nèi)或在微粒上)所產(chǎn)生的信號(hào)結(jié)果(例如顏色、熒光、放射性或另一物理特性)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“可直接檢測(cè)”指可檢測(cè)標(biāo)記物或自可檢測(cè)標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)的存在可通過(guò)觀察、儀器或膠片立即檢測(cè)到，而不需要化學(xué)修飾或添加物質(zhì)。例如，熒光團(tuán)即會(huì)產(chǎn)生可直接檢測(cè)的響應(yīng)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“DTPA”指一金屬螯合部分二亞乙基三胺五乙酸或其衍生物及美國(guó)專(zhuān)利第4,978,763號(hào)和第4,647,447號(hào)揭示的任何相應(yīng)部分。DTPA以式(CH2CO2R13)ZN[(CH2)3N(CH2CO2R13)T(CH2)SN(CH2CO2R13)Z來(lái)表示，其中連接體連接至次甲基碳原子或氮原子上，Z為1或2，S為1到5，T為0到4，R13為氫或一種鹽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“染料”指一類(lèi)可發(fā)光以產(chǎn)生可觀察的可檢測(cè)信號(hào)的化合物?！叭玖稀卑晒夂头菬晒饣衔铮浒ǖ幌抻谥珓?、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光化合物、發(fā)光化合物和發(fā)色團(tuán)。本文所用術(shù)語(yǔ)“熒光團(tuán)”指一類(lèi)其本身可發(fā)出熒光或在結(jié)合到生物化合物或金屬離子上或通過(guò)酶代謝時(shí)顯示熒光變化(即可發(fā)出熒光)的組成。熒光團(tuán)可經(jīng)取代，以改變熒光團(tuán)的溶解性、光譜特性或物理特性。本發(fā)明之熒光團(tuán)未經(jīng)磺化。大量熒光團(tuán)已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知，其包括但不限于苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、苯并吡咯、硼聚吖吲得辛(borapolyazaindacenes)及呫噸，后者還包括熒光素、羅丹明、對(duì)甲氨基酚及RICHARD P.HAUGLAND之MOLECULAR PROBESHANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(第九版，包括CD-ROM，2002年9月)中闡述的其它熒光團(tuán)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“酶”指由活有機(jī)體產(chǎn)生或通過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的化學(xué)修飾產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，其可催化其它物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)而本身在反應(yīng)完成后不會(huì)受到破壞或發(fā)生改變。其它物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色物質(zhì)和熒光物質(zhì)或以蛋白質(zhì)為主的底物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“鹵素”指取代基氟、溴、氯和碘及含有這些鹵素組合及多個(gè)任一種鹵素的化合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指如上定義的芳基中一或多個(gè)碳原子被一非碳原子(特別是被氮、氧或硫)取代的基團(tuán)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“IDA”指式為-N(CH2CO2R13)2的亞胺基二乙酸金屬螯合部分，其中R13是氫或一種鹽，連接體連接到氮原子上，前提是連接體不是連接到熒光團(tuán)芳香環(huán)上的共價(jià)單鍵。
本文提及標(biāo)題物肽、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)絡(luò)合物時(shí)所用術(shù)語(yǔ)“分離”指肽、蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)三元絡(luò)合物制備過(guò)程，使其基本上不含雜質(zhì)非磷酸化肽、蛋白質(zhì)或其他相關(guān)靶分子，而這些雜質(zhì)非磷酸化肽、蛋白質(zhì)或其他相關(guān)靶分子在(例如)含有內(nèi)源性蛋白質(zhì)或絡(luò)合物的細(xì)胞混合物或環(huán)境中通常會(huì)與肽、蛋白質(zhì)或絡(luò)合物共同存在。另外，在某些實(shí)施例中，“分離”也指與本發(fā)明中用于從細(xì)胞混合物中分離肽、蛋白質(zhì)或絡(luò)合物的試劑進(jìn)一步分離。因此，分離蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)絡(luò)合物可以是與樣品的其它部分分離，且視需要也可以是與本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物(包括聚合物基質(zhì))分離，這些組份或化全物通常會(huì)“污染”或干擾(例如)通過(guò)質(zhì)譜法對(duì)分離絡(luò)合物進(jìn)行研究或進(jìn)一步處理。術(shù)語(yǔ)“已分離”亦可指彼此通過(guò)(例如)在凝膠或陣列上的不同物理位置或通過(guò)在經(jīng)由諸如管柱或毛細(xì)管之類(lèi)的檢測(cè)器時(shí)的不同經(jīng)過(guò)時(shí)間而從空間或時(shí)間上分開(kāi)的磷酸化靶分子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指相關(guān)組份(通常是一或多種化合物或組合物)的成套封裝，視需要可包含緩沖液、分離介質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)樣品、軟件或其它組份。
本文所用術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”是指一種可檢測(cè)部分，其可便于檢測(cè)和分離與本發(fā)明的金屬螯合部分組合的磷酸化靶分子。例示性標(biāo)記物包括可直接觀察或測(cè)量的標(biāo)記物，可或間接觀察或測(cè)量的標(biāo)記物，例如，熒光團(tuán)、放射性標(biāo)記物、酶報(bào)道基因標(biāo)記物(Patton，W.等人，J.Chromatography BBiomedical Applications(2002)7713-31；Patton，W.等人，Electrophoresis(2000)211123-1144)。此等標(biāo)記物包括但不限于，可用輻射計(jì)數(shù)裝置測(cè)量的放射性標(biāo)記物；可用肉眼觀察或用分光光度計(jì)測(cè)量的著色劑、染料或其它發(fā)色染劑；可用自旋標(biāo)記分析儀測(cè)量的自旋標(biāo)記物；可通過(guò)以光(此光可被染料吸收)激發(fā)來(lái)觀察或可用標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)儀或成像系統(tǒng)測(cè)量的熒光標(biāo)記物(熒光團(tuán))(其中輸出信號(hào)由一種合適的分子加成物激發(fā)產(chǎn)生)，或者例如為可利用其光學(xué)或光散射特性來(lái)檢測(cè)的金屬粒子，例如金或銀粒子或金屬條形碼。標(biāo)記物可以是化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，其中輸出信號(hào)可通過(guò)信號(hào)化合物的化學(xué)修飾產(chǎn)生；含金屬的物質(zhì)；或酶，其中會(huì)產(chǎn)生酶依賴(lài)性二級(jí)信號(hào)，例如自一無(wú)色底物形成有色產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記物”也可指一種“標(biāo)記”、半抗原或其它配體，其可選擇性結(jié)合在被標(biāo)記的分子上，以便當(dāng)隨后添加被標(biāo)記分子時(shí)可使用該分子產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。例如，人們可用生物素作為標(biāo)記，然后將親和素或辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的鏈霉親和素共軛體結(jié)合到該標(biāo)記上，接著用一種發(fā)色底物(例如，四甲基聯(lián)苯胺)或一種熒光底物來(lái)檢測(cè)HRP的存在。大量的標(biāo)記物和標(biāo)記及其選擇性檢測(cè)方法已為通曉此項(xiàng)技術(shù)者所熟知，其包括但不限于粒子、熒光團(tuán)、半抗原、酶及其發(fā)色底物、熒光底物和化學(xué)發(fā)光底物以及其它闡述于上述《分子探針手冊(cè)(MOLECULAR PROBES HANDBOOK)》中的標(biāo)記物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“連接體”或“L”指將標(biāo)記物共價(jià)連接于標(biāo)記化合物的金屬螯合部分上的共價(jià)單鍵或一系列穩(wěn)定共價(jià)鍵，其中結(jié)合有1到30個(gè)選自由C、N、O和P原子組成之群的非氫原子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“金屬螯合劑”或“金屬螯合部分”指一可與金屬離子組合以形成螯合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化學(xué)部分。為達(dá)到本發(fā)明的目的，同金屬螯合劑有親和力的金屬離子在溫和的酸性環(huán)境中同時(shí)對(duì)該金屬螯合劑和磷酸化靶分子具有親和力。金屬螯合部分的實(shí)例有BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉。假如金屬螯合劑不被磺化，則該金屬螯合劑視需要可被那些可調(diào)節(jié)化合物的離子結(jié)合親和力、可溶性、光譜特性或其它物理特性的取代基所取代。
本文所用術(shù)語(yǔ)“金屬離子”是指在pH為3到6時(shí)同時(shí)與靶分子的磷酸根基團(tuán)和本發(fā)明的金屬螯合化合物具有親和力的任何三價(jià)金屬離子，可用于形成磷酸根結(jié)合化合物和磷酸化靶分子的三元絡(luò)合物。此等金屬離子包括但不限于AL3+、Fe3+及Ga3+。為達(dá)到本發(fā)明的目的，金屬離子必須同時(shí)對(duì)金屬螯合部分和靶分子的磷酸根基團(tuán)兩者都具有親和力，并由此將親和力賦予用于靶分子磷酸根基團(tuán)的金屬螯合部分，其中此親和力在金屬離子不存在時(shí)將不會(huì)存在。
本文所用術(shù)語(yǔ)“磷酸根結(jié)合化合物”或“結(jié)合化合物”指其式為(A)m(L)n(B)n的化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)。當(dāng)金屬螯合部分間接結(jié)合到靶分子上的磷酸根基團(tuán)時(shí)，這些化合物可有效地但非共價(jià)連接標(biāo)記物到磷酸化靶分子上。
本文所用術(shù)語(yǔ)“磷酸化靶分子”或“磷酸根靶分子”指具有一或多個(gè)磷酸根或磷酸根類(lèi)似部分的分子，其中每一個(gè)磷酸根或磷酸根類(lèi)似部分都通過(guò)單酯鍵或無(wú)機(jī)磷酸根結(jié)合于此分子上。磷酸鹽類(lèi)似物包括但不限于硫代硫酸鹽、磷酸硼、膦酰胺、H-膦酸鹽、膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及氟磷酸。磷酸化靶分子包括但不限于磷蛋白、磷酸肽、磷酯、磷酸聚糖、磷酸碳水化合物、磷酸氨基酸、焦磷酸鹽及無(wú)機(jī)磷酸鹽和其硫代磷酸鹽類(lèi)似物。大部分已知的磷酸鹽化合物和由其獲得的磷酸化靶分子可為下述三類(lèi)中的一類(lèi)1)單獨(dú)的磷酸根基團(tuán)(例如，無(wú)機(jī)磷酸根或蛋白質(zhì)或肽上的磷酸根基團(tuán)(PO3))；2)多連結(jié)磷酸根基團(tuán)(例如，焦磷酸鹽；或核苷酸，例如ATP)；3)橋聯(lián)磷酸根基團(tuán)(即核酸)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，磷酸化靶分子不包括上述第三類(lèi)分子，例如DNA或RNA。磷蛋白和磷酸肽通常在酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的氨基酸殘基上進(jìn)行翻譯后磷酸化。肽和蛋白質(zhì)中的其它磷酸化氨基酸殘基包括1-磷酸組氨酸、3-磷酸組氨酸、磷酸-天冬氨酸、磷酸-谷氨酸和較不常見(jiàn)的Nε-磷酸-賴(lài)氨酸、Nω-磷酸-精氨酸及磷酸-半胱氨酸(Kaufmann等人，(2001)Proteomics1194-199；Yan等人，(1998)J.Chromatograph.A 80823-41)。因此，磷酸化蛋白質(zhì)或肽通常包含至少一種這樣的氨基酸殘基。磷酸化靶分子也包括納入了其他非肽區(qū)例如脂類(lèi)或糖類(lèi)的磷酸化蛋白質(zhì)，例如，脂蛋白、脂多糖。另外，蛋白質(zhì)上的脂類(lèi)或糖類(lèi)殘基亦可經(jīng)磷酸化或與蛋白質(zhì)及肽上的酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基組合，例如經(jīng)磷酸甘露糖修飾的蛋白質(zhì)或經(jīng)N-乙酰谷氨酸-1-磷酸鹽修飾的蛋白質(zhì)。其它修飾包括吡哆醛磷酸根在賴(lài)氨酸的ε-氨基上形成西夫堿(Schiff base)，絲氨酸殘基的O-泛酰巰基乙胺磷酸化。使用本發(fā)明的方法亦可檢測(cè)三磷酸核苷酸的γ位磷酸根，通過(guò)該方法可檢測(cè)經(jīng)光學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)及肽。為達(dá)到本發(fā)明的目的，磷酸化靶分子包括磷酸化脂類(lèi)和糖類(lèi)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”在一般意義上包括任何長(zhǎng)度的氨基酸殘基聚合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“肽”指含有少于100個(gè)氨基酸殘基的多肽，通常含有少于15個(gè)氨基酸殘基。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一或多個(gè)氨基酸殘基是一相應(yīng)天然氨基酸的人造化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸聚合物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。肽或蛋白質(zhì)可進(jìn)一步與其它部分結(jié)合或絡(luò)合，例如可與染料、半抗原、放射性同位素、天然或合成聚合物(包括微球體)、玻璃、金屬和金屬粒子、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合或絡(luò)合。
本文所用術(shù)語(yǔ)“樣品”指可含有磷酸化靶分子的任何上述天然或合成物質(zhì)，或者其中可含有可直接與磷酸根或磷酸化靶分子相互作用的組份，例如酶。樣品通常包含純化的或半純化的磷酸化靶分子和內(nèi)源性宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。磷酸化靶分子可以純化或半純化形式通過(guò)人工合成制得，或從細(xì)胞(真核細(xì)胞或原核細(xì)胞不限)、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿、亞細(xì)胞組份得到天然或重組分子?；蛘?，磷酸化靶分子可通過(guò)組織勻漿、體液和其它生物液或合成蛋白質(zhì)得到，其在本發(fā)明中皆可構(gòu)成一樣品。樣品可以存在于水性溶液中或幾乎呈水性的溶液中、適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中或固定于固態(tài)或半固態(tài)表面，例如聚合物凝膠、膜、微粒、光纖或微陣列上。另外，本文所用術(shù)語(yǔ)“樣品”也指激酶或磷酸酶或結(jié)合磷酸化靶分子(其可經(jīng)磷酸化或可不經(jīng)磷酸化)的分子的底物。因此，“樣品”包含與磷酸鹽及磷酸化靶分子相互作用的組份，尤其包括針對(duì)磷酸化靶分子或靶分子其它區(qū)域的抗體，或(例如)經(jīng)生物素化的靶分子與親和素衍生物形成的絡(luò)合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“三元絡(luò)合物”指一種其同時(shí)包含磷酸根結(jié)合化合物、本發(fā)明的三價(jià)金屬離子和磷酸化靶分子的組合物，其中金屬離子同時(shí)對(duì)該化合物的金屬螯合部分和分子上的磷酸根基團(tuán)兩者都具有親和力，且其中此金屬離子在兩分子間形成橋鍵。除非上下文中對(duì)術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”和“絡(luò)合物形成”的使用加以限制，否則，在本發(fā)明中該等術(shù)語(yǔ)皆意味著該三元絡(luò)合物的形成過(guò)程。
II.組合物及其使用方法本發(fā)明提供了磷酸根結(jié)合化合物、磷酸鹽結(jié)合液及用于選擇性檢測(cè)及/或分離磷酸化靶分子的方法。當(dāng)本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物存在于結(jié)合液中時(shí)會(huì)選擇性地結(jié)合至磷酸化靶分子上并且可對(duì)靶分子進(jìn)行檢測(cè)及/或分離。結(jié)合液包含三種用來(lái)結(jié)合磷酸化靶分子的關(guān)鍵組份1)其式為(A)m(L)n(B)n的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；2)一種包含一金屬離子的鹽；及3)一種酸。結(jié)合液通常包括一種緩沖劑以保持酸性pH值，該值為大約pH 3至大約pH 6較為理想，結(jié)合液中還包括一種有機(jī)溶劑，其中用法和溶劑依具體應(yīng)用而定，并將在下文進(jìn)行討論。包含磷酸根結(jié)合化合物、金屬離子和磷酸化靶分子的三元絡(luò)合物在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，但當(dāng)pH接近中性(pH 7)或堿性(pH＞7.0)時(shí)，此絡(luò)合物會(huì)變得越來(lái)越不穩(wěn)定。
結(jié)合液用于將本發(fā)明的化學(xué)部分A或當(dāng)A是一反應(yīng)基團(tuán)時(shí)將本發(fā)明的一天然或合成物質(zhì)非共價(jià)連結(jié)到磷酸化靶分子上暴露的磷酸根基團(tuán)上，其中化學(xué)部分A可構(gòu)成本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物。這些被結(jié)合的靶分子隨后可用本文所述的檢測(cè)方法之一進(jìn)行檢測(cè)，或通過(guò)下面描述的大量方法加以分離。在酸性環(huán)境中，結(jié)合液中的金屬離子同時(shí)對(duì)磷酸根基團(tuán)和本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物之金屬螯合部分兩者都具有親和力。
因此，本發(fā)明通過(guò)磷酸根結(jié)合化合物來(lái)結(jié)合磷酸化靶分子的方法包含以下步驟i)用結(jié)合液接觸樣品，及；ii)將樣品和結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合，由此結(jié)合所述磷酸化靶分子。
假如樣品和結(jié)合液之間有充分的接觸，則本發(fā)明方法的使用不受分析形式的限制。因此，該方法意欲涵蓋任何形式的無(wú)限制數(shù)量的分析，其中不管分析意圖是什么，本發(fā)明的結(jié)合液皆與靶分子上的暴露磷酸根基團(tuán)接觸。因此，本發(fā)明的方法涵蓋但不限于以直接或間接方式對(duì)磷酸化靶分子的鑒別、對(duì)去磷酸化分子的鑒別、對(duì)可導(dǎo)致磷酸化和去磷酸化的酶的鑒別、對(duì)可與磷酸化靶分子互相作用的分子進(jìn)行鑒別及對(duì)磷酸化靶分子的分離。檢測(cè)包括—適用時(shí)—用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)樣品及對(duì)照樣品對(duì)磷酸化靶分子進(jìn)行定量分析、甄別及隨后的分析和鑒別。
總之，為了便于理解本發(fā)明，首先將詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合液的組份，接著闡述磷酸根結(jié)合化合物和金屬離子的多種不同的使用方法，隨后闡述某些特別適用于本發(fā)明方法的新穎化合物的例示性合成和使用方法。
A.磷酸根結(jié)合化合物的組份本發(fā)明中的磷酸根結(jié)合化合物具有式(A)m(L)n(B)，其中A是一化學(xué)部分，L一是共價(jià)連結(jié)化學(xué)部分和金屬螯合部分(B)的連接體?；瘜W(xué)部分通常是一反應(yīng)基團(tuán)或一包括染料、半抗原或酶在內(nèi)的標(biāo)記物。金屬螯合部分取決于對(duì)磷酸根及磷酸根類(lèi)似基團(tuán)有親和力的金屬離子；這樣的離子包括Ca3+、Fe3+及Al3+。我們發(fā)現(xiàn)為達(dá)到本發(fā)明的目的，在溫和的酸性環(huán)境中，例如在大約pH 3到大約pH 6之間的酸性環(huán)境中，三價(jià)鎵離子對(duì)靶分子上的磷酸根基團(tuán)和某些螯合基團(tuán)例如BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉皆具有親和力；其中以BAPTA螯合部分最佳。
1.磷酸根結(jié)合化合物的化學(xué)部分AA.標(biāo)記物磷酸根結(jié)合化合物的標(biāo)記物可以是熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所知的任何標(biāo)記物，當(dāng)標(biāo)記物或者共價(jià)連接到金屬螯合部分或者構(gòu)成其中不存在連接體的金屬螯合部分的一部分時(shí)，可形成本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物。標(biāo)記物包括但不限于發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、熒光蛋白質(zhì)、磷光染料、串聯(lián)染料(能量轉(zhuǎn)移對(duì))、微粒子、聚合物、半抗原、酶和放射性同位素。較佳的標(biāo)記物包括染料、熒光蛋白質(zhì)、半抗原和酶。共價(jià)連結(jié)可為共價(jià)單鍵或穩(wěn)定化學(xué)鍵的組合。將標(biāo)記物和金屬螯合部分結(jié)合在一起的共價(jià)連結(jié)通常是共價(jià)單鍵，但也可為包括1到30個(gè)非氫原子的取代烷基鏈，或?yàn)檫x自由C、N、O、S及P組成之群的取代環(huán)烷基。
本發(fā)明中的染料是最大吸光值大于280納米的任何化學(xué)部分，其當(dāng)磷酸根結(jié)合化合物的一部分保留其獨(dú)特的光譜特性時(shí)可提供一可檢測(cè)信號(hào)。較佳的染料是熒光團(tuán)或化學(xué)發(fā)光前體，其可直接檢測(cè)到或者在加入一附加試劑或多種試劑后產(chǎn)生熒光或化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象而可檢測(cè)到。
本發(fā)明中的染料包括但不限于嵌二萘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-胺基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑(NBD)、花青(包括在美國(guó)專(zhuān)利第09/968,401和第09/969,853以及美國(guó)專(zhuān)利第6,403,807號(hào)和第6,348,599號(hào)中的任何相應(yīng)化合物)、羰花青(包括美國(guó)專(zhuān)利第09/557,275號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第5,486,616號(hào)、第5,268,486號(hào)、第5,569,587號(hào)、第5,569,766號(hào)、第5,627,027號(hào)和第6,048,982號(hào)中的任何相應(yīng)化合物)、喹諾酮、卟啉、水楊酸鹽、鄰胺基苯甲酸鹽、甘菊環(huán)、苝、吡啶、喹啉、硼聚吖吲得辛(包括美國(guó)專(zhuān)利第4,774,339號(hào)、第5,187,288號(hào)、第5,248,782號(hào)、第5,274,113號(hào)和第5,433,896號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物，如上述)、呫噸(包括美國(guó)專(zhuān)利第6,162,931號(hào)、第6,130,101號(hào)、第6,229,055號(hào)、第6,339,392號(hào)、第5,451,343號(hào)、第6,221,606號(hào)、第6,358,684號(hào)、第6,008,379號(hào)、第6,111,116號(hào)、第6,184,379號(hào)、第6,017,712號(hào)、第6,080,852號(hào)、第5,847,162號(hào)以及美國(guó)專(zhuān)利第09/922,333中揭示的任何相應(yīng)化合物)、噁嗪或苯并噁嗪、咔嗪(包括美國(guó)專(zhuān)利第4,810,636號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)、phenalenone、香豆素(包括美國(guó)專(zhuān)利第5,696,157號(hào)、第5,459,276號(hào)、第5,501,980號(hào)和第5,830,912號(hào)中揭示的相應(yīng)化合物)、苯并呋喃(包括美國(guó)專(zhuān)利第4,603,209號(hào)和第4,849,362號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)和benzphenalenone(包括美國(guó)專(zhuān)利第4,812,409號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)及其衍生物。本文所用噁嗪包括試鹵靈(包括美國(guó)專(zhuān)利第5,242,805號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)、胺基噁嗪酮、二胺基噁嗪及其苯并基取代類(lèi)似物。
當(dāng)染料為呫噸時(shí)，此染料視需要也可以是熒光素、對(duì)甲氨基酚(包括美國(guó)專(zhuān)利第5,227,487號(hào)和第5,442,045號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)、羅丹明(包括美國(guó)專(zhuān)利第5,798,276號(hào)和第5,846,737號(hào)中的任何相應(yīng)化合物)。本文所用羅丹明和對(duì)甲氨基酚染料除包括其它衍生物外還包括含有呫噸(帶飽和或不飽和“久洛尼定(julolidine)”環(huán))的化合物。本文所用熒光素包括苯并-或二苯并熒光素、半萘并熒光素或萘并熒光素。同樣，本文所用的對(duì)甲氨基酚包括半萘并羅丹氟(seminaphthorhodafluors)(包括美國(guó)專(zhuān)利第4,945,171號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物)。
本發(fā)明之較佳染料包括苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、呫噸、吲哚、苯并吲哚和硼聚吖吲得辛。較佳的呫噸包括含有久洛尼定的呫噸及熒光素、對(duì)甲氨基酚、羅丹明和薔薇苯胺。本發(fā)明中的薔薇苯胺包含在呫噸中心環(huán)的碳原子上經(jīng)取代及未經(jīng)取代的兩種化合物，取代基是在以呫噸為主的染料中常見(jiàn)的取代基，例如苯基及取代苯基部分。較佳的熒光染料皆未經(jīng)磺化，這是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。
可供選擇的染料是一種在呫噸第9位通過(guò)共價(jià)單鍵L結(jié)合的呫噸。較佳的呫噸包括在第9位連結(jié)的3H-呫噸-6-醇-3-酮衍生物、在第9位連結(jié)的6-胺基-3H-呫噸-3-酮衍生物或在第9位連結(jié)的6-胺基-3H-呫噸-3-亞胺衍生物。
染料通常包含一或多個(gè)芳香環(huán)或雜芳環(huán)，該等環(huán)視需要可經(jīng)各種取代基取代一次或多次，取代基包括但不限于鹵素、硝基、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烯基、炔基、環(huán)烷基、芳烷基、?；⒎蓟螂s芳基環(huán)系統(tǒng)、苯基或者其它在此項(xiàng)技術(shù)中常見(jiàn)的染料上的取代基。
在本發(fā)明的一方面，染料的最大吸光值大于480納米。在一特別有用的實(shí)施例中，染料的吸收波長(zhǎng)在或者接近488納米到514納米(尤其適合通過(guò)氬離子激光源輸出來(lái)激發(fā))或者接近546納米(尤其適合通過(guò)汞弧光燈來(lái)激發(fā))。像許多染料一樣，此等染料既能作為發(fā)色團(tuán)又能作為熒光團(tuán)，因而使化合物可同時(shí)作為磷酸化靶分子的色度標(biāo)記物及熒光標(biāo)記物。因此，所述熒光染料也是本發(fā)明中較佳的發(fā)色團(tuán)。
除染料外，發(fā)現(xiàn)酶也可用作其式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物的標(biāo)記物。酶是令人滿意的標(biāo)記物，因?yàn)槠淇墒箍蓹z測(cè)信號(hào)獲得放大，因而可使分析敏感度提高。酶本身不產(chǎn)生可檢測(cè)響應(yīng)，但當(dāng)其與合適的底物接觸時(shí)能夠分解底物，從而使經(jīng)轉(zhuǎn)化的底物產(chǎn)生一熒光信號(hào)、發(fā)色信號(hào)或發(fā)光信號(hào)。酶能夠放大可檢測(cè)信號(hào)，因?yàn)闃?biāo)記化合物上的一個(gè)酶可以導(dǎo)致多個(gè)底物分子轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)信號(hào)。這在樣品中含有少量磷酸化靶分子時(shí)或當(dāng)可產(chǎn)生與酶相當(dāng)或較酶更強(qiáng)的信號(hào)的熒光團(tuán)不存在時(shí)是很有利的。其中以熒光團(tuán)為最佳，因?yàn)槠洳恍枰~外的分析步驟，因而可避免產(chǎn)生一不穩(wěn)定的三元絡(luò)合物。為產(chǎn)生較佳的可測(cè)量結(jié)果，例如顏色、熒光或化學(xué)發(fā)光，需對(duì)酶底物加以選擇。這樣的底物廣泛應(yīng)用于此項(xiàng)技術(shù)中，其中有許多闡述于MOLECULAR PROBESHANDBOOK(如上述)中。
在發(fā)色或熒光底物與酶的較佳組合中使用氧化還原酶，例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與底物如3，3′-二胺基聯(lián)苯胺(DAB)或3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)，其會(huì)產(chǎn)生可區(qū)分的顏色(分別為棕色和紅色)。其它能夠產(chǎn)生可檢測(cè)結(jié)果的發(fā)色氧化還原酶底物包括但不限于2，2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(OPD)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰聯(lián)二茴香胺、5-對(duì)胺基水楊酸和4-氯代-1-萘酚。熒光底物包括但不限于高香草酸或4-羥基-3-甲氧基苯乙酸、還原的吩噁嗪及還原的苯并噻嗪，包括Amplex紅試劑及其變型產(chǎn)品(美國(guó)專(zhuān)利第4,384,042號(hào))和還原的二氫呫噸，包括二氫熒光素(美國(guó)專(zhuān)利第6,162,931號(hào))和二氫羅丹明，包括二氫羅丹明123。酪酰胺類(lèi)過(guò)氧化酶底物(美國(guó)專(zhuān)利第5,196,306號(hào)、第5,583,001號(hào)和第5,731,158號(hào))代表著一類(lèi)獨(dú)特的過(guò)氧化酶底物，其獨(dú)特之處在于可在酶發(fā)揮作用前就檢測(cè)到其本身特征，但其在被描述為酪酰胺信號(hào)放大(TSA)的過(guò)程中通過(guò)過(guò)氧化物酶作用而被“固定于某一位置”。這些底物廣泛地用于標(biāo)記細(xì)胞、組織或陣列樣品中的目的物，以便于隨后通過(guò)顯微鏡、流式細(xì)胞儀、光學(xué)掃描和熒光計(jì)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。
在發(fā)色底物(在某些情況下是熒光底物)與酶的另一較佳組合中使用磷酸酶，例如酸性磷酸酶或此類(lèi)磷酸酶的重組型式與發(fā)色底物例如5-溴-4-氯-3-磷酸吲哚(BCIP)、6-氯-3-磷酸吲哚、5-溴-6-氯-3-磷酸吲哚、對(duì)硝基苯基磷酸鹽或鄰硝基苯基磷酸鹽的組合，或與熒光底物例如4-甲基傘形基磷酸鹽、6，8-二氟-7-羥基-4-甲基香豆素基磷酸鹽(DiFMUP，美國(guó)專(zhuān)利第5,830,912號(hào))、熒光素二磷酸鹽、3-O-甲基熒光素磷酸鹽、試鹵靈磷酸鹽、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸鹽(DDAO磷酸鹽)或ELF97、ELF39或相關(guān)磷酸鹽(美國(guó)專(zhuān)利第5,316,906號(hào)和第5,443,986號(hào))。
糖苷酶，特別是β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶和β-葡糖苷酶，亦是合適的酶。合適的發(fā)色底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和相似的吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸，鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和間硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。較佳的熒光底物包括試鹵靈β-D-吡喃半乳糖苷、熒光素二半乳糖苷(FDG)、熒光素二葡糖苷酸及其結(jié)構(gòu)變體(美國(guó)專(zhuān)利第5,208,148號(hào)、第5,242,805號(hào)、第5,362,628號(hào)、第5,576,424號(hào)和第5,773,236號(hào))、4-甲基傘形烷β-D-吡喃半乳糖苷、羧基傘形烷β-d-吡喃半乳糖苷和氟酸香豆素β-D-吡喃半乳糖苷(美國(guó)專(zhuān)利第5,830,912號(hào))。
其它酶包括但不限于，水解酶(例如膽堿酯酶及肽酶)、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶及細(xì)胞色素氧化酶)及還原酶，這些酶的合適底物已為眾人所熟知。
對(duì)于某些分析來(lái)說(shuō)，較佳使用酶及其可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的合適底物。這些包括但不限于熒光素酶及發(fā)光蛋白的天然和重組形式。可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的磷酸酶底物、糖苷酶底物及氧化酶底物(例如那些含有穩(wěn)定二氧丁環(huán)(dioxetanes)、胺基苯二酰肼、異胺基苯二酰肼及吖啶鎓酯的底物)特別有用。磷酸酶的幾種化學(xué)發(fā)光底物已為眾人所熟知，包括BOLD APB化學(xué)發(fā)光底物(Molecular Probes公司)。
除酶之外，半抗原如生物素、地高辛(digoxigenin)和2，4-二硝基苯基也是較佳的標(biāo)記物。生物素之所以有用是因?yàn)槠湓诿赶到y(tǒng)中能起進(jìn)一步放大可檢測(cè)信號(hào)的作用，并且在進(jìn)行分離時(shí)它能作為標(biāo)記用于親和色譜。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可使用對(duì)生物素有親合力的酶共軛體，如親和素-HRP。隨后，加入過(guò)氧化酶底物以產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。進(jìn)行分離時(shí)，可將一蛋白質(zhì)(例如對(duì)生物素有親合力的親和素)與瓊脂糖珠共軛結(jié)合。經(jīng)生物素標(biāo)記的金屬螯合部分與磷酸化靶分子接觸后，與管柱上的或結(jié)合到磁性粒子上的或溶液中的親和素珠粒一起培育，以分離及/或濃縮磷酸化靶分子。生物素的較佳形式是脫硫生物素類(lèi)似物，其可以很容易地被以親和素為主的親和基質(zhì)吸收或釋放。對(duì)于某些應(yīng)用而言，親和素的較佳形式是CaptAvidin生物素-結(jié)合蛋白質(zhì)(MolecularProbes)，其允許生物素化的化合物輕松釋放。
除其它衍生物之外，半抗原還包括激素、天然和合成的藥物、污染物質(zhì)、過(guò)敏原、效應(yīng)器分子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化學(xué)中間體、核苷酸及諸如此類(lèi)。熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)亦可用作本發(fā)明中的磷酸根結(jié)合化合物的標(biāo)記物。熒光蛋白質(zhì)的例子包括綠-熒光蛋白質(zhì)(GFP)、發(fā)光蛋白(acquorin)和藻膽蛋白及其衍生物。熒光蛋白質(zhì)，尤其是藻膽蛋白，對(duì)形成經(jīng)串聯(lián)染料標(biāo)記的標(biāo)記試劑或?qū)﹂g接檢測(cè)經(jīng)半抗原標(biāo)記的標(biāo)記化合物或固定在基質(zhì)(例如微粒或陣列)上的磷酸化靶分子是特別有用的。這些串聯(lián)染料包含一熒光蛋白質(zhì)及一熒光團(tuán)，以獲得斯托克司頻移(Stokes shift)，其中發(fā)射光譜較遠(yuǎn)地偏離熒光蛋白質(zhì)的吸收光譜波長(zhǎng)。這種特性對(duì)檢測(cè)樣品中少量的靶分子特別有利，其中發(fā)出的熒光獲得了最大程度的最佳化；換句話說(shuō)，發(fā)出的光很少甚至沒(méi)有一點(diǎn)被熒光蛋白質(zhì)重吸收。為了做到這一點(diǎn)，熒光蛋白質(zhì)和熒光團(tuán)起能量轉(zhuǎn)移對(duì)的作用，其中熒光蛋白質(zhì)在受體熒光團(tuán)吸收波長(zhǎng)處發(fā)光，然后熒光團(tuán)在一遠(yuǎn)離熒光蛋白質(zhì)波長(zhǎng)(遠(yuǎn)于僅以熒光蛋白質(zhì)所能獲得的波長(zhǎng))處發(fā)射光?；蛘?，熒光團(tuán)起能量給體的作用，熒光蛋白質(zhì)作為能量受體。特別有用的熒光蛋白質(zhì)是在美國(guó)專(zhuān)利第4,520,110號(hào)、第4,859,582號(hào)、第5,055,556號(hào)中揭示的藻膽蛋白及在美國(guó)專(zhuān)利第4,542,104號(hào)中揭示的熒光團(tuán)膽汁三烯蛋白質(zhì)組合物?；蛘?，兩種或多種熒光團(tuán)染料可起能量轉(zhuǎn)移對(duì)的作用，其中一個(gè)熒光團(tuán)為給體染料而另一個(gè)為受體染料(包括在美國(guó)專(zhuān)利第6,358,684號(hào)、第5,863,727號(hào)、第6,372,445號(hào)和第5,656,554號(hào)中揭示的任何染料化合物)。
B.反應(yīng)基團(tuán)本發(fā)明也涵蓋那些并非起必不可少的作用的其它物質(zhì)的連結(jié)，如熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所理解，標(biāo)記物就是此類(lèi)物質(zhì)，但卻可以用于本發(fā)明。此類(lèi)物質(zhì)包括固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)如聚合物粒子(特別是直徑小于約16微米的聚苯乙烯微球體)、磁性粒子、聚合物膜和玻璃。當(dāng)進(jìn)行一其中對(duì)磷酸根結(jié)合化合物進(jìn)行固定的分析(例如為了達(dá)到分離目的)時(shí)，或當(dāng)直接對(duì)一固定的磷酸化靶分子進(jìn)行進(jìn)一步的分析時(shí)，這些物質(zhì)特別有用，如本發(fā)明所述。
另外，任何生物組份可通過(guò)反應(yīng)基團(tuán)共價(jià)連結(jié)到磷酸根結(jié)合化合物上；這些組份包括但不限于，蛋白質(zhì)、肽、糖類(lèi)和多糖類(lèi)、核酸(包括核苷酸和核苷)、氨基酸、細(xì)胞器、細(xì)胞和細(xì)胞提取組份。
因此，本發(fā)明中的磷酸根結(jié)合化合物亦可包含反應(yīng)基團(tuán)例如胺反應(yīng)基團(tuán)，其用于將磷酸根結(jié)合化合物共價(jià)連結(jié)到基質(zhì)、微粒、磷酸化靶分子上或直接結(jié)合到一生物組份上。因此，當(dāng)形成包含磷酸根結(jié)合化合物、金屬離子和磷酸化靶分子的三元絡(luò)合物時(shí)，該等反應(yīng)基團(tuán)可與磷酸化靶分子形成一額外的共價(jià)鍵。這將有效提高絡(luò)合物的穩(wěn)定性并可對(duì)磷酸化靶分子進(jìn)行更嚴(yán)格的分離和分析，包括在超過(guò)溫和酸性pH范圍的情況下也能保持絡(luò)合物的完整性。
磷酸根結(jié)合化合物與分子的共價(jià)連結(jié)通常是親電子基團(tuán)與親核基團(tuán)兩者間化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。但是，當(dāng)使用光活化反應(yīng)基團(tuán)時(shí)，此共價(jià)連結(jié)可在結(jié)合液受到光照時(shí)發(fā)生。這對(duì)于保證只有磷酸化靶分子與本發(fā)明的結(jié)合化合物形成共價(jià)連結(jié)尤其有利。
熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已熟知用于將其它分子與本發(fā)明之磷酸根結(jié)合化合物共價(jià)連結(jié)在一起的大量親電子和親核反應(yīng)基團(tuán)。這些其它分子包括但不限于標(biāo)記物、生物組份(蛋白質(zhì)、核酸)、微粒、塑料如微孔板孔、聚合物如PVDF、硝酸纖維素、多聚糖尤其是瓊脂糖、葡聚糖和纖維素，包括美國(guó)專(zhuān)利第5,453,517號(hào)揭示的任何化合物。
2.連接體如上所述，本發(fā)明的化學(xué)部分A是磷酸根結(jié)合化合物的一部分，其中它們或者通過(guò)一連接體共價(jià)連結(jié)到金屬螯合部分上以形成本發(fā)明的化合物，或者標(biāo)記物與金屬螯合部分共用一芳香環(huán)，例如苯并呋喃和BAPTA。因此，當(dāng)化學(xué)部分與金屬螯合部分共用一芳香環(huán)時(shí)不存在連接體，式(A)m(L)n(B)中的n為0。一較佳實(shí)施例是其中不存在連接體的標(biāo)記化合物；但連接體作為共價(jià)單鍵亦較佳。
當(dāng)存在連接體時(shí)，連接體通常包含有1到30個(gè)選自由C、N、O、S和P組成之群的非氫原子。連接體通常為取代烷基或取代環(huán)烷基。作為選擇，熒光團(tuán)可直接與金屬螯合部分連結(jié)(此處連接體為單鍵)，或烷基連接體可含有苯環(huán)或經(jīng)苯環(huán)技術(shù)中所熟知的取代基取代的苯環(huán)。當(dāng)連接體不是共價(jià)單鍵時(shí)，連接體可以是穩(wěn)定化學(xué)鍵的任意組合，視需要可包括單鍵、雙鍵、三鍵或芳香碳-碳鍵及碳-氮鍵、氮-氮鍵、碳-氧鍵、硫-硫鍵、碳-硫鍵、磷-氧鍵、磷-氮鍵和氮-鉑鍵。較佳地，連接體含有少于20個(gè)非氫原子，且由醚、硫醚、硫脲、胺、酯、甲酰胺、磺酰胺、酰肼鍵和芳香或雜環(huán)芳香鍵的任意組合構(gòu)成。連接體通常為碳-碳單鍵和甲酰胺、磺酰胺、醚或硫醚鍵的一組合。連接體鍵通常產(chǎn)生下列可存在于連接體中的部分醚、硫醚、甲酰胺、硫脲、磺酰胺、尿素、胺基甲酸酯、肼、烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、環(huán)烷基和胺部分。所選標(biāo)記化合物的實(shí)例可結(jié)合下列三種(I、II和III)通式的連接體式(I)-(CH2)eC(X)NH(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d-，及式(II)-((C6R″4)O)d(CH2)e(C(X)NH(CH2)e)g(NH)dC(X)NH(C6R″4)(CH2)e-，及式(III)-(NHC(X)(NH)d(CH2)e(NH)dC(X)(NH)d(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d)-，其中X是O或S，d為0到1，e為0到6，g為1到4，R”各自為H、鹵素、烷氧基或烷基。應(yīng)理解，在一個(gè)連接體內(nèi)X、d、e和g皆可獨(dú)立選擇。
如此，本發(fā)明的一選定實(shí)施例是具有下式(VII、VIII、IX、X和XI)的磷酸根結(jié)合化合物式(VII)(A)(B)，沒(méi)有連接體；式(VIII)(A)-(n)(B)，連接體為共價(jià)單鍵；式(IX)(A)-[(CH2)eC(X)NH(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d]-(B)；式 (X)(A)-[(C6R″4)O]d(CH2)e(C(X}NH(CH2)e)g(NH)dC(X)NH(C6R″4)(CH2)e)-(B)及式(XI)(A)-[NHC(X)(NH)d(CH2)e(NH)dC(X)(NH)d(CH2)e(NHC(X)(CH2)e)d]-(B)，其中A為一化學(xué)部分，B為一金屬螯合部分。
任何連接體的組合都可用來(lái)將化學(xué)部分和金屬螯合部分連結(jié)在一起。另外，一種金屬螯合部分可具有一個(gè)以上的連接體用于連結(jié)另一標(biāo)記物(例如能量轉(zhuǎn)移對(duì))或一種附加物質(zhì)例如瓊脂糖、一種微粒或一種將此連接體和此附加物質(zhì)或磷酸化靶分子連結(jié)在一起的反應(yīng)基團(tuán)。一較佳實(shí)施例包括一金屬螯合部分，其通過(guò)或不通過(guò)連接體連接到一標(biāo)記物上，且亦連接到一附加物質(zhì)上。連接體也可經(jīng)取代以改變標(biāo)記化合物的物理性質(zhì)，例如金屬螯合部分的結(jié)合親合力及染料的光譜特性，或以胺基或硫醇反應(yīng)基團(tuán)取代。
連接體的另一重要特征是在化學(xué)部分A和螯合部分B之間提供足夠的空間，以防止化學(xué)部分對(duì)金屬離子至金屬螯合部分結(jié)合區(qū)的結(jié)合及對(duì)金屬離子至磷酸化靶分子的結(jié)合產(chǎn)生空間位阻。應(yīng)了解，并不是所有的化學(xué)部分都會(huì)產(chǎn)生空間位阻，作為本發(fā)明一較佳實(shí)施例就是包含一種不含連接體的染料的金屬螯合部分。但是，某些標(biāo)記物例如生物素通常通過(guò)連接體連結(jié)到金屬螯合部分上。因此，本發(fā)明中磷酸根結(jié)合化合物的連接體對(duì)以下幾方面很重要(1)連結(jié)化學(xué)部分A到金屬螯合部分上；(2)在化學(xué)部分和金屬螯合部分之間提供足夠的距離，以免在空間上阻礙金屬螯合部分與靶分子上的磷酸根基團(tuán)的親和力；及(3)可通過(guò)選擇連接體中的原子或者間接通過(guò)將取代基加成到連接體上來(lái)改變金屬螯合部分對(duì)磷酸化靶分子的親和力。
但是，應(yīng)了解，連接體并不是磷酸根結(jié)合化合物中必不可少的組份，某些較佳化合物并不包含連接體。
3.金屬螯合部分金屬螯合部分是可同時(shí)結(jié)合金屬離子且對(duì)靶分子上暴露的磷酸根基團(tuán)有親和力的部分，其中在金屬螯合部分、金屬離子和磷酸化靶分子之間形成三元絡(luò)合物。已發(fā)現(xiàn)可結(jié)合磷酸根基團(tuán)的金屬離子包括三價(jià)鎵離子、鐵離子和鋁離子。在一定條件下可結(jié)合這些離子的金屬螯合部分包括BAPTA、IDA、DTPA和菲咯啉類(lèi)。因此，金屬螯合部分必須1)結(jié)合對(duì)磷酸根基團(tuán)具有親和力的金屬離子；2)不影響金屬離子對(duì)磷酸根基團(tuán)的結(jié)合；及3)維持一穩(wěn)定的三元絡(luò)合物。符合這三條標(biāo)準(zhǔn)的金屬螯合部分包括BAPTA、IDA、DTPA及菲咯啉類(lèi)。
本文所用BAPTA指金屬螯合部分(1，2-二(2-胺基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸)的類(lèi)似物，包括其熒光和非熒光衍生物及其鹽，其中包括在美國(guó)專(zhuān)利第4,603,209號(hào)、第4,849,362號(hào)、第5,049,673號(hào)、第5,453,517號(hào)、第5,459,276號(hào)、第5,516,911號(hào)、第5,501,980號(hào)和第5,773,227號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物。這些以BAPTA為主的金屬螯合部分已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知，由于其在生理?xiàng)l件下能夠結(jié)合二價(jià)鈣離子而主要作為鈣指示劑使用，生理?xiàng)l件即指pH大約為7且游離鈣濃度接近微摩爾級(jí)和亞微摩爾級(jí)范圍。但是，我們發(fā)現(xiàn)，用這些指示劑來(lái)實(shí)施本發(fā)明方法對(duì)本發(fā)明所述磷酸化靶分子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，鈣是完全無(wú)效的金屬離子。
為明晰起見(jiàn)，而非意欲作為限制，下面的結(jié)構(gòu)代表本發(fā)明的較佳BAPTA金屬螯合部分，其具有式IV
較佳地，A環(huán)和B環(huán)的兩個(gè)氧原子之間通過(guò)碳?xì)錁蜴I連接，其中p為0、1或2，環(huán)取代基(R1到R8)各自獨(dú)立選自由氫、鹵素、羥基、烷氧基、脂環(huán)、雜脂環(huán)、烷基、芳基、胺基、醛、羧基、硝基、氰基、硫醚、亞磺?；瓦B接體(L)組成之群。或者，兩個(gè)相鄰的環(huán)取代基聯(lián)合構(gòu)成一環(huán)取代基，其可為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、稠環(huán)芳基、雜芳基或稠環(huán)雜芳基。較佳地，BAPTA金屬螯合部分至少有兩個(gè)取代基不是氫；最佳地，BAPTA金屬螯合部分用氟原子作為取代基之一來(lái)取代，且最佳在R5或R3位置取代(例如化合物1、化合物2、化合物5、化合物7、化合物8和化合物12)。連接體通常在R3或R6位置將化學(xué)部分連結(jié)至BAPTA。同樣較佳的是包含羰基作為取代基(較佳在R7位置)的BAPTA金屬螯合部分，例如化合物9和化合物12。不受特定理論的束縛，看來(lái)吸電子基團(tuán)例如氟或羰基在R3、R4、R6或R7位置經(jīng)取代后產(chǎn)生特別有利于螯合三價(jià)鎵離子的BAPTA金屬螯合部分，然后螯合的鎵離子同時(shí)也可與磷酸化靶分子上暴露的磷酸根基團(tuán)相互作用，形成穩(wěn)定的三元絡(luò)合物。
橋取代基R9、R10、R11和R12各獨(dú)立選自由氫、低烷基組成之群，或相鄰取代基R9和R10以聯(lián)合方式構(gòu)成5元或6元脂環(huán)或雜環(huán)。R15、R16、R17和R18各獨(dú)立為氫或低烷基；較佳地，R15、R16、R17及R18均為氫。R13及R14各獨(dú)立為氫或一種鹽。
應(yīng)理解，本發(fā)明的化學(xué)部分通過(guò)連接體在任何位置或R1到R12位置連結(jié)到BAPTA金屬螯合部分上，或當(dāng)其中沒(méi)有連接體存在時(shí)通過(guò)包含該等金屬螯合部分中的一個(gè)芳香環(huán)的染料標(biāo)記物連接。因此，當(dāng)R1到R12中兩個(gè)相鄰的取代基彼此聯(lián)合時(shí)可與其所結(jié)合的芳香環(huán)構(gòu)成熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記物。然而，一個(gè)磷酸根結(jié)合化合物可具有一個(gè)以上的連接體，因而可使一染料標(biāo)記物不以連接體連結(jié)，而存在于金屬螯合化合物上的其它四個(gè)連接體可連結(jié)其它標(biāo)記物或反應(yīng)基團(tuán)。在本發(fā)明的一方面中，兩個(gè)相鄰的環(huán)取代基(R1-R4或R5-R8)以聯(lián)合方式可形成染料標(biāo)記物，其為稠環(huán)苯并呋喃或x雜芳基-或羧基雜芳基-取代的苯并呋喃熒光團(tuán)。當(dāng)染料標(biāo)記物與本發(fā)明的化合物形成稠環(huán)時(shí)，較佳在R2和R3或R6和R7之間形成稠環(huán)。
呫噸衍生物染料是本發(fā)明中特別有用的染料，其中BAPTA或經(jīng)取代的BAPTA金屬螯合化合物苯環(huán)之一或兩者都通過(guò)一化學(xué)單鍵(例如在常用的Ca2+指示劑fluo-3、fluo-4和rhod-2中(美國(guó)專(zhuān)利第5,049,673號(hào)，如上述))或通過(guò)苯基或取代苯基間隔區(qū)的媒介作用(例如在Oregon GreenBAPTA指示劑中(美國(guó)專(zhuān)利第6,162,931號(hào)，如上述)而結(jié)合到呫噸環(huán)上。呫噸環(huán)通常是在與BAPTA的氮官能基的對(duì)位結(jié)合到BAPTA上。尤佳的是含有呫噸且其熒光團(tuán)為羅丹明或鹵代熒光素的BAPTA衍生物。特別佳的是BAPTA螯合劑的5-位被F(包括rhod-5F和fluo-5F)取代后形成的熒光BAPTA衍生物。
本文所用DTPA指二亞乙基三胺五乙酸螯合部分及其衍生物，包括美國(guó)專(zhuān)利第4,978,763號(hào)和第4,647,447號(hào)中揭示的任何相應(yīng)化合物。DTPA金屬螯合部分可用包含(CH2C02R13)zN[(CH2)sN(CH2CO2R13)]T(CH2)sN(CH2CO2R13)z的式V來(lái)表示，其中一連接體連結(jié)到次甲基碳或氮原子上，Z為1或2，S為1到5，T為0到4，R13獨(dú)立為氫或一種鹽。
本文所用IDA指亞胺基二乙酸化合物及其衍生物，以包含-(L)-N(CH2CO2R13)2的式VI來(lái)表示，其中假如所述連接體不是共價(jià)單鍵，則R13獨(dú)立為氫或一種鹽。IDA金屬螯合部分必須通過(guò)連接體與化學(xué)部分連結(jié)，其中所述連接體包含至少一個(gè)非氫原子。不需受理論的束縛，看來(lái)連接體可提高三元絡(luò)合物的穩(wěn)定性并可調(diào)節(jié)金屬螯合部分對(duì)本發(fā)明金屬離子的親和力。
除上述具體金屬螯合部分外，我們也發(fā)現(xiàn)以菲咯啉為主的螯合劑在溫和酸性環(huán)境中也可與金屬離子和磷酸根靶分子形成三元絡(luò)合物。本文所用菲咯啉指1，10-菲咯啉化合物及其衍生物，以下列結(jié)構(gòu)式表示 任何芳香碳原子均可由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的取代基所取代，包括上述美國(guó)專(zhuān)利第6,316,267號(hào)中揭示的那些取代基。作為選擇，連接體可連結(jié)到任一芳香碳原子上，以將化學(xué)部分A共價(jià)連結(jié)到菲咯啉部分上，形成本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物。
B.磷酸根結(jié)合化合物可在三元絡(luò)合物形成后提供最佳信號(hào)的磷酸根結(jié)合化合物的合成策略涉及對(duì)化學(xué)部分A和金屬螯合部分之間的適宜化學(xué)連接的選擇，也涉及對(duì)金屬螯合部分上適宜取代基的選擇。這些選擇應(yīng)能使所得磷酸根結(jié)合化合物對(duì)金屬離子及金屬離子對(duì)磷酸化靶分子兩者同時(shí)保持最佳的結(jié)合親和力，且保持足夠的溶解性以促進(jìn)三元絡(luò)合物持久存在。不適當(dāng)?shù)倪x擇所產(chǎn)生的磷酸根結(jié)合化合物沒(méi)有足夠的結(jié)合親和力并且不會(huì)產(chǎn)生持久存在的三元絡(luò)合物。不適當(dāng)?shù)倪x擇也會(huì)導(dǎo)致磷酸根結(jié)合化合物與除磷酸化靶化合物以外的分析物形成過(guò)多的非選擇性結(jié)合，造成高本底并由此獲得低信號(hào)噪聲比。適用于本發(fā)明的化合物最好用實(shí)例1D中的方法進(jìn)行篩選。
我們發(fā)現(xiàn)BAPTA衍生物尤其適用于本發(fā)明的各個(gè)方面。本發(fā)明之新穎磷酸根結(jié)合化合物的合成和用途在實(shí)例中進(jìn)行了闡述，該等化合物包括帶有喹唑啉酮熒光染料的BAPTA螯合部分(化合物6、化合物7和化合物23)；帶有硼聚吖吲得辛熒光染料的BAPTA螯合部分(化合物8、化合物24和化合物27a-f)；帶有以呫噸為主的染料的BAPTA螯合部分(化合物11、化合物19、化合物26和化合物25)；帶有生物素標(biāo)記物的BAPTA螯合部分，其中生物素通過(guò)連接體連結(jié)(化合物9、化合物12、化合物15和化合物18)；帶有苯并噻唑標(biāo)記物的金屬螯合部分(化合物17)；與瓊脂糖共價(jià)連結(jié)的金屬螯合部分(化合物13和化合物14)；包含苯胺(其通過(guò)連接體連接到BAPTA化合物上)的BAPTA化合物(化合物10)。新穎化合物還包括通過(guò)連接體連結(jié)到DTPA螯合部分的硼聚吖吲得辛熒光團(tuán)標(biāo)記物(化合物20、化合物21和化合物22)。這些新穎的磷酸根結(jié)合化合物可用于檢測(cè)及分離磷酸化靶分子。這些化合物的合成在實(shí)例30到48中舉例說(shuō)明。
本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物展示出對(duì)鎵(III)-磷酸化靶分子絡(luò)合物的充分的非共價(jià)結(jié)合親和力，足以使過(guò)量試劑從持久存在的三元絡(luò)合物中沖洗掉。另外，發(fā)現(xiàn)某些磷酸根結(jié)合化合物在三元絡(luò)合物形成后可提供最佳信號(hào)，因此對(duì)環(huán)境更加敏感。該信號(hào)的強(qiáng)弱似乎隨磷酸根結(jié)合化合物-鎵(III)-磷酸化靶分子絡(luò)合物的經(jīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)的疏水性而變化。因此，當(dāng)希望得到可檢測(cè)響應(yīng)(例如對(duì)溶液中的磷酸化靶分子進(jìn)行標(biāo)記)且此可檢測(cè)響應(yīng)為熒光響應(yīng)時(shí)，其通常是熒光方面的變化，例如熒光強(qiáng)度、熒光激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)的分布、熒光壽命、熒光偏振或其組合等方面的變化。在較佳地，當(dāng)鎵離子及磷酸化靶分子結(jié)合到螯合劑上時(shí)，可檢測(cè)光響應(yīng)是一增加了大約2倍的熒光強(qiáng)度的變化。
然而，在其中磷酸化靶分子或磷酸根結(jié)合化合物被固定—產(chǎn)生固定的三元結(jié)構(gòu)的實(shí)際應(yīng)用中，因金屬螯合部分的螯合及隨后三元絡(luò)合物的形成所引起的可檢測(cè)熒光響應(yīng)的增強(qiáng)可能是不必要的。這是由于該三元絡(luò)合物較穩(wěn)定，因而允許通過(guò)沖洗去掉未結(jié)合的磷酸根結(jié)合化合物，其中來(lái)自磷酸根結(jié)合化合物的熒光響應(yīng)足以用來(lái)觀察磷酸化靶分子。因此，在這種情況下一較佳實(shí)施例是磷酸根結(jié)合化合物在結(jié)合本發(fā)明中的金屬離子和磷酸化靶分子時(shí)僅發(fā)生少許或不發(fā)生熒光變化。
金屬螯合部分和標(biāo)記物的組合可產(chǎn)生對(duì)環(huán)境敏感(即，在同時(shí)結(jié)合金屬離子和磷酸化靶分子形成三元絡(luò)合物時(shí)產(chǎn)生熒光變化)或不敏感(即，熒光信號(hào)不發(fā)生變化)的磷酸根結(jié)合化合物?？僧a(chǎn)生強(qiáng)烈的可檢測(cè)信號(hào)且有利于形成三元絡(luò)合物的本發(fā)明之最佳熒光染料包括苯并呋喃、喹啉、喹唑酮、呫噸、苯并吡咯及硼聚吖吲得辛化合物，包括其各種衍生物。當(dāng)染料構(gòu)成金屬螯合部分時(shí)，這些熒光染料會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的可檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是較佳的熒光染料皆未經(jīng)磺化。









C.結(jié)合液本發(fā)明的結(jié)合液包含下列組份a)一種式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；b)一種包含金屬離子的鹽；及，c)一種酸。
如下所述，結(jié)合液可用多種方式制備，此取決于所用方法及含有樣品的培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，結(jié)合液包含式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物、一種包含金屬離子的鹽和一種酸于一水性溶液中，其中酸足以將結(jié)合液的pH調(diào)節(jié)在3到6之間；視需要結(jié)合液還可包含一種有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與額外的離子或非離子組份(例如氯化鈉)的混合物。結(jié)合液的任一組份可一起加入或分別加入且沒(méi)有特別的先后次序，如下所述，磷酸根結(jié)合化合物可以固定在一固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上，其中基質(zhì)中添加有金屬離子或酸以形成本發(fā)明的結(jié)合液。因此，磷酸根結(jié)合化合物不必游離于結(jié)合液中以形成此溶液，而是可以固定在一固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)表面。我們發(fā)現(xiàn)金屬離子和磷酸根結(jié)合化合物的濃度需要根據(jù)檢測(cè)或分離方法作相應(yīng)調(diào)節(jié)。
可溶性磷酸根結(jié)合化合物可通過(guò)溶解在一種溶劑(例如水、DMSO、DMF或甲醇)中來(lái)制備，通常最終濃度約為0.1μM到10μM；較佳地，磷酸根結(jié)合化合物在結(jié)合液中的濃度為大約0.5μM到5μM，此濃度大約為1.0μM最佳。但是，當(dāng)結(jié)合液用于沉淀溶液中磷酸化靶分子時(shí)，需要結(jié)合液中有較高濃度的磷酸根結(jié)合化合物—較佳為約0.05mM到1mM較佳。盡管為沉淀目的增加了濃度，但磷酸根結(jié)合化合物對(duì)金屬離子的比率與用于檢測(cè)目的結(jié)合液中的比率相當(dāng)。
含有金屬離子的鹽較佳包含三價(jià)鎵離子，例如從氯化鎵中得到的鎵離子，但也可以是熟習(xí)本技術(shù)人員所熟知的任何鎵鹽。作為選擇，鐵和鋁離子也可用于本發(fā)明的結(jié)合液中?？捎糜诒景l(fā)明的鎵鹽包括但不限于乙酰丙酮化物、砷化物、溴化物、氯化物、氟化物、碘化物、硝酸鹽、氮化物、高氯酸鹽、硫酸鹽和硫化物。存在于結(jié)合液中的鎵鹽濃度通常為約10nM到約1mM；鎵鹽濃度為約0.5μM到10μM較佳。但是，倘使為了達(dá)到沉淀目的，則鎵鹽濃度較佳略高一些，為約0.1mM到約0.5mM。
在不同的pH值下評(píng)價(jià)分析磷酸根結(jié)合化合物對(duì)鎵離子及鎵離子對(duì)磷酸化靶分子之間的穩(wěn)定性和特異性(實(shí)例1)。根據(jù)這些結(jié)果，可以確定較佳的結(jié)合液包含一種可為結(jié)合反應(yīng)提供溫和酸性環(huán)境的酸。事實(shí)上，本發(fā)明的一重要且意料不到的方面是金屬螯合基團(tuán)在一溫和的酸性環(huán)境中結(jié)合三價(jià)陽(yáng)離子如鎵，因而隨著pH水平增加到接近中性pH時(shí)可滴定熒光信號(hào)。酸性環(huán)境被定義為溶液的pH低于6.9。典型的適當(dāng)酸性組份包括但不限于乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、高氯酸或硫酸。酸性組份的濃度通常為1％到20％，并通過(guò)堿緩沖到合適的pH。結(jié)合液的pH較佳為約pH 3到6，最佳為約pH 4。當(dāng)pH為4或接近4時(shí)使用乙酸較佳。根據(jù)所用化合物的不同，每一種所用化合物的最佳pH可以稍有變化；對(duì)化合物2來(lái)說(shuō)，pH 4.0較佳。
結(jié)合液的pH視需要可以通過(guò)加入除酸性組份之外的緩沖劑來(lái)修正。具體而言，我們已證明緩沖劑的存在可出人意料地改良固定在電泳凝膠上的磷酸化靶分子的結(jié)合，條件是該配方中還包括一種醇。任何能維持酸環(huán)境并且能與樣品中磷酸化靶分子相容的緩沖劑均適合加入到結(jié)合液中。
可用的緩沖劑包括甲酸鹽、乙酸鹽、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、咪唑、N-(2-羥乙基)哌嗪基乙磺酸、三(羥甲基)胺基甲烷乙酸鹽或三(羥甲基)胺基甲烷、鹽酸，其中這些緩沖劑不螯合鎵離子。一種例示性緩沖劑是乙酸鈉。緩沖劑在結(jié)合液中的濃度通常約為20mM到500mM，較佳約為50mM到200mM。
當(dāng)結(jié)合液含有pH緩沖劑及一鹽時(shí)，建議向結(jié)合液中加入一種水混溶性有機(jī)溶劑，通常是一種醇。盡管允許使用高極性的有機(jī)溶劑例如甲酰胺，但通常極性有機(jī)溶劑是一種含1到6個(gè)碳原子的醇，或一種含2到6個(gè)碳原子的二元醇或三元醇。一種較佳的醇是1，2-丙二醇。當(dāng)存在極性有機(jī)溶劑時(shí)，其在結(jié)合液中的濃度通常是5％到50％。當(dāng)結(jié)合經(jīng)十二烷基磺酸鈉(SDS)包被的蛋白質(zhì)時(shí)，存在極性有機(jī)溶劑尤其有利，如當(dāng)結(jié)合已通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電印跡的磷酸化蛋白質(zhì)或肽時(shí)通常就是這種情況。在較佳的程序中，通常應(yīng)在加入結(jié)合液之前通過(guò)固定和洗滌將SDS從凝膠或印跡上去掉；然而，可能會(huì)殘留部分SDS，并會(huì)干擾本發(fā)明的結(jié)合方法。不希望受任何理論束縛，看來(lái)一種醇的存在可通過(guò)去除任何未能通過(guò)洗滌和固定樣品而去除的SDS來(lái)改善磷酸化蛋白質(zhì)或肽的發(fā)光標(biāo)記物。但是，高濃度醇(例如大于約20％)可以損壞硝酸纖維素膜，因此，在選擇溶劑濃度時(shí)應(yīng)注意不要損壞其上固定有磷酸化蛋白質(zhì)或肽的膜。
D.使用方法1.方法本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物可以不受限制地用于分析和監(jiān)測(cè)磷酸化靶分子。以此方式，可以不受限制的分析形式來(lái)檢測(cè)磷酸化靶分子，以提供關(guān)于靶分子上磷酸根基團(tuán)數(shù)量方面的信息、對(duì)磷酸化作用中涉及的酶進(jìn)行鑒別、分析這些靶分子在蛋白質(zhì)組中的作用及——通過(guò)進(jìn)一步分析——確定磷酸根基團(tuán)在靶分子上的連結(jié)位點(diǎn)。在本發(fā)明化合物用于選擇性檢測(cè)及/或分離磷酸化靶分子后還可以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
本發(fā)明方法可以在固定樣品上實(shí)施，也可在其中固定有磷酸根結(jié)合化合物的樣品上或樣品和標(biāo)記化合物兩者都存于溶液中的情況下實(shí)施。結(jié)合液與樣品的組合方式應(yīng)能促進(jìn)磷酸根結(jié)合化合物、三價(jià)金屬離子和樣品中的任何磷酸化靶分子之間的接觸，其中三元絡(luò)合物的形成可有效地將化學(xué)部分A與存在的磷酸化靶分子結(jié)合在一起。當(dāng)樣品固定到固態(tài)或半固態(tài)載體上時(shí)，結(jié)合液與樣品通常在可最大限度接觸的條件下培育，如溫和混合或輕搖。
用于檢測(cè)固定在凝膠上的磷酸化靶分子的本發(fā)明方法通常包含以下步驟i)將樣品固定于凝膠上；ii)視需要用固定液接觸步驟i)的凝膠；iii)用本發(fā)明結(jié)合液接觸步驟ii)的凝膠；iv)將步驟iii)的凝膠與結(jié)合液培育足夠時(shí)間以使所述化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合；v)觀察磷酸根結(jié)合化合物，由此檢測(cè)出所述磷酸化靶分子；及，vi)視需要將第二種(或第三種)染色劑加到該凝膠上以檢測(cè)總蛋白或另一類(lèi)蛋白質(zhì)例如糖蛋白，或者檢測(cè)二者。
將樣品固定在凝膠上通常包含電泳分離樣品。用于將靶分子彼此分離的凝膠不受限制地包括任何為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的凝膠，包括以聚合物為主的凝膠例如瓊脂糖和聚丙烯酰胺，其中當(dāng)電流通過(guò)時(shí)，凝膠和靶分子根據(jù)電荷和分子大小來(lái)遷移。因此，凝膠(還原型和天然型)也包括單向和雙向這兩種凝膠及等電聚焦凝膠。采用毛細(xì)管電泳時(shí)，也可使用凝膠、含有聚合物的溶液或僅使用溶液。
視需要，通過(guò)凝膠分離的樣品可以使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的技術(shù)轉(zhuǎn)移到聚合物膜上，其中該膜接著同本發(fā)明的結(jié)合液接觸以選擇性檢測(cè)出磷酸化靶分子。用于檢測(cè)固定在膜上的磷酸化靶分子的本發(fā)明方法通常包含以下步驟i)通過(guò)凝膠對(duì)樣品進(jìn)行電泳分離；ii)將已分離的樣品轉(zhuǎn)移到一膜上；iii)視需要用一固定液接觸步驟ii)的膜；iv)用一結(jié)合液接觸步驟iii)的膜；v)將步驟iv)的膜和結(jié)合液培育足夠時(shí)間以使化合物與磷酸化靶分子結(jié)合；及，vi)觀察該化合物，由此檢測(cè)出所述磷酸化靶分子；vii)視需要將第二種(及/或第三種)染色劑加到膜上以檢測(cè)總蛋白或另一類(lèi)蛋白質(zhì)，例如糖蛋白。
通常使用SDS作為一種樣品制備組份或電泳緩沖液組份來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳。但是，SDS會(huì)干擾本發(fā)明的結(jié)合液，因此必須在添加結(jié)合液之前將其從凝膠或膜上去除。凝膠及膜經(jīng)固定及洗滌后即可從凝膠或膜上去除大部分或全部SDS。凝膠和膜的較佳固定液包括甲醇和乙酸；視需要固定液還可包含戊二醛。甲醇的濃度大約為35％到50％，乙酸的濃度大約為0到15％，戊二醛的濃度大約為0到2％。通常，固定后用100％水來(lái)洗滌凝膠及膜。
然而，為達(dá)到本發(fā)明的目的，結(jié)合液也能用于檢測(cè)已通過(guò)天然或非還原型凝膠分離的磷酸化靶分子。因此，對(duì)于使用這些不含SDS的凝膠的方法而言，固定液步驟就不必要了。
當(dāng)樣品已通過(guò)凝膠分離或轉(zhuǎn)移到聚合物膜上并視需要經(jīng)固定和洗滌后，將凝膠或印跡與結(jié)合液一起培育(實(shí)例2到9)。應(yīng)將磷酸化蛋白質(zhì)或肽與結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使磷酸根結(jié)合化合物/金屬離子絡(luò)合物結(jié)合到所存在的磷酸化蛋白質(zhì)或肽上。較佳地，這一時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)；更佳地，這一時(shí)間少于8小時(shí)；最佳地，培育時(shí)間少于2小時(shí)，但不能少于5分鐘。當(dāng)與結(jié)合液一起培育后，通常用一混合液來(lái)洗滌凝膠或膜，該混合液較佳包含酸性緩沖劑及乙腈；用于本發(fā)明中的有用緩沖劑包括但不限于NaOAc、甲酸鹽及2-(N-嗎啉基)乙磺酸。洗滌液中緩沖劑的濃度通常約為25mM到約100mM。此外，已發(fā)現(xiàn)視需要加入洗滌液中的乙腈通?？蛇€原非特異性標(biāo)記物。較佳地，乙腈濃度從1％到7％，更佳者為3％到4％更佳。一種可供選擇的洗滌液由10％到20％的1，2-丙二醇構(gòu)成。
如此，在磷酸根結(jié)合化合物經(jīng)結(jié)合和洗滌后，當(dāng)磷酸根結(jié)合絡(luò)合物包含如上所述的熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)標(biāo)記物時(shí)，可以直接照射三元絡(luò)合物，以觀察磷酸化靶分子。作為選擇，可使用針對(duì)標(biāo)記物的抗體來(lái)檢測(cè)印跡上是否存在磷酸化靶分子及其位置，這些抗體例如可為抗BAPTA抗體、抗熒光團(tuán)抗體、抗半抗原的抗體或親和素(當(dāng)標(biāo)記物是生物素衍生物時(shí))，然后用西方印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)加以檢測(cè)，例如通過(guò)熒光、化學(xué)發(fā)光或放射性來(lái)顯示磷酸化靶分子的標(biāo)記物。
結(jié)合液中的磷酸根結(jié)合化合物依據(jù)其在不同介質(zhì)中結(jié)合磷酸化靶分子的能力來(lái)選擇。因此，用于結(jié)合凝膠中的磷酸化靶分子的較佳磷酸根結(jié)合化合物包括本發(fā)明的化合物1到化合物4及化合物7到化合物11。用于結(jié)合膜上的磷酸化靶分子的較佳化合物包括本發(fā)明的化合物1、化合物4及化合物7。
通過(guò)雙向凝膠來(lái)鑒別磷酸化蛋白質(zhì)或肽的一個(gè)特別優(yōu)勢(shì)是其能夠準(zhǔn)確鑒別磷蛋白質(zhì)組，并能定量分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以便增減磷酸根基團(tuán)。具體而言，標(biāo)記磷酸化蛋白質(zhì)或肽的同時(shí)或隨后進(jìn)行總蛋白染色可鑒別磷酸化蛋白質(zhì)組，而信號(hào)強(qiáng)度當(dāng)與總蛋白染色相比較時(shí)可與磷酸化水平相關(guān)聯(lián)(見(jiàn)實(shí)例6、實(shí)例7和實(shí)例13)。任何對(duì)總蛋白具有特異性的熒光染料都可用于對(duì)凝膠中的總蛋白質(zhì)進(jìn)行染色；對(duì)于凝膠來(lái)說(shuō)較佳的染料是SYPRORuby染料或美國(guó)專(zhuān)利第6,316,276 B1號(hào)中揭示的任何一種染料。其它的熒光染料例如MDPF和CBQCA也可以用于膜上檢測(cè)。由于在用本發(fā)明的染色混合液染色之前將洗掉SDS，因此，總蛋白染色劑例如SYPRORuby染料較佳，因?yàn)镾DS對(duì)它們的染色作用不是很關(guān)鍵。然而，當(dāng)使用一種由于染色敏感性而需要SDS的染劑時(shí)，例如SYPROOrange染料、SYPRORed染料及SYPROTangerine染料，可通過(guò)在總蛋白染色步驟前將SDS加回到凝膠上并在總蛋白染色劑的染色液中添加SDS而改變方案(Malone等人，Electrophoresis(2001)22(5)919-32)。使SDS返回到凝膠中的較佳混合液為2％的酸/0.0005％的SDS及視需要40％的乙醇，其中凝膠至少培育1小時(shí)。作為選擇，總蛋白可以在本發(fā)明的磷酸化靶分子染色之前進(jìn)行染色；因此，在這種情況下，就不必將SDS加回到凝膠中，而只需在磷酸化靶分子染色步驟前簡(jiǎn)單地將SDS去除，如同本發(fā)明涵蓋的一樣。因此，可供選擇的用于凝膠的較佳總蛋白染色劑包括但不限于SYPROOrange染料、SYPRORed染料及SYPROTangerine染料或者美國(guó)專(zhuān)利第5,616,502號(hào)或美國(guó)專(zhuān)利第09/632,927中揭示的任何一種染料?？晒┻x擇但較不佳的是，用于凝膠的總蛋白染色劑包括考馬斯亮藍(lán)或銀染色劑，其使用的染色技術(shù)已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。用于印跡染色的可供選擇的總蛋白染色劑有SYPRORose Plus染料及DyeChromeTM染料或美國(guó)專(zhuān)利第6,329,205 B1號(hào)及美國(guó)專(zhuān)利第10/005,050號(hào)中揭示的任何一種染料溶液。
當(dāng)在雙向凝膠內(nèi)標(biāo)記磷酸化靶分子時(shí)，另一個(gè)非常重要的優(yōu)點(diǎn)是其中包括一糖蛋白染色劑，其中可以完成蛋白質(zhì)組的三維分析(Steinberg等人，Proteomics1841-855(2001))。一較佳的糖蛋白染色劑是Pro-QTMEmerald 300染料或Pro-QTMEmerald 488染料、Pro-QTMFuchsia染料或美國(guó)專(zhuān)利第09/970,215號(hào)中揭示的任何一種其它染料。另外，如果樣品中包含帶寡聚組氨酸親和肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，Pro-QTMSapphire 365或488染料同時(shí)可用于檢測(cè)這些蛋白質(zhì)或肽。
因此，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的功能特征兩者進(jìn)行平行檢測(cè)特別有利，例如蛋白質(zhì)磷酸化可以用本發(fā)明在雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中完成?？梢杂糜跋穹治鲕浖?lái)完成分析，例如Compugen’s Z3程序或Phoretix Progenesis軟件。任何兩個(gè)影像都可重新顯示，以通過(guò)目測(cè)觀察影像之間的區(qū)別，且定量分析信息可易于以表格形式檢索且其中已計(jì)算出不同的表達(dá)數(shù)據(jù)。
作為選擇，單向聚丙烯酰胺和相應(yīng)的印跡可以同時(shí)或相繼用上述染色技術(shù)及染料進(jìn)行總蛋白或糖蛋白染色。用本發(fā)明方法對(duì)已標(biāo)記的凝膠或印跡進(jìn)行復(fù)染的一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)是能將非特異性標(biāo)記和帶有少量磷酸根基團(tuán)的磷酸化靶分子的標(biāo)記物區(qū)別開(kāi)。這對(duì)于準(zhǔn)確地鑒別其磷酸化程度已發(fā)生較小變化的磷酸化靶分子很重要。
用總蛋白染色劑例如SYPRORuby對(duì)印跡或凝膠進(jìn)行復(fù)染可以對(duì)本發(fā)明染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)與總蛋白染色劑產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行參比分析(見(jiàn)圖11和實(shí)例22)。這種參比分析也允許確定磷酸化靶分子相對(duì)于分子總體磷酸化狀態(tài)的化學(xué)計(jì)量比以及增減磷酸根基團(tuán)。
對(duì)通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠分離的磷酸化蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行染色的另一突出優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)將使用本發(fā)明化合物的斑點(diǎn)檢測(cè)與質(zhì)譜分析技術(shù)聯(lián)合起來(lái)以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。例如，因?yàn)榱椎鞍卓稍谀z中共遷移，因此，可能必需或期望進(jìn)行進(jìn)一步的分析以便特異性鑒別和分析目標(biāo)磷蛋白。該進(jìn)一步分析可以通過(guò)測(cè)量一系列衍生自蛋白質(zhì)的肽的質(zhì)量來(lái)進(jìn)行，即用質(zhì)譜法(MS)分析肽譜圖，或者通過(guò)從單獨(dú)的肽得到氨基酸序列信息，即通過(guò)MS/MS或通過(guò)Edman降解法進(jìn)行蛋白質(zhì)定序。如此，使用本發(fā)明組合物及方法鑒別一蛋白質(zhì)帶或斑點(diǎn)后，就可在凝膠上進(jìn)行操作、漂洗、視需要還原和S-烷基化，然后通過(guò)序列特異性蛋白酶例如胰蛋白酶并采用標(biāo)準(zhǔn)程序在凝膠中原位消化，參見(jiàn)Shevchenko等人在Anal.Chem.63850-58(1996)中的描述。如此產(chǎn)生的肽混合物可從凝膠中提取并使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行MS分析。用介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化(MALDI)質(zhì)譜分析肽譜圖通常是最靈敏的。蛋白質(zhì)的凝膠內(nèi)消化方法闡述于Jensen等人之PROTEINSStructure，F(xiàn)unction，and Genetics Suppl.274-89(1998)中。
本發(fā)明亦可設(shè)計(jì)用于各種各樣的微陣列形式中，包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第2002/0076727號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第2002/0106785號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第2002/0055186號(hào)、WO 99/39210、WO 00/63701、WO 02/25288、WO 01/18545、WO 00/04380及美國(guó)專(zhuān)利第6,403,368號(hào)、第6,475,809號(hào)、第6,365,418號(hào)、第6,409,921號(hào)、第5,595,915號(hào)、第6,461,807號(hào)、第6,399,299號(hào)所揭示的方法和陣列。固定于微陣列(例如經(jīng)水凝膠包被的載片，包括那些在美國(guó)專(zhuān)利第6,372,813號(hào)、第6,391,937號(hào)、第6,387,631號(hào)、第6,413,722號(hào)所揭示的微陣列及那些由Perkin Elmer公司制造的微陣列)上的磷酸化靶分子亦可用本發(fā)明的方法和組合物來(lái)檢測(cè)(實(shí)例18和19)。作為選擇，磷酸根結(jié)合化合物亦可固定于這些陣列上。
用于檢測(cè)陣列上的磷酸化靶分子的本發(fā)明方法通常包含以下步驟i)將所述樣品固定在一陣列上；ii)用結(jié)合液接觸步驟i)的所述陣列；iii)將步驟ii)的所述陣列和結(jié)合液一起培育足夠時(shí)間以使所述化合物與所述磷酸化靶分子間接結(jié)合；及，iv)用合適的光源照射所述化合物，由此檢出所述磷酸化靶分子。
用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的技術(shù)將樣品固定于陣列上，包括但不限于，使用壓電陣列打印機(jī)或其它陣列打印技術(shù)；固定磷酸化靶分子；結(jié)合分子例如抗體；然后加入樣品以將磷酸化靶分子非共價(jià)結(jié)合到陣列上。陣列通常包含共價(jià)連結(jié)樣品的分子或能選擇性結(jié)合樣品的蛋白質(zhì)，例如胺反應(yīng)基。
將陣列與結(jié)合液培育足夠時(shí)間以在磷酸根結(jié)合化合物、金屬離子(通常為鎵)及磷酸化靶分子之間形成三元絡(luò)合物。作為選擇，此陣列可包含絡(luò)合有金屬離子(其固定在陣列表面上)的磷酸根結(jié)合化合物，其中將樣品與陣列一起培育，且當(dāng)靶分子結(jié)合金屬離子/磷酸根結(jié)合絡(luò)合物且通常照射時(shí)，未結(jié)合的樣品被洗除，磷酸化靶分子就可被檢測(cè)出來(lái)。以此方式，可使用合適的肽或蛋白質(zhì)底物進(jìn)行磷酸酶或激酶的檢測(cè)分析，產(chǎn)生的磷酸化或去磷酸化肽或蛋白質(zhì)可點(diǎn)樣或合成于陣列上，其中肽上的磷酸根基團(tuán)結(jié)合陣列上的磷酸根結(jié)合化合物/金屬離子絡(luò)合物。或者，將激酶及/或磷酸酶底物點(diǎn)樣或合成于陣列上，然后將酶(激酶(和ATP)或磷酸酶)添加到陣列上。在去除酶后，陣列和結(jié)合液接觸。以此方式，可使用陣列來(lái)檢測(cè)及/或分離磷酸化靶分子、鑒別負(fù)責(zé)向靶分子上添加及/或自靶分子上去除磷酸根基團(tuán)的酶及其工作效率。
磷酸酶及激酶的肽底物通常用標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)點(diǎn)樣或合成固定到陣列上，添加磷酸酶或激酶(其或可構(gòu)成一未知樣品或者是已分離的酶)并隨后用本發(fā)明的結(jié)合液來(lái)檢測(cè)磷酸根基團(tuán)的存在。如此，本發(fā)明的方法和結(jié)合液可用于例如含有各種蛋白質(zhì)激酶的蛋白質(zhì)底物的陣列上(例如，肌球蛋白輕鏈、MARCKS、髓鞘堿性蛋白、酪蛋白、受src抑制的C激酶底物、胰島素受體底物1、核因子90、Rap1、轉(zhuǎn)錄因子stat5a)。將包含磷酸酶或激酶的樣品與包含酶底物的陣列一起培育；在適宜條件下培育并加入適宜的酶反應(yīng)添加劑后，可用本發(fā)明的結(jié)合液來(lái)檢測(cè)磷酸化產(chǎn)物。例如，當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)記物是一熒光團(tuán)時(shí)，熒光信號(hào)的坐標(biāo)可提供流體中存在激酶的數(shù)量及其針對(duì)陣列上各種酶底物(蛋白質(zhì)或肽)的活性的讀數(shù)。用陣列檢測(cè)磷酸化靶分子可提供多種可能性，上文所述并非意欲限制本發(fā)明與陣列技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的方式。
本發(fā)明的激酶和磷酸酶分析也可用來(lái)篩選例如酪氨酸激酶的激活劑和抑制劑，另外，還可用來(lái)監(jiān)測(cè)及純化磷酸酶和激酶。而且，對(duì)陣列上酶底物的檢測(cè)使得本發(fā)明的方法比任何已知基于溶液的激酶和磷酸酶分析方法都要敏感得多，且使用熒光或化學(xué)發(fā)光進(jìn)行陣列上檢測(cè)比放射化學(xué)檢測(cè)允許更高的標(biāo)記密度。
如上所述，激酶底物可共價(jià)或非共價(jià)連結(jié)于一表面、固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)(包括微孔板)、聚合物珠?；蜿嚵?例如水凝膠陣列載片)上，且其分析允許以不連續(xù)的異相方式進(jìn)行。激酶底物包含一個(gè)激酶合意的磷酸化位點(diǎn)，以肽或不規(guī)聚合物為佳(聚(谷氨酸:酪氨酸)、聚(谷氨酸:丙氨酸:酪氨酸))。激酶底物視需要可包含熒光團(tuán)。一可能含有激酶的樣品和ATP一起與激酶底物結(jié)合，其中活性激酶就能將磷酸根加成到激酶底物上。去除激酶溶液并充分洗滌后，就可測(cè)量出加成的磷酸根基團(tuán)，其中如上所述結(jié)合液被加到激酶底物上。磷酸根結(jié)合化合物通常包含熒光團(tuán)，激酶活性通過(guò)照射熒光團(tuán)來(lái)測(cè)量?；蛘?，磷酸根結(jié)合化合物包含一種酶，如過(guò)氧化物酶，其中激酶活性在加入適宜酶底物并用熒光計(jì)或用來(lái)測(cè)定顏色或化學(xué)發(fā)光的儀器進(jìn)行檢測(cè)后就可測(cè)量出來(lái)。另外，在分析中使用選定激酶或磷酸酶的抑制劑(例如使用原釩酸鈉)可以增強(qiáng)激酶的特異性。而且，本發(fā)明的分析方法可用于篩選激酶及/或磷酸酶的激活劑或抑制劑。作為選擇，此分析方法還可很容易地應(yīng)用于測(cè)量磷酸酶的活性，其中磷酸酶底物、磷酸化肽或蛋白質(zhì)將結(jié)合到固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)例如微孔板、聚合物粒子或水凝膠上。
通過(guò)采用基于FRET的分析方法，本發(fā)明的材料和方法也可用于檢測(cè)及/或定量分析激酶或磷酸酶。例如，用熒光團(tuán)標(biāo)記的肽能與磷酸根結(jié)合化合物/金屬離子(通常為鎵)與藻紅素產(chǎn)生的絡(luò)合物結(jié)合。當(dāng)肽被磷酸化時(shí)，肽結(jié)合藻紅素，分析過(guò)程中發(fā)射光產(chǎn)生最大頻移。例如，通過(guò)在肽上采用以銪為主的螯合劑及磷酸根結(jié)合化合物/金屬離子與別藻藍(lán)蛋白產(chǎn)生的絡(luò)合物，可達(dá)成時(shí)間解析熒光分析。在這一實(shí)例中，給體熒光團(tuán)可在335納米處被激發(fā)，發(fā)射光從620納米頻移到665納米，顯示肽與金屬螯合劑及鎵絡(luò)合物間的互相作用。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，眾多酶(包括固氮酶、磷酸核糖基-焦磷酸鹽合成酶、焦磷酸十一碳二烯酯合成酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、法尼基轉(zhuǎn)移酶、三磷酸核苷焦磷酸脫水酶、焦磷酸鹽6-磷酸果糖1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(PFPPT)、硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(UGPP)、天冬酰胺合成酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶)皆涉及無(wú)機(jī)焦磷酸鹽的代謝，因此是本發(fā)明的定量分析方法的潛在目標(biāo)。
另外，本發(fā)明的方法及材料也可用于研究涉及配體覆蓋方法學(xué)的功能蛋白質(zhì)組學(xué)。例如，陣列化蛋白質(zhì)在與磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)膠粒一起培育后接著與結(jié)合液一起培育即可被檢測(cè)出來(lái)。標(biāo)記物的差異將會(huì)突出重要的磷脂酰肌醇苷結(jié)合蛋白質(zhì)類(lèi)別。蛋白質(zhì)例如SWI/SNF類(lèi)BAF、一種染色質(zhì)重構(gòu)建絡(luò)合物及cofilin/ADF、一種普遍存在的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)亦可能用本發(fā)明的方法來(lái)鑒別(Rando等人，ProcNatl Acad Sci USA 99(5)2824-9(2002)；Ojala等人，Biochemistry 40(51)15562-9(2001))。另一配體覆蓋分析的實(shí)例是GTP結(jié)合蛋白質(zhì)，其中少量的GTP結(jié)合蛋白質(zhì)可用高分辨率的雙向凝膠電泳分離，并隨后在復(fù)性條件下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上用GTP來(lái)探測(cè)。于是結(jié)合的GTP隨后將與本發(fā)明的結(jié)合液結(jié)合，因而可鑒別GTP結(jié)合蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明的結(jié)合液可進(jìn)行各種其它的膜覆蓋核苷結(jié)合分析，其中任何配體及結(jié)合蛋白質(zhì)(其中至少該對(duì)中的一個(gè)含有磷酸根基團(tuán))皆存在可用于鑒別新穎結(jié)合蛋白質(zhì)的潛在可能性(Gromov等人，Electrophoresis(1994)3-4478-81)。
與將磷酸化靶分子或磷酸根結(jié)合化合物固定相比，本發(fā)明的組合物和方法也可用于結(jié)合、檢測(cè)及分離那些游離存在于溶液中的磷酸化靶分子。將一可能含有磷酸化靶分子的樣品與包含經(jīng)熒光染料標(biāo)記的磷酸根結(jié)合化合物的結(jié)合液一起培育，其中磷酸化靶分子通過(guò)熒光偏振來(lái)檢測(cè)(實(shí)例14)))。熒光偏振基于發(fā)現(xiàn)了熒光團(tuán)發(fā)出的光可以通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)散射而去偏振或基于分子在溶液中的碰撞速率，參見(jiàn)J.Phys.Rad.1390-401(1926)。因此，當(dāng)檢測(cè)溶液中的磷酸化靶分子時(shí)，本發(fā)明的化合物及方法涵蓋利用熒光偏振，如美國(guó)專(zhuān)利第6,207,397號(hào)所述。當(dāng)經(jīng)熒光染料標(biāo)記的磷酸根結(jié)合化合物的分子量由于結(jié)合磷酸化靶分子而發(fā)生變化時(shí)，例如磷蛋白，可根據(jù)是否觀察到偏振發(fā)生變化來(lái)檢測(cè)磷酸化靶分子，如圖10所示。
出人意料地，當(dāng)將較高濃度的疏水性較強(qiáng)的磷酸根結(jié)合化合物(例如化合物5)用于含有基本上等摩爾濃度的金屬離子的溫和酸性環(huán)境中時(shí)，磷酸化靶分子(通常是肽)亦可利用三元絡(luò)合物不溶特性而從絡(luò)合物溶液中分離出來(lái)。
用于將磷酸化靶分子自溶液中分離出來(lái)的本發(fā)明方法包含以下步驟i)用本發(fā)明的結(jié)合液接觸樣品；ii)將步驟i)的樣品與結(jié)合液一起培育足夠時(shí)間以使所述化合物與磷酸化靶分子結(jié)合形成三元絡(luò)合物；及，iii)從所述樣品中分離所述絡(luò)合物，由此分離出所述磷酸化靶分子。
當(dāng)本發(fā)明的疏水性磷酸根結(jié)合化合物在結(jié)合液中的濃度較檢測(cè)用結(jié)合液高出一百倍時(shí)，形成的三元絡(luò)合物通常為不溶團(tuán)聚物。某些疏水性磷酸根結(jié)合化合物的這一特性可用于開(kāi)發(fā)分離磷酸肽的方法。因此，當(dāng)以一種可促進(jìn)三元絡(luò)合物形成的方式將一包含某些疏水性磷酸根結(jié)合化合物的結(jié)合液與樣品一起培育時(shí)，該絡(luò)合物可通過(guò)離心從溶液中沉淀出來(lái)(實(shí)例13)。因此，以渦旋方式或以熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的方式混合該結(jié)合混合物及樣品溶液通?？赏瑫r(shí)促進(jìn)結(jié)合(形成團(tuán)聚物)和防止三元絡(luò)合物沉淀。當(dāng)絡(luò)合物形成后，對(duì)溶液進(jìn)行適當(dāng)處理以分離沉淀絡(luò)合物，其中較佳的方法是離心。所得沉淀物中包含磷酸化靶分子，可用諸如MS等方法進(jìn)一步分析。這種方法利用了絡(luò)合物溶液中磷酸肽或磷蛋白的親和力“下降”(例如細(xì)胞提取物蛋白質(zhì)消化)，由此，在一酸性pH下磷酸根結(jié)合化合物可絡(luò)合金屬(通常為鎵)離子及磷酸肽或磷蛋白以形成沉淀。另外，對(duì)于從溶液中沉淀磷酸化靶分子的方法來(lái)說(shuō)，亦可使用鋁離子和包含鐵離子的氯化鐵來(lái)形成三元絡(luò)合物。
本發(fā)明亦涵蓋在形成團(tuán)聚物后對(duì)磷酸化靶分子的進(jìn)一步分離，其中磷酸根結(jié)合化合物自磷酸化靶化合物中去除，因而溶液中不含磷酸根結(jié)合化合物。此當(dāng)磷酸根結(jié)合化合物視需要包含一標(biāo)記物例如半抗原時(shí)亦可實(shí)施，其中標(biāo)記物起把柄的作用，通過(guò)其可將磷酸根結(jié)合化合物從磷酸化靶分子中拉出來(lái)。較佳標(biāo)記物是生物素，其中含有生物素-結(jié)合蛋白的基質(zhì)可用作從磷酸化靶分子中分離磷酸根結(jié)合化合物的介質(zhì)。具體而言，將所得沉淀物重懸于溶劑中以使金屬離子、磷酸根結(jié)合化合物及磷酸化靶分子絡(luò)合物解離，例如在一堿性溶液中(大約pH 7到10)或通過(guò)使用螯合劑例如EDTA或EGTA。然后將溶液加入到基質(zhì)中，例如含結(jié)合有生物素-結(jié)合蛋白的瓊脂糖凝膠(Sepharose)珠粒的管柱，其中含有生物素的磷酸根結(jié)合化合物結(jié)合到該等珠粒上，磷酸化靶分子流過(guò)管柱。得到的洗脫物含有磷酸化靶分子而沒(méi)有磷酸根結(jié)合化合物，這對(duì)于某些應(yīng)用來(lái)說(shuō)也許是期望的。或者，將磷酸根結(jié)合化合物、金屬離子及磷酸化靶分子的解離混合物與含有生物素-結(jié)合蛋白的漿狀珠粒一起培育，其中珠粒通過(guò)重力去除，例如通過(guò)大小排除或離心，可得到不含磷酸根結(jié)合化合物的磷酸化靶分子溶液。用于形成可沉淀三元絡(luò)合物的較佳化合物包括化合物2、化合物5、化合物9、化合物12、化合物20、化合物21及化合物22。
在某些情況下，磷酸根結(jié)合化合物不需要親和純化即可與磷酸化靶分子上去除。以此方式，三元絡(luò)合物團(tuán)聚物與有機(jī)提取緩沖液接觸(實(shí)例27)。將沉淀物與有機(jī)溶劑例如乙腈、氯仿及水混合可使磷酸化肽進(jìn)入水相，而磷酸根結(jié)合化合物溶于有機(jī)相中。
已分離的磷酸化靶分子可通過(guò)多種方法來(lái)分析，包括但不限于，凝膠電泳、MALDI-TOF MS、或LC-MS/MS。另外，如下所述，磷酸肽可通過(guò)β-消去作用得到，并隨后加入親核劑以幫助鑒別磷酸化位點(diǎn)。
除了從溶液中的復(fù)合樣品中分離磷酸化靶分子外，本發(fā)明也涵蓋通過(guò)用固定的磷酸根結(jié)合化合物捕獲磷酸化靶分子來(lái)分離靶分子(實(shí)例15、實(shí)例25及實(shí)例26)。這可以用多種方式進(jìn)行，例示性方法包括例如使用親和管柱、鐵磁流體珠粒及膜；但是，所闡述的這些方法并非意欲限制該方法。
通過(guò)用固定磷酸根結(jié)合化合物來(lái)磷酸化靶分子自溶液中分離出來(lái)的本發(fā)明方法通常包含以下步驟i)將一種包含金屬離子的鹽添加于包含固定磷酸根結(jié)合化合物的基質(zhì)中，其中金屬螯合物部分包含式IV；ii)用溫和酸性結(jié)合緩沖液平衡此基質(zhì)；iii)將樣品加入基質(zhì)中，其中磷酸化靶分子結(jié)合到步驟ii)的基質(zhì)上；及iv)從基質(zhì)中洗脫磷酸化靶分子，由此分離所述磷酸化靶分子。
基質(zhì)可以是熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所知的任何基質(zhì)，包括聚合物膜、聚合物粒子例如瓊脂糖、乳膠、磁性珠?；颦傊侵榱！⒓安ＡЮ巛d片、珠?；蚬饫w。這些珠?？梢詽{液形式存在或作為填充管柱，當(dāng)樣品通過(guò)此管柱時(shí)膜將會(huì)捕獲磷酸化靶分子。此類(lèi)管柱的一個(gè)實(shí)例是包含結(jié)合到瓊脂糖上的磷酸根結(jié)合化合物的親和基質(zhì)(例如，化合物13和化合物14)或樹(shù)脂(固定親和管柱(IMAC))?？捎糜诖朔椒ǖ钠渌衔镞€包括化合物15、化合物20、化合物21及化合物22。
與沉淀法(其中親和管柱或有機(jī)提取緩沖液可用于從已分離的磷酸化靶分子中去除磷酸根結(jié)合化合物)不同，該方法中的基質(zhì)視需要可只包含磷酸根結(jié)合化合物的金屬螯合部分組份，其于金屬鹽加入后可隨后結(jié)合金屬離子(鎵較佳)。但是，用式(A)m(L)n(B)表示的磷酸根結(jié)合化合物會(huì)形成基質(zhì)，其中A是用于通過(guò)L將B連結(jié)到基質(zhì)材料上的反應(yīng)基。因此，應(yīng)在加入樣品之前將金屬離子添加于基質(zhì)中。然后用溫和的酸性結(jié)合緩沖液來(lái)平衡基質(zhì)；作為選擇，金屬離子和酸性結(jié)合緩沖液可存在于同一溶液中。酸性結(jié)合緩沖液通常與結(jié)合液使用相同的組份。然后將酸性結(jié)合緩沖液中的樣品加入到混合液中，此時(shí)磷酸化靶分子將結(jié)合絡(luò)合于金屬螯合部分上的金屬離子。磷酸化靶分子的分離通過(guò)加入一溶液來(lái)完成，該溶液可解離磷酸根結(jié)合化合物(金屬螯合部分)、金屬離子及磷酸化靶分子所形成的三元絡(luò)合物。較佳地，洗脫液包含一堿及一堿性pH緩沖劑。可用的堿包括但不限于氫氧化鋇、氫氧化鈉及氫氧化銨。作為選擇，堿性氨水溶液也用作洗脫劑。任何一種可與樣品及金屬離子磷酸化靶分子絡(luò)合物相容并能解離該絡(luò)合物的堿皆較佳。另外，有機(jī)溶劑例如乙腈可用于從磷酸根結(jié)合化合物基質(zhì)中洗脫磷酸化靶分子，而且可能是一較佳的溶劑，這要根據(jù)隨后對(duì)磷酸化靶分子進(jìn)行的分析方法而定，例如用MS。
由于許多磷酸化靶分子通常僅以低豐度存在，因此，本發(fā)明分離方法對(duì)純化和富集此等磷酸化靶分子而言特別有用。這些方法可用于從肽的粗品混合物中純化磷酸化肽，這對(duì)隨后通過(guò)MALDI、MS或奈電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS/MS)來(lái)分析肽所用的方法而言非常有利。本發(fā)明涵蓋可使用各種各樣的方法來(lái)制備通過(guò)親和基質(zhì)純化及/或富集的樣品或從復(fù)合溶液中分離的樣品。例如，干燥的已分離磷酸肽可重新懸浮于水中以進(jìn)行LC-MS分析。
本發(fā)明中的IMAC法也易于適應(yīng)微流體應(yīng)用，例如由Gyros AB(Uppsula，瑞典)開(kāi)發(fā)的CD技術(shù)，其中可對(duì)樣品進(jìn)行高通量篩選以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，例如用MALDI-TOF獲得肽譜圖。簡(jiǎn)單地說(shuō)，Gyros AB技術(shù)包含一帶有數(shù)百個(gè)微結(jié)構(gòu)(管柱)的CD微試驗(yàn)室，其中樣品以離心速度通過(guò)管柱且洗脫樣品在CD上分析，使得從蛋白消化到MS分析的整個(gè)過(guò)程都在CD上進(jìn)行。管柱中可充填有包含BAPTA化合物(化合物13或化合物14)的微粒；然后樣品可流過(guò)管柱，并通過(guò)熒光或化學(xué)光信號(hào)來(lái)分析磷酸化肽的濃度或施加于CD上的基質(zhì)上進(jìn)行MALDI-TOF分析。因此，本發(fā)明方法適用于可對(duì)樣品進(jìn)行高通量篩選的微流體應(yīng)用，這有利于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
因此，本發(fā)明提供了可與基于質(zhì)譜分析的方法一同使用的分析試劑和方法，以便對(duì)混合物中的磷蛋白或磷酸肽進(jìn)行快速及定量分析。該等試劑和方法可用于檢測(cè)和鑒別蛋白質(zhì)樣品混合物中的蛋白質(zhì)，其中以此方法分離出肽可表征混合物中存在蛋白質(zhì)。分離出的肽或蛋白質(zhì)可通過(guò)質(zhì)譜(MS)技術(shù)及通過(guò)應(yīng)用序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索技術(shù)(用于鑒別產(chǎn)生已測(cè)序肽的蛋白質(zhì))來(lái)定性。
下列引文是質(zhì)譜技術(shù)用于鑒別蛋白質(zhì)的實(shí)例，可與本發(fā)明的材料及方法一起應(yīng)用Ideker等人，Science 292929-934(2001)；Gygi及Aebersold，Curr.Opin.Biotechnol.11396-401(2000)；Goodlett等人，Anal.Chem.721112-8(2000)；Goodlett等人.，Rapid.Commun.Mass.Spectrom.14344-8(2000)；McLachlin及Chalt，Current Opin.Chem.Biol.5591-602(2001)；Aebersold及Goodlett，Chem.Rev.101269-295(2001)；Vener等人，J.Biol.Chem.2766959-66(2001)；Zhou等人，Nature Biotechnol.19375-8(2001)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者將認(rèn)識(shí)到，這些目前可用的質(zhì)譜方法與本發(fā)明的原料及方法相容。然而，本發(fā)明亦涵蓋，本發(fā)明的材料及方法可與將來(lái)可用且能夠獲得相同或相似結(jié)果的質(zhì)譜分析技術(shù)一起應(yīng)用。另外，本發(fā)明涵蓋，在檢測(cè)之前可使磷酸肽通過(guò)反相、正相或離子交換管柱，以從磷酸肽樣品中去除不期望的材料。
本發(fā)明亦涵蓋替代的檢測(cè)、純化及/或富集的方法。例如，本發(fā)明的材料及方法可與Luminex技術(shù)一起應(yīng)用，此Luminex技術(shù)涉及用兩種熒光團(tuán)來(lái)標(biāo)記乳膠微珠(美國(guó)專(zhuān)利第5,981,180號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利第6,268,222號(hào))。使用兩種熒光團(tuán)的精確比率可以根據(jù)兩種染料比率產(chǎn)生的色碼來(lái)制造多組不同的珠粒，每一組都獨(dú)一無(wú)二且可用激光束區(qū)分開(kāi)。本發(fā)明的金屬螯合劑，即磷酸根結(jié)合化合物及金屬離子絡(luò)合物或可結(jié)合經(jīng)生物素標(biāo)記的磷酸根結(jié)合化合物的生物素結(jié)合蛋白質(zhì)，可用于代替針對(duì)聯(lián)結(jié)到特定組珠粒上的特定分子的捕獲抗體。然而，可使用結(jié)合樣品的抗體，且磷酸化靶分子可用本發(fā)明的結(jié)合液檢測(cè)。例如，當(dāng)分析物與珠粒上的金屬-螯合劑絡(luò)合物結(jié)合后，一聯(lián)結(jié)到藻紅素上的探測(cè)抗體可用作報(bào)道分子。最后結(jié)果是在經(jīng)顏色標(biāo)記的微珠上進(jìn)行抗體/金屬螯合劑夾層分析。當(dāng)珠粒和報(bào)道分子通過(guò)一流動(dòng)單元時(shí)，可以通過(guò)使用雙激光系統(tǒng)的Luminex 100儀器來(lái)讀取其讀數(shù)。一束激光用于檢測(cè)珠粒，另一束激光用于檢測(cè)報(bào)道信號(hào)。因此，本發(fā)明涵蓋，金屬螯合絡(luò)合物可用以代替探測(cè)抗體與珠粒檢測(cè)一起用于磷酸化靶分子的分離及檢測(cè)。
或者，用于自動(dòng)化珠粒及微粒捕獲系統(tǒng)的磁性珠粒分離(例如，通過(guò)Dexter磁性技術(shù)或捕獲鐵磁流體(Molecular Probes公司)的LifeSep磁性珠粒)也可使用本發(fā)明的材料和方法(美國(guó)專(zhuān)利第6,413,420號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第08/868,598號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20020117451號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第4,339,337號(hào)及美國(guó)專(zhuān)利第5,834,121號(hào))或鐵磁流體珠粒(實(shí)例27)。磁性分離通過(guò)連結(jié)到微小磁性珠粒上的特定親和涂層(例如磷酸根結(jié)合化合物)來(lái)運(yùn)作。珠粒與含有磷酸化靶分子的樣品混合，以便磷酸化靶分子有機(jī)會(huì)牢固地與珠粒上的金屬離子/磷酸根結(jié)合化合物相結(jié)合。當(dāng)其連結(jié)后，珠粒與三元絡(luò)合物就可通過(guò)強(qiáng)磁場(chǎng)分離。根據(jù)所用方法的不同，可以使磷酸化靶分子仍然與珠粒相結(jié)合或通過(guò)在合適溶劑或堿性緩沖液中沖洗而將其釋放。因此，可進(jìn)行有效和快速的分離。因此，本發(fā)明涵蓋，磷酸根結(jié)合化合物/金屬離子絡(luò)合物可與眾所周知的磁性珠粒分離法一起應(yīng)用。
因此，本發(fā)明提供了各種各樣的材料及方法用于分離、提純及富集磷酸化靶分子，包括一種固定親和基質(zhì)的新穎用途。
本發(fā)明提供了可對(duì)磷酸化絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸進(jìn)行示差分離及鑒別的化合物及方法。當(dāng)缺乏質(zhì)譜或其它相似技術(shù)時(shí)，上述用于標(biāo)記及分離磷酸化靶分子的材料及方法一般可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化，但不能給出磷酸根在蛋白質(zhì)或肽上的特定位點(diǎn)的信息。本發(fā)明涵蓋，可對(duì)通過(guò)上述固定親和基質(zhì)或沉淀方法分離的磷酸化蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行進(jìn)一步分析，以便示差鑒別磷酸化肽。分離的磷酸化蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白水解消化后，接著進(jìn)行酸水解或堿水解，然后進(jìn)行分析。
堿(例如氫氧化鋇或氫氧化鈉)可催化肽的去磷酸化作用，形成活性脫氫丙氨酸衍生物，該等衍生物易受胺或含硫醇化合物的攻擊，因而可形成原始磷酸肽的穩(wěn)定衍生物。這些衍生物更具疏水性，因此更易于通過(guò)HPLC、質(zhì)譜或Edman測(cè)序法進(jìn)行鑒別。在所用條件下，磷酸絲氨酸殘基經(jīng)歷消去及加成反應(yīng)，磷酸蘇氨酸殘基經(jīng)歷消去反應(yīng)但未經(jīng)歷加成反應(yīng)，磷酸酪氨酸殘基在處理中無(wú)變化。因此，基于此了解可完成示差鑒別。在Edman降解中，在酸或堿傳遞過(guò)程中，磷酸根被β-消去反應(yīng)消除，得到的脫水氨基酸迅速形成二硫蘇糖醇(DTT)加合物，參見(jiàn)Meyer等人在FASEB J.7776(1993)中的描述。相反，絲氨酸及蘇氨酸上的O-Hex-N-Ac在Edman降解中很穩(wěn)定，參見(jiàn)Gooley及Williams在Nature 358557(1997)中的描述。因此，本發(fā)明可用于區(qū)分絲氨酸或蘇氨酸之間的磷酸化和糖基化作用。
因此，在β-消去反應(yīng)和衍生反應(yīng)之后進(jìn)行Edman降解是一種有效的絲氨酸和蘇氨酸定量分析方法，參見(jiàn)Yan等人在J.Chromatogr.80823-41(1998)中的描述。這些修飾后的產(chǎn)物亦可耐受酸水解，且可通過(guò)反相HPLC分析來(lái)進(jìn)行定量分析，參見(jiàn)例如Meyer等人在J.Chromatogr.397.113(1987)中及Holmes在FEBS Lett.21521(1987)中的描述。用同樣的方法，通過(guò)毛細(xì)管區(qū)帶電泳及激光誘導(dǎo)的熒光進(jìn)行定性亦已用于定量分析肽和蛋白質(zhì)中的磷酸絲氨酸含量，參見(jiàn)Fadden及Haystead在Anal.Biochem.22581(1995)中的描述。
使用奈電噴霧MS/MS方法對(duì)磷酸肽進(jìn)行定序可準(zhǔn)確確定磷酸化位點(diǎn)，參見(jiàn)Stensballe等人在Proteomics 1207-222(2001)中的描述。如Shevchenko等人在Anal.Chem.68850-58(1996)中及Jensen等人在Meth.Mol.Biol.112513-30(1998)中所述，可在凝膠內(nèi)進(jìn)行消化。本發(fā)明亦涵蓋，本發(fā)明的原料和方法可用于將來(lái)可用且能夠達(dá)到相同效果的質(zhì)譜技術(shù)。
將串聯(lián)質(zhì)譜分析和計(jì)算機(jī)輔助的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序聯(lián)合起來(lái)可以進(jìn)行磷酸肽序列測(cè)定及磷酸化位點(diǎn)鑒定，例如一種此聯(lián)合為SEQUEST(商標(biāo)，University of Washington，Seattle WA)(McCormack等人，Anal.Chem.69767-776(1996)；Eng等人，J.Amer.Soc.Mass.Spectrom.5976-989(1994)；美國(guó)專(zhuān)利第5,538,897號(hào))。盡管可使用各種MS方法且其可用于這些方法中，但通常采用MALDI/MS及電噴霧電離MS(ESI/MS)方法。
2.樣品制備樣品被定義為包括任何可能含有磷酸化靶分子的材料、與激酶及磷酸酶相互作用的底物和與激酶及磷酸酶底物相互作用的物質(zhì)以及任何可結(jié)合磷酸化靶分子的物質(zhì)。樣品通常來(lái)源于生物，包含組織、單細(xì)胞或細(xì)胞群、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿、純化或重建蛋白質(zhì)、重組蛋白、融合蛋白、體液或其他生物流體、病毒或病毒粒子、朊病毒、亞細(xì)胞組份或合成肽或蛋白質(zhì)。用于制備本發(fā)明樣品的可能細(xì)胞材料來(lái)源包括但不限于植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、古生菌或源自這些生物的細(xì)胞系。樣品可以是一種生物流體，例如全血、血漿、血清、鼻粘液、痰液、唾液、尿液、汗液、經(jīng)皮滲出液、腦脊髓液或諸如此類(lèi)。或者，樣品可以是來(lái)自動(dòng)物的整個(gè)器官、組織或細(xì)胞。此等樣品來(lái)源的實(shí)例包括肌肉、眼睛、皮膚、生殖腺、淋巴結(jié)、心臟、腦、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、實(shí)體瘤、巨噬細(xì)胞、間皮及諸如此類(lèi)。
在與本發(fā)明的結(jié)合液結(jié)合之前，樣品應(yīng)通過(guò)適當(dāng)方法處理，以使樣品中的磷酸化靶分子或酶底物易于接近磷酸根結(jié)合化合物。作為選擇，樣品可以包含與磷酸化靶分子相互作用的酶或結(jié)合蛋白。本發(fā)明中使用的樣品通常包括組織、細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿、純化或重建蛋白質(zhì)、肽、重組蛋白、生物流體、脂類(lèi)、氨基酸、核酸以及碳水化合物或合成蛋白質(zhì)。但是，由于存在其它單獨(dú)生物組份，因此在加入結(jié)合液之前可能需要對(duì)預(yù)期目標(biāo)(包含暴露磷酸根基團(tuán)的靶分子)進(jìn)行純化或分離。在使用本發(fā)明方法的過(guò)程中，預(yù)期的磷酸化靶分子和其它單獨(dú)生物組份視需要可以根據(jù)遷移率(例如電泳凝膠或毛細(xì)管)、根據(jù)大小(例如離心、沉淀或密度梯度)或根據(jù)結(jié)合親和力(例如對(duì)濾膜或親和樹(shù)脂的親和力)彼此分離或與樣品中的其他組份分離。例如，當(dāng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離樣品時(shí)，樣品應(yīng)首先在適當(dāng)?shù)木彌_液中平衡，如含有Tris、甘油、DTT、SDS及溴酚藍(lán)的SDS-樣品緩沖液。對(duì)本發(fā)明的某些方面來(lái)說(shuō)，在分析前不分離磷酸化靶分子較佳。
若開(kāi)始時(shí)使用不適于分離的樣品來(lái)源，例如全細(xì)胞或組織勻漿，則樣品需要首先用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的技術(shù)進(jìn)行處理。樣品的制備將根據(jù)樣品中含有磷酸化靶分子情況的不同而不同(參見(jiàn)例如Current Protocols in Molecular Biology；Herbert，Electrophoresis 20660-663(1999))。
樣品中的磷酸化肽和蛋白質(zhì)通常具有大于約500道爾頓的分子量。更佳地，磷酸化肽和蛋白質(zhì)的分子量大于800道爾頓。在本發(fā)明的一方面，磷酸化蛋白質(zhì)構(gòu)成一具有不同分子量(該等分子量處于一分子量范圍內(nèi))的磷酸化蛋白質(zhì)的混合物，其中以這些磷酸化蛋白質(zhì)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，以便精確分析經(jīng)標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)或肽。包含適用于本發(fā)明方法的磷酸化肽的樣品可以由天然或合成樣品產(chǎn)生，且可以是磷酸化蛋白質(zhì)樣品經(jīng)化學(xué)、物理或酶消化后的結(jié)果。蛋白質(zhì)可以用任何合適的酶促方法消化，如胰蛋白酶消化。在消化中較佳可將肽的大小消化到便于用串聯(lián)質(zhì)譜方法來(lái)進(jìn)行肽定序，肽的長(zhǎng)度范圍通常為大約10到約50個(gè)氨基酸。或者，這些肽亦可在本發(fā)明方法中作為磷酸酶底物，以鑒別此等酶并測(cè)量其數(shù)量及/或酶活性。
與含有磷蛋白的樣品相比，包含磷脂的樣品(其中磷脂為靶分子)因其疏水性而需要在加到固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)之前通過(guò)修飾作用來(lái)制備。大部分樣品通常需要在結(jié)合到本發(fā)明組合物上和實(shí)施本發(fā)明方法之前進(jìn)行某種提取處理。當(dāng)目標(biāo)磷酸化靶分子來(lái)源于組織樣品或來(lái)源于具有細(xì)胞壁的生物體樣品時(shí)，可能需要進(jìn)行機(jī)械或化學(xué)破碎。合適的方法已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知，其包括但不限于，使用組織勻漿機(jī)或法式細(xì)胞破碎機(jī)與例如有機(jī)溶劑萃取聯(lián)合。細(xì)胞破碎及分級(jí)方法闡述于Ausubel等人之CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley及Sons 1997)中。樣品可使用具有各種疏水性的溶劑萃取，最佳溶劑應(yīng)根據(jù)目標(biāo)磷酸化靶分子的性質(zhì)而定。本發(fā)明涵蓋那些可使樣品適合檢測(cè)的此項(xiàng)技術(shù)中常用的萃取方法。
磷酸化靶分子(蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或脂類(lèi))通常存在于一種固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)之上或之內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，這種基質(zhì)包含電泳介質(zhì)，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、線型聚丙烯酰胺溶液、聚乙烯醇凝膠或一種水凝膠。這種固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)也可以包含一種膜，如過(guò)濾膜、硝酸纖維素膜、聚(偏二氟乙烯)(PVDF)膜或尼龍膜，其中磷酸化靶分子可通過(guò)印跡、點(diǎn)布、電印跡(半干印跡轉(zhuǎn)移槽)、毛細(xì)管印跡或熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的其它應(yīng)用方法固定于此膜上。根據(jù)本發(fā)明，固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)還包括載玻片、塑料基質(zhì)(例如多孔板或點(diǎn)樣針)、玻璃珠?；蚓酆衔镏榱；蚬饫w或半導(dǎo)體材料。磷酸化靶分子可以按照一規(guī)則圖案或隨機(jī)排列于載體上。本發(fā)明之一較佳陣列是水凝膠載玻片載體，其中樣品中的磷酸化靶分子是按照一規(guī)則圖案進(jìn)行排列的。本發(fā)明涵蓋，磷酸化靶分子可在固定于基質(zhì)材料上后磷酸化，其中固定一種酶底物，并將合適的酶及磷酸鹽與固定的底物一同培育。對(duì)本發(fā)明的某些方面而言，較佳地，磷酸化靶分子不存在于固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上，即不經(jīng)固定而是作為溶解分子存在于水性溶液中。
3.照射在典型的檢測(cè)方法中，在樣品與本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物結(jié)合后或結(jié)合期間的任何時(shí)間均能觀察到樣品，由此可檢測(cè)出磷酸化靶分子。觀察可包括不同方法，且視共價(jià)連結(jié)到磷酸根結(jié)合化合物的金屬螯合部分上的化學(xué)部分A而定。當(dāng)化學(xué)部分A是一標(biāo)記物時(shí)，觀察通常包含在能激發(fā)試劑的光波長(zhǎng)下進(jìn)行照射以產(chǎn)生上文定義的可檢測(cè)光響應(yīng)，并通過(guò)一能夠檢測(cè)出該光響應(yīng)的儀器來(lái)觀察。用于照射本發(fā)明的磷酸根結(jié)合化合物的設(shè)備包括但不限于手持式紫外燈、汞弧燈、氙燈、激光和激光二極管。這些光源視需要可整合于激光掃描儀、熒光小平板讀數(shù)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)或微量熒光計(jì)或色譜檢測(cè)儀中。與標(biāo)準(zhǔn)或預(yù)期的響應(yīng)相比較后所得的結(jié)合程度及/或位置可表明該樣品是否具有一給定特征即磷酸化靶分子以及所具有的程度。
光響應(yīng)視情況可通過(guò)目測(cè)或通過(guò)使用CCD照相機(jī)、錄像機(jī)、照相膠片、激光掃描裝置、熒光計(jì)、光電二極管、量子計(jì)數(shù)器、落謝熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、熒光小平板讀數(shù)計(jì)中的任一種裝置來(lái)檢測(cè)或者通過(guò)放大信號(hào)的方法(例如光電倍增管)來(lái)檢測(cè)。
對(duì)可檢測(cè)光響應(yīng)可進(jìn)行定量分析且其可用于測(cè)量樣品混合物中磷酸化靶分子的磷酸化程度。定量分析通常通過(guò)將此光響應(yīng)與一已制備好的標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)定曲線相比較來(lái)進(jìn)行。所測(cè)量的光響應(yīng)通常與電泳凝膠中、水凝膠中或一膜上已知濃度的磷酸化靶分子經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)稀釋后得到的光響應(yīng)進(jìn)行比較。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)期望得到精確的測(cè)量結(jié)果時(shí)應(yīng)繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。作為選擇，標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過(guò)用已標(biāo)準(zhǔn)化的參照染料或染色粒子與期望的試劑-靶反應(yīng)物共軛物相比較而產(chǎn)生。
或者，可使用經(jīng)染色的電泳凝膠來(lái)分析復(fù)合樣品混合物的組成及測(cè)定樣品中特定磷酸化靶分子的相對(duì)量。這可以通過(guò)(例如)結(jié)合分子上磷酸根基團(tuán)與總蛋白染色劑的確定來(lái)完成，其中此總蛋白染色劑用于區(qū)分蛋白質(zhì)數(shù)量的增加與特定蛋白質(zhì)或肽上磷酸根基團(tuán)的增加。
經(jīng)感應(yīng)耦合的電漿質(zhì)譜儀(ICP-MS)對(duì)于環(huán)境樣品、生物樣品以及藥物樣品的痕量元素分析而言是一種有用的技術(shù)。最近，用激光燒蝕ICP-MS技術(shù)直接測(cè)量自β-酪蛋白釋放的m/z為31的磷信號(hào)的可行性已在電印跡膜上得到證實(shí)(Marshall，P.等人，Analyst 127459-461(2002))。雖然可在印跡上檢測(cè)出16皮摩爾的五磷酸化蛋白質(zhì)，但由于本底信號(hào)非常高，故這一技術(shù)不能在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。這無(wú)疑是由于同質(zhì)異位物質(zhì)的存在及產(chǎn)生于聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的相鄰物質(zhì)和電泳緩沖液成份的重疊所致。低濃度磷檢測(cè)對(duì)ICP-MS提出若干分析方面的挑戰(zhàn)，因?yàn)榈蜐舛攘自跉錓CP中的離子化很差，而且在質(zhì)量為31(15N16O及14N16O1H)時(shí)存在對(duì)多原子物質(zhì)的直接干擾及在質(zhì)量為32(16O2及32S)時(shí)存在對(duì)對(duì)多原子物質(zhì)的間接干擾。ICP-MS可用于檢測(cè)用本發(fā)明方法染色的磷蛋白。檢測(cè)程序預(yù)期包括以下步驟首先，固定經(jīng)凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)以去除SDS。一種典型的固定液為40％甲醇/10％乙酸。其次，用本發(fā)明方法對(duì)凝膠磷蛋白進(jìn)行染色。接著，洗去凝膠上過(guò)多的染色劑。這時(shí)較為主要的磷蛋白就可通過(guò)熒光成像觀察到，而本底染色可通過(guò)檢查及適當(dāng)調(diào)節(jié)洗滌次數(shù)而減到最低。然后完全干燥凝膠，并用類(lèi)似于Marshall等人(2002)所述的方法以激光燒蝕ICP-MS來(lái)處理該凝膠。取樣可經(jīng)單點(diǎn)或多點(diǎn)分析、直線掃描或光柵分析完成。倘若采用光柵分析，則可使用如LooRR等人(Anal Chem.734063-70(2001))所述獲得的數(shù)據(jù)來(lái)構(gòu)建虛擬凝膠。使用含有釕的SYPRORuby染料染色技術(shù)可對(duì)來(lái)自磷蛋白染色劑的鎵(鋁或鐵)信號(hào)及來(lái)自總蛋白染色劑的釕信號(hào)獨(dú)立進(jìn)行定量分析。
因此，本發(fā)明涵蓋可使用各種各樣的儀器來(lái)檢測(cè)磷酸化靶分子，例如，電噴霧離子化(ESI)串聯(lián)質(zhì)譜分析(MS/MS)技術(shù)。一系列不同的技術(shù)，包括自動(dòng)化高效液相色譜(HPLC)-MS/MS、毛細(xì)管-HPLC-MS/MS以及固相提取(SPE)-毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)-MS/MS，皆在Figeys等人的文章(Electrophoresis 191811-1818(1998))中有描述。
當(dāng)測(cè)量熒光偏振時(shí)，有多種自動(dòng)化測(cè)量方式可供選用且其已為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知。作為一實(shí)例，任何一臺(tái)為偏振試驗(yàn)或測(cè)量而配備的標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)皆可用于實(shí)施本發(fā)明的該實(shí)施例，以照射混合物并測(cè)量偏振。如上所述，適合于激發(fā)熒光團(tuán)的波長(zhǎng)取決于熒光團(tuán)的特性。通常，人們用截止濾波器來(lái)確定波長(zhǎng)范圍，其通過(guò)熒光團(tuán)的激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)決定。例如，對(duì)經(jīng)熒光素標(biāo)記的肽，人們通常使用485納米的激發(fā)截止過(guò)濾器?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)，或例如使用熒光平板讀數(shù)計(jì)。因而，熟習(xí)自動(dòng)化技術(shù)者還可根據(jù)本發(fā)明的材料和方法使用其它各種儀器來(lái)測(cè)量熒光偏振。
使用本發(fā)明所述的1，2-雙(2-胺基-5，6-二氟苯氧基)乙烷基-N，N，N′，N′-四乙酸(TF-BAPTA)或任何含氟的磷酸根結(jié)合分子及鎵來(lái)結(jié)合磷酸化靶分子可使用19F-NMR譜檢測(cè)出來(lái)(Doughty DA，Tomutsa L Magn Reson Imaging 1996；14(7-8)869-73)。此外，放射性鎵-67(半衰期78小時(shí))、鎵-68(半衰期1.13小時(shí))或鎵-72(半衰期14.1小時(shí))均可與本發(fā)明的任何磷酸根結(jié)合化合物一起使用，以產(chǎn)生可通過(guò)放射自顯影或閃爍掃描法檢測(cè)的信號(hào)。
如上所述，盡管本發(fā)明可使用多種多樣的檢測(cè)方法，但一較佳的方法包括使用熒光。來(lái)自同時(shí)結(jié)合磷酸化靶分子的磷酸根結(jié)合化合物金屬離子(鎵離子較佳)絡(luò)合物的熒光可用多種成像技術(shù)觀察到，包括普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡。
III.本發(fā)明的試劑盒用于標(biāo)記、分離及鑒別與磷酸化靶分子相互作用的酶的適當(dāng)試劑盒也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這樣的試劑盒可用易于得到的材料及試劑來(lái)制備，且可以多種實(shí)施例形式出現(xiàn)。試劑盒的組成視分析方案的設(shè)計(jì)或檢測(cè)或測(cè)量用試劑而定。所有的試劑盒將根據(jù)需要包括說(shuō)明書(shū)、適宜試劑和磷酸根結(jié)合化合物、分離介質(zhì)和固相載體。說(shuō)明書(shū)通常包括對(duì)試劑濃度或至少一分析方法參數(shù)(例如，試劑和樣品一起加入的相對(duì)量)、試劑/樣品混合物的保存時(shí)期、溫度、緩沖條件及諸如此類(lèi)的明確描述，以便于使用者可使用上述任一種方法或制劑。
用于結(jié)合磷酸化靶分子的試劑盒包含一通常制備于溶液中的結(jié)合試劑，其中結(jié)合液與上文所描述的相同。視需要，試劑盒可包含下列中的任一種磷酸化及非磷酸化靶分子的分子量標(biāo)準(zhǔn)品、總蛋白染色劑和糖蛋白染色液。當(dāng)試劑盒用于檢測(cè)凝膠中或印跡上的磷酸化蛋白質(zhì)或肽時(shí)，試劑盒中通常含有分子量標(biāo)準(zhǔn)品?；蛘撸?dāng)試劑盒用于對(duì)溶液中或陣列上的磷酸化靶分子進(jìn)行染色時(shí)，試劑盒中通常不含有分子量標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明中的另一種試劑盒可用于鑒別激酶或磷酸酶或測(cè)定它們的活性及/或評(píng)估抑制劑和激活劑對(duì)這些酶的效應(yīng)。這種試劑盒通常包含固定在基質(zhì)材料上的適宜底物、結(jié)合液和適宜對(duì)照?；蛘?，磷酸根結(jié)合化合物可固定在基質(zhì)上而最終使用者將提供底物及酶。這種試劑盒可包含一種含有金屬離子鹽及酸或合適緩沖液的溶液，當(dāng)將其加入到固定的磷酸根結(jié)合化合物中時(shí)會(huì)形成本發(fā)明的結(jié)合液。
本發(fā)明的另一種試劑盒可用于從復(fù)合樣品混合物中分離出磷酸化蛋白質(zhì)或磷酸化肽，其中三元絡(luò)合物可從溶液中分離出來(lái)。該試劑盒視需要可包含結(jié)合液、洗脫緩沖液及視情況一蛋白質(zhì)或半抗原-結(jié)合載體，其中該載體可以是多孔板、瓊脂糖樹(shù)脂、聚合物微珠?；虼判灾榱２⒑幸环N適合的親和試劑，例如生物素-或半抗原-結(jié)合蛋白、抗體、凝集素、結(jié)合蛋白的核酸或其它共價(jià)連結(jié)到此載體上的生物聚合物。該試劑盒視需要可進(jìn)一步含有一或多個(gè)離心管柱、標(biāo)準(zhǔn)肽混合物及親核衍生化合物。
本發(fā)明的另一種用于從復(fù)合樣品混合物中分離出磷酸化蛋白質(zhì)或肽的試劑盒包含通常為管柱形式的基質(zhì)，該基質(zhì)含有共價(jià)連結(jié)于其上的磷酸根結(jié)合化合物。除了固定在此基質(zhì)上的磷酸根結(jié)合化合物外，該試劑盒通常還可包含金屬鹽、洗滌緩沖液、溫和酸性結(jié)合緩沖液及洗脫緩沖液。此金屬鹽較佳為氯化鎵，此洗脫緩沖液較佳包含氫氧化鋇。
熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解，根據(jù)試劑盒的使用意圖及使用者的特殊需要，可按照本發(fā)明制備各種各樣的其它試劑盒及試劑盒組份。
本文所述的應(yīng)用僅提供用于闡述本發(fā)明的多種潛在用途，而非意欲限制本發(fā)明的范圍。上文提供了對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明，下面給出的實(shí)例旨在闡釋本發(fā)明，而不應(yīng)該解釋為對(duì)本發(fā)明或權(quán)利要求范圍的限制。
實(shí)例一般來(lái)說(shuō)，本文所用術(shù)語(yǔ)及下述在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)等方面的試驗(yàn)程序在此項(xiàng)技術(shù)中均為人們熟知且常用。一般來(lái)說(shuō)，酶促反應(yīng)和純化步驟按生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。單位、前綴和符號(hào)可以SI接受的形式表示。數(shù)字范圍包括界定范圍的數(shù)字在內(nèi)并包括所界定范圍內(nèi)的每一個(gè)整數(shù)。
實(shí)例1BAPTA對(duì)鎵及鎵離子對(duì)磷酸化靶分子選擇性的測(cè)定和磷酸根結(jié)合化合物的篩選方法(A)結(jié)合有三價(jià)鎵離子的BAPTA選擇性檢測(cè)磷蛋白對(duì)金屬螯合物進(jìn)行全面搜尋，以鑒別出具有以下特性的熒光試劑當(dāng)其與鎵鹽(氯化鎵)結(jié)合時(shí)能從磷酸化與非磷酸化靶分子混合物中選擇性地檢測(cè)磷酸化靶分子(尤其是磷酸肽和磷蛋白)。用熒光分光光度計(jì)測(cè)試該些化合物結(jié)合鎵(III)離子及選擇性地檢測(cè)磷蛋白卵白蛋白的能力。對(duì)鎵(III)離子的結(jié)合是通過(guò)同一化合物在75mMNaOAc(pH 4.0)及140mM NaCl溶液中在存在高達(dá)5uM氯化鎵時(shí)的熒光增加來(lái)測(cè)定。卵白蛋白的檢測(cè)也是由熒光增加來(lái)判定；但該些化合物放置于含有75mM NaOAc(pH4.0)、140mM NaCl、1至4μM卵白蛋白及0.5μM氯化鎵的溶液中。磷蛋白檢測(cè)的選擇性由在不含氯化鎵的相同溶液的情況下熒光增加實(shí)際上消除來(lái)評(píng)價(jià)。
用化合物1對(duì)包括鐵及鎵在內(nèi)的多種金屬離子進(jìn)行篩選，以確定哪一種離子最適合磷蛋白檢測(cè)。通過(guò)監(jiān)測(cè)75μM NaOAc(pH 4.0)、140mM NaCl、0.5至5μM金屬離子、含或不含4μM卵白蛋白或1μM溶菌酶的溶液在530納米處的熒光增加來(lái)對(duì)金屬離子在對(duì)化合物1的結(jié)合、磷蛋白檢測(cè)及總蛋白染色方面進(jìn)行分析。只有結(jié)合到化合物1上的三價(jià)陽(yáng)離子能導(dǎo)致530納米處熒光增加，只有鎵(III)離子當(dāng)結(jié)合了化合物1后能夠選擇性指示磷蛋白。因此，鎵(III)離子是用于磷蛋白檢測(cè)的最佳金屬離子。這一套方法外推用于鑒別其它用不同的染料連接金屬螯合部分的化合物。
(B)化合物1對(duì)磷酸根化合物的不同結(jié)合親和力絡(luò)合有鎵(III)離子的化合物1對(duì)在75μM NaOAc(pH 4.0)和140mM NaCl溶液中的不同磷酸根底物有不同的親和力。某些所研究的含有磷酸根的化合物為無(wú)機(jī)磷酸鹽、連接到蛋白質(zhì)、肽或氨基酸的磷酸鹽、焦磷酸鹽、ATP及DNA。這些以磷酸根為主的底物對(duì)化合物1/鎵(III)離子試劑的親和力測(cè)定為無(wú)機(jī)磷酸鹽及連結(jié)至蛋白質(zhì)、肽或氨基酸的磷酸鹽為～50μM，焦磷酸鹽和ATP為～200μM，對(duì)于DNA未檢測(cè)到結(jié)合。將這些值與化合物1對(duì)鎵(III)離子的親和力進(jìn)行比較，化合物1對(duì)鎵(III)離子的親和力為2.5μM。大部分已知磷酸根化合物依其與BAPTA鎵(III)離子結(jié)合的方式可屬于以下這三類(lèi)中的一種1)單獨(dú)的磷酸根基團(tuán)(即無(wú)機(jī)磷酸鹽或蛋白質(zhì)上的磷酸鹽)，2)多連接磷酸根基團(tuán)(即焦磷酸鹽或ATP)或3)橋聯(lián)磷酸根基團(tuán)(即核酸)。
(C)化合物4同時(shí)結(jié)合鎵(III)離子和磷酸根時(shí)表現(xiàn)出雙發(fā)射波長(zhǎng)在75μM NaOAc(pH 4.0)、140mM NaCl溶液中的濃度為0.1到1.0μM的化合物4表現(xiàn)出集中在410納米(激發(fā)光350納米)的單發(fā)射峰。當(dāng)加入10nM至1mM氯化鎵后，410納米處發(fā)射減弱，伴隨著490納米處發(fā)射增強(qiáng)，等吸光點(diǎn)為475納米。該從藍(lán)到綠狀態(tài)轉(zhuǎn)換的發(fā)射半最大反應(yīng)大約在氯化鎵濃度為1.8μM時(shí)發(fā)生。因此0.1μM化合物4加入1.7μM氯化鎵在75μM NaOAC(pH 4.0)、140mM NaCl溶液中同時(shí)表現(xiàn)出410納米和490納米發(fā)射峰。加入磷酸鹽能改變兩個(gè)發(fā)射峰之間的平衡，有利于長(zhǎng)波長(zhǎng)490納米峰。
(D)篩選同時(shí)結(jié)合鎵及固定的磷酸化靶分子的磷酸根結(jié)合化合物將一組測(cè)試蛋白質(zhì)上樣到變性SDS聚丙烯酰胺凝膠上，電泳分離，用45％甲醇、5％乙酸固定凝膠。測(cè)試凝膠通常含有500納克到600納克以下物質(zhì)中的每一種肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、磷酸化酶b、卵白蛋白(2磷酸根)、碳酸酐酶、大豆胰蛋白酶抑制劑、溶菌酶、抑肽酶、α2-巨球蛋白、磷酸化酶b、葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白、α1酸糖蛋白、碳酸酐酶、親和素和溶菌酶。該些凝膠也含有4倍稀釋系列的α-酪蛋白(8磷酸根)，加樣量為500納克至2納克。因此該些凝膠含有一系列具不同物理化學(xué)特性的蛋白質(zhì)，如具疏水結(jié)合袋的蛋白質(zhì)(例如BSA)、糖基化蛋白質(zhì)(例如α2-巨球蛋白、葡萄糖氧化酶和親和素)、酸性蛋白質(zhì)(例如大豆胰蛋白酶抑制劑)、堿性蛋白質(zhì)(例如溶菌酶和抑肽酶)及兩種不同的磷蛋白(卵白蛋白、α-酪蛋白)。由α-酪蛋白的稀釋系列可估計(jì)磷蛋白染色敏感度。包含不同染料標(biāo)記物和不同螯合部分的磷酸根結(jié)合化合物的最初篩選在pH 3.0至7.0的最少結(jié)合緩沖液中進(jìn)行，該些緩沖液可以含或不含金屬離子，且可含各種金屬離子。染料和金屬離子濃度范圍為從0.1至10μM，通常為0.3至3μM，最常用為1.0μM。磷蛋白較佳的染色結(jié)合條件通常為pH為3.0至5.5之間，且有某些三價(jià)金屬離子存在。在這些條件下，最佳的磷蛋白染色可用特定染料標(biāo)記物和結(jié)合等摩爾濃度Ga3+的BAPTA螯合部分得到。對(duì)結(jié)果良好的染料的進(jìn)一步評(píng)價(jià)顯示最佳pH為4.0，加入鹽(例如250至750mM NaCl)后將提高染色特異性，這主要是因?yàn)榻档土朔橇姿岬鞍兹旧膹?qiáng)度。用1μM候選染料、含1μM Ga3+的50mM乙酸鈉(pH 4.0)、500mM氯化鈉對(duì)染料進(jìn)行廣泛地篩選。
(E)結(jié)合液配方結(jié)合液包含摩爾比為1∶2至2∶1的磷酸根結(jié)合化合物與金屬離子和大約pH 3.0至6.0的緩沖液。通常，結(jié)合液包含pH 3.0至5.5的緩沖液(50至100mM)、鹽(例如100至1000mM NaCl或100至300mM MgCl2)及等摩爾濃度的Ga3+與磷酸根結(jié)合化合物(例如化合物2)，對(duì)于檢測(cè)而言，Ga3+與磷酸根結(jié)合化合物的濃度通常為1至10μM。用于分離目的的金屬離子和磷酸根結(jié)合化合物的濃度通常至少是以檢測(cè)為目的的結(jié)合液中的濃度的100倍(見(jiàn)實(shí)例13)。凝膠染色的最佳結(jié)合液按以下方法配制將500微克化合物2溶解于873微升水中配成1mM的儲(chǔ)備溶液。將5克氯化鎵溶于28.4毫升水中配成1M溶液，取其1毫升加9毫升水配成0.1M溶液，從0.1M溶液中取10微升加入到990微升水中配成1mM儲(chǔ)備溶液。將136克三水乙酸鈉溶解于約800毫升水中，加入23.5毫升12M HCl調(diào)pH到4.0，定容至1升，這樣1升1M乙酸鈉、pH4.0儲(chǔ)備溶液就制備完成。通過(guò)向約800毫升水中溶解233.8 NaCl然后用水定容至1升來(lái)制備1升4M氯化鈉貯存液。將乙酸鈉和氯化鈉儲(chǔ)備溶液用0.45微米濾膜過(guò)濾。為配制100毫升結(jié)合液，將5毫升pH 4.0的1M乙酸鈉、12.5毫升的4M氯化鈉和20毫升的1，2丙二醇與水混合至終體積為100毫升，邊攪拌邊向其中加入100微升的1mM GaCl3和100微升的1mM化合物2，得到pH 4.0的含有1μM化合物2、1μM Ga3+、20％1，2-丙二醇、500mM NaCl、50mM乙酸鈉的最終結(jié)合液。
實(shí)例2在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中磷蛋白的檢測(cè)按標(biāo)準(zhǔn)程序用含4％T、2.6％C且pH 6.8的積層凝膠及含13％T、2.6％C且pH 8.8的分離凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離磷蛋白。％T是以克/100毫升表示的總單體濃度(丙稀酰胺+交聯(lián)劑)，％C是交聯(lián)劑百分?jǐn)?shù)(如N，N’-亞甲基-雙-丙稀酰胺、N，N′-二丙烯酰哌嗪或其它合適試劑)。分離膠寬8厘米、高5厘米且厚度為0.75厘米。電泳后，將凝膠浸入含45％甲醇、5％乙酸的100毫升固定液中固定90分鐘。用水洗滌凝膠兩次共30分鐘。然后將凝膠加入本發(fā)明的結(jié)合液(實(shí)例1E)中，通常以50rpm輕輕回旋振蕩，室溫培育120分鐘。結(jié)合緩沖液含有50mM NaOAc(pH 4.0)、250mM氯化鈉、20％v/v 1，2-丙二醇、1μM氯化鎵。為配制結(jié)合液，將120微升1mM化合物2儲(chǔ)備溶液和120微升1mM氯化鎵儲(chǔ)備溶液加入到1080微升水中。然后將這一混合物加入到59毫升的結(jié)合緩沖液中得到結(jié)合液。或者，該磷酸根結(jié)合化合物和氯化鎵可分別直接加入到60毫升的結(jié)合稀釋液中?？芍苽淅帽景l(fā)明其它磷酸根結(jié)合化合物的結(jié)合液，并可以類(lèi)似方式就凝膠染色方面進(jìn)行測(cè)試。在結(jié)合液中培育后，用75毫升50mM NaOAc(pH 4.0)洗滌凝膠，進(jìn)行兩次洗滌，每次30分鐘。
對(duì)可在532納米處激發(fā)的化合物2和其它染料，可通過(guò)Fajifilm FLA3000激光掃描儀用532納米激發(fā)和580納米帶通發(fā)射濾波器獲得圖像。對(duì)在紫外區(qū)或在低于532納米的可見(jiàn)波長(zhǎng)下有吸收的熒光磷酸根結(jié)合化合物，用300納米進(jìn)行激發(fā)通過(guò)RocheLumi-imager檢測(cè)，或用473納米激發(fā)和580納米帶通發(fā)射通過(guò)Fujifilm FLA 3000激光掃描儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)用圖像計(jì)量分析(Image Gauge Analysis)軟件顯示。磷蛋白圖像以暗帶顯示。不含磷酸根的蛋白質(zhì)不被標(biāo)記或相對(duì)于磷蛋白染色很淺。當(dāng)凝膠如上標(biāo)記但結(jié)合液中缺少氯化鎵時(shí)，磷蛋白不能被選擇性染色，不能與本底區(qū)分或僅有非常淺的非特異性染色。凝膠用50mM NaOAc(pH 4.0)過(guò)夜洗滌，按以上方法獲得圖像。與磷蛋白染色相比本底和非特異性染色進(jìn)一步減弱。對(duì)于所測(cè)試的所有指示劑，用其它鎵鹽代替氯化鎵產(chǎn)生類(lèi)似結(jié)果；然而用其它包括Fe3+及Al3+在內(nèi)的金屬代替氯化鎵用于磷蛋白染色，結(jié)果通常比原來(lái)的差。
凝膠可在甲醇/乙酸中過(guò)夜固定，或者凝膠能在固定劑中放置數(shù)天?？捎闷渌}代替氯化鈉，包括氯化鎂、硫酸鎂和硫酸銨。氯化鈉濃度在100mM至1000mM之間較佳。如果結(jié)合液不含鹽，則非磷酸蛋白的非特異性染色會(huì)增加。用大量約50mM NaOAc(pH 4.0)洗滌會(huì)將非特異性染色降到低水平。除了NaOAc外可用其它緩沖液，包括甲酸鹽和2-(N-嗎啉基)乙磺酸。如果缺少1，2-丙二醇，則凝膠的本底染色將會(huì)增加，但磷蛋白仍可被選擇性染色。酸性緩沖液的最佳pH范圍為3.0至6.0。
實(shí)例3在SDS聚丙烯酰胺凝膠中磷蛋白和總蛋白的系列兩色性檢測(cè)按實(shí)例2方法檢測(cè)完磷蛋白后，將凝膠用60毫升SYPRORuby蛋白凝膠染色劑(Molecular Probes，Eugene，Oregon)培育過(guò)夜，輕輕回旋振蕩，通常50rpm。然后將凝膠在7％乙酸、10％甲醇中也以50rpm培育30分鐘。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)CCD相機(jī)成像系統(tǒng)用300納米UV光激發(fā)及600納米帶通濾波器收集磷酸化和非磷酸化蛋白的桔黃色信號(hào)。
實(shí)例4在聚丙烯酰胺凝膠中磷酸肽的檢測(cè)將胰蛋白酶消化牛奶β-酪蛋白產(chǎn)生的肽用NovexTricine凝膠(16％聚丙烯酰胺，InvitrogenTMlife technologies)電泳分離。電泳后將凝膠在100毫升含40％甲醇、10％乙酸的溶液中固定1小時(shí)，然后在100毫升含40％甲醇、0.82M NaOAc、0.5％戊二醛的溶液中固定1小時(shí)。將凝膠換水洗滌三次，然后在30毫升含有50mM NaOAc(pH4.0)、500mM氯化鈉、1μM化合物2、1μM氯化鎵的染色液中培育100分鐘。然后將凝膠在75分鐘內(nèi)換50mM NaOAc溶液洗滌三次。通過(guò)Fujifilm FLA 3000激光掃描儀用532納米激發(fā)及580納米帶通發(fā)射濾波器得到圖像，用圖像計(jì)量分析軟件顯示數(shù)據(jù)。用胰蛋白酶消化β-酪蛋白產(chǎn)生的兩個(gè)已知的磷酸肽在凝膠上呈現(xiàn)顯著的條帶。然后將凝膠用60毫升SYPRORuby蛋白凝膠染色劑通過(guò)在染色劑中培育凝膠過(guò)夜來(lái)染色，然后將凝膠在7％乙酸、10％甲醇中培育30分鐘。
實(shí)例5在等電聚焦凝膠中磷蛋白的檢測(cè)等電聚焦(IEF)可用多種利用不同的化學(xué)原理產(chǎn)生pH梯度的預(yù)制凝膠及實(shí)驗(yàn)室制備凝膠來(lái)進(jìn)行。在這種情況下，按照制造者的說(shuō)明書(shū)，將兩性電介質(zhì)(Ampholine)PAG板用Multiphor II電泳裝置(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)以1500伏-小時(shí)進(jìn)行水平電泳。將凝膠在100毫升45％甲醇、5％乙酸溶液中過(guò)夜固定。然后將凝膠用相同體積的水換洗數(shù)次，在50毫升含有50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH 3.0)、1000mM NaCl、1μM化合物2及1μM氯化鎵的染色液中培育130分鐘。凝膠用50毫升50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH 3.0)、1M NaCl洗滌兩次，每次洗30分鐘，然后置于50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH 3.0)中。按實(shí)施例2所述得到圖像。
實(shí)例6在雙向凝膠中磷蛋白的檢測(cè)人MRC-5肺纖維母細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)混合物(150微克)在尿素緩沖液(7M尿素、2 M硫脲、2％CHAPS、1％Zwittergent 3-10、0.8％載體兩性電解質(zhì)(3-10)、65mM DTT)中稀釋?zhuān)蠘佑诘谝幌騃PG膠條(3-10非線性，18厘米)。經(jīng)過(guò)過(guò)夜再水合后，以礦物油覆蓋膠條，在總75000伏電壓下聚焦蛋白質(zhì)。然后將IPG膠條置于1毫米厚、20厘米×20厘米、12.5％T、2.6％C的聚丙烯酰胺凝膠頂部，該凝膠含有375mM Tris堿，pH 8.8；按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，不同的是陰極緩沖液含50mMTris、384mM甘氨酸、4％SDS且pH 8.8，而陽(yáng)極緩沖液含25mM Tris、192mM甘氨酸、2％SDS且pH 8.8。第二向電泳后，將凝膠在750毫升45％甲醇、5％乙酸溶液中固定20小時(shí)。將凝膠用水洗滌兩次，每次75分鐘，然后加入到500毫升染色液中。染色液含有50mM NaOAc(pH 4.0)、250mM氯化鈉、20％v/v 1，2-丙二醇、1μM化合物2、1uM氯化鎵。將500微升1mM化合物2儲(chǔ)備溶液和500微升1mM氯化鎵儲(chǔ)備溶液加入到9毫升水中。該混合物然后加入到490毫升的染色緩沖液中。凝膠在結(jié)合液中培育8小時(shí)，將溶液輕輕倒掉，用800毫升50mM NaOAc且pH4.0的溶液換洗凝膠三次，每次洗30至40分鐘，然后在1升50mM NaOAc且pH4.0的溶液中洗滌過(guò)夜。通過(guò)Fujifilm FLA 3000激光掃描儀用532納米激發(fā)光及590納米帶通濾波器獲得圖像，用圖像計(jì)量分析軟件顯示數(shù)據(jù)。磷蛋白圖像顯示為黑色斑點(diǎn)。不含磷酸根的蛋白質(zhì)不被染色或相對(duì)于磷蛋白僅有很淺的染色。當(dāng)凝膠如上染色但染色液中缺少GaCl3時(shí)，磷蛋白不能被選擇性染色，不能與本底或淺的非特異性染色區(qū)分開(kāi)。另外，磷蛋白染色出現(xiàn)點(diǎn)拖尾，這與同一蛋白質(zhì)的不同磷酸化程度有關(guān)，即蛋白質(zhì)具有相同的分子量但由于加入或去除一個(gè)磷酸根基團(tuán)而使電荷不同。因此，用本發(fā)明的方法進(jìn)行2-D凝膠分析對(duì)鑒定磷蛋白十分有效，可以鑒定單一蛋白質(zhì)磷酸化程度的變化。
實(shí)例7在2-D凝膠中磷蛋白和總蛋白的系列兩色性檢測(cè)電泳和磷蛋白的檢測(cè)同實(shí)例6。磷蛋白檢測(cè)后，將凝膠用500毫升SYPRORuby蛋白凝膠染色劑通過(guò)在染色劑中培育凝膠過(guò)夜來(lái)染色，然后將凝膠在7％乙酸、10％甲醇的溶液中換洗兩次，每次洗30分鐘。按實(shí)例2方法得到圖像?；蛘?，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)CCD相機(jī)成像系統(tǒng)用300納米UV激發(fā)光及600納米帶通濾波器收集磷酸化和非磷酸化蛋白的桔黃色信號(hào)。
實(shí)例8電印跡到PVDF或硝酸纖維素膜上的磷蛋白的檢測(cè)將目的蛋白質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺電泳分離，并按標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)移到PVDF膜，讓膜在空氣中晾干。將PVDF膜迅速浸入100％甲醇中，用40％甲醇、5％乙酸的溶液洗滌15分鐘，換兩次水洗滌，每次15分鐘。然后將印跡加入到結(jié)合液中，室溫輕輕回旋振蕩培育80分鐘。結(jié)合液中含有50mM NaOAc、pH 4.0、500mM氯化鈉、1μM化合物1或化合物4和1μM氯化鎵。通常將60微升1mM磷酸根結(jié)合化合物儲(chǔ)備溶液和60微升1mM氯化鎵儲(chǔ)備溶液加入到540微升水中。該混合物然后加入到29.5毫升的染色緩沖液中?；蛘撸姿岣Y(jié)合化合物和氯化鎵可分別直接加入到30毫升的染色稀釋液中。在染色溶液中培育后，將凝膠用50毫升50mM NaOAc且pH4.0的溶液洗滌，每次洗滌30至50分鐘，洗兩次。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)CCD相機(jī)成像系統(tǒng)(BioRad FluorS Max)用300納米UV反射光源及465納米帶通發(fā)射濾波器得到化合物4的圖像。不含磷酸根的蛋白質(zhì)未被標(biāo)記，或相對(duì)于磷蛋白來(lái)說(shuō)染色非常淺。當(dāng)印跡如上染色但染色液中缺少GaCl3時(shí)，磷蛋白不能被選擇性染色，不能與本底或淺的非特異性染色分開(kāi)。為了得到化合物1的圖像，濕斑點(diǎn)面朝下放在配有473納米激發(fā)激光和520納米帶通濾波器的Fujifilm FLA3000激光掃描儀上，數(shù)據(jù)由圖像計(jì)量分析軟件顯示。
實(shí)例9電印跡到PVDF膜上的磷蛋白和總蛋白的兩色性檢測(cè)PVDF膜上的磷蛋白和總蛋白的系列兩色性檢測(cè)通過(guò)以下完成如實(shí)例8(上文)將印跡標(biāo)記及成像來(lái)檢測(cè)磷蛋白，然后將該印跡用SYPRORuby蛋白印跡染色劑進(jìn)行后染色來(lái)檢測(cè)總蛋白。將印跡面朝下漂浮在10％甲醇、7％乙酸溶液中15分鐘，隨后用SYPRORuby染色劑表面染色15分鐘。印跡面朝下用水洗滌，10分鐘內(nèi)換三次水。讓膜在空氣中晾干。通過(guò)配300納米UV反射光源和610納米長(zhǎng)通濾波器的標(biāo)準(zhǔn)CCD相機(jī)成像系統(tǒng)(BioRad FluorS Max)得到總蛋白熒光信號(hào)。
如實(shí)例8通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)CD相機(jī)成像系統(tǒng)(BioRad FluorS Max)用反射300納米UV光源和465納米帶通濾波器獲得圖像來(lái)完成兩色性染色。用化合物4/Ga(III)染色的磷蛋白的信號(hào)可以與用SYPRORuby染色的總蛋白的信號(hào)區(qū)分開(kāi)，但不能用465納米帶通濾波器檢測(cè)。
對(duì)于化合物1，上述SYPRORuby染色及獲取圖像揭示總蛋白的熒光信號(hào)，當(dāng)將SYPRORuby圖像與上文實(shí)例6獲得的熒光圖像比較時(shí)，揭示磷蛋白為子集。
實(shí)例10磷酸酶活性的檢測(cè)將磷蛋白和非磷酸化蛋白用市售小牛腸堿性磷酸酶在37℃于標(biāo)準(zhǔn)條件下培育30分鐘。同樣條件下不加酶作對(duì)照消化。合適的測(cè)試蛋白質(zhì)包括牛α-酪蛋白、卵白蛋白、胃蛋白酶等磷蛋白和牛血清白蛋白、雞卵白溶菌酶和大豆胰蛋白酶抑制劑等非磷酸化蛋白。按實(shí)例2方法電泳，用對(duì)照(未消化的)和磷酸酶處理的樣品成對(duì)上樣，每泳道1250納克蛋白。磷蛋白檢測(cè)按上文實(shí)例2進(jìn)行，標(biāo)記后90分鐘獲取圖像，再于過(guò)夜洗滌后獲取圖像。另一塊凝膠按實(shí)例2標(biāo)記但結(jié)合液中沒(méi)有氯化鎵。對(duì)于用完整結(jié)合液標(biāo)記的凝膠，同對(duì)照組比較，根據(jù)軟件顯示未消化的樣品蛋白質(zhì)顯示磷蛋白呈暗帶，非磷酸蛋白不被標(biāo)記或僅有非常微弱的的染色。對(duì)于缺少氯化鎵的調(diào)配物標(biāo)記的凝膠，磷蛋白與非磷酸蛋白表現(xiàn)同樣程度的無(wú)標(biāo)記或僅有極微弱的染色，且這一信號(hào)水平與用包含氯化鎵的全調(diào)配物標(biāo)記的凝膠中的非磷酸蛋白相同。通過(guò)比較全標(biāo)記凝膠中的成對(duì)磷蛋白，顯示用堿性磷酸酶處理的樣品的信號(hào)顯著弱于未經(jīng)消化的對(duì)照樣品的信號(hào)。非磷酸蛋白十分微弱的信號(hào)，如果能檢測(cè)到的話，事實(shí)上與對(duì)照樣品和經(jīng)過(guò)酶處理的樣品相同。
檢測(cè)完磷蛋白后，將凝膠用SYPRORuby蛋白凝膠染色劑按實(shí)例2方法染色以染色總蛋白，按實(shí)例3和實(shí)例7的方法得到SYPRORuby蛋白染色圖像。對(duì)于兩種凝膠，成對(duì)的對(duì)照樣品和經(jīng)消化處理樣品的總蛋白染色信號(hào)相似，表明堿性磷酸酶處理過(guò)的磷蛋白樣品信號(hào)的減弱不是由蛋白質(zhì)降解造成。
實(shí)例11檢測(cè)激酶活性按照廠家的說(shuō)明書(shū)，加入100mM三磷酸腺苷(ATP)及所提供的緩沖組份，牛肌球蛋白輕鏈與市售克隆的鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶II(New England BioLabs)培育。不加酶進(jìn)行平行對(duì)照培育。每種反應(yīng)混合物的樣品加到相鄰的泳道，同實(shí)例2一樣進(jìn)行電泳分析。凝膠在100毫升45％甲醇、5％乙酸的溶液中固定60分鐘，然后換水洗滌數(shù)次。一塊凝膠置于30毫升含有50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH3.0)、1000mM NaCl、1μM化合物2、1μM氯化稼的結(jié)合液中，培育110分鐘。另一塊凝膠培育在相同但減掉氯化鎵的結(jié)合液中培育。凝膠用50毫升50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH3.0)、1000mM NaCl溶液洗滌2次，每次洗30分鐘，然后置于50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH3.0)的溶液中。磷蛋白檢測(cè)用的圖象按照實(shí)例2的方法獲得，磷蛋白和總蛋白的系列兩色性檢測(cè)按照實(shí)例3的方法進(jìn)行。
總蛋白染色揭示在兩個(gè)泳道中都有3個(gè)完全相同的主要條帶圖形。磷蛋白染色揭示兩條泳道都有一個(gè)主要的條帶，來(lái)自對(duì)應(yīng)于含酶反應(yīng)物的泳道的信號(hào)的強(qiáng)度是無(wú)酶對(duì)照的3.4倍。
實(shí)例12TRAIL/Apo2L檢測(cè)用涉及2-D凝膠電泳和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組研究方法測(cè)定與TRAIL/Apo2L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。這種方法涉及將用可溶性TRAIL/Apo2L片段(氨基酸114至281)處理幾秒鐘到幾小時(shí)不等時(shí)間后的結(jié)腸癌細(xì)胞(Colo205)與不加該片段處理的同樣細(xì)胞做2-D凝膠電泳進(jìn)行比較。為了幫助進(jìn)行2-D凝膠比較，一起使用結(jié)合鎵離子的化合物7及SYPRORuby總蛋白染色劑。由于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常涉及蛋白質(zhì)磷酸化作用，使用化合物7能突出很可能與死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的斑點(diǎn)。將經(jīng)過(guò)TRAIL/Apo2L處理和不經(jīng)過(guò)TRAIL/Apo2L處理的Colo205細(xì)胞間具顯著差別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)隨后用質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒別。
實(shí)例13磷酸肽沉淀兩種非磷酸化肽(血管緊張素I和II)和兩種磷酸化肽(pT/pY和Rll)混合物(每種5微升)在含有100mM NaOAc(pH4.0)、0.2mM GaCl3和0.1mM化合物9的終體積為100微升的溶液中結(jié)合。混合液在室溫下劇烈旋渦振蕩1小時(shí)，然后用微量離心機(jī)全速離心5分鐘。移出上清液并保存。沉淀物通過(guò)微量吸管的尖頭搗散重新懸浮在100微升洗滌緩沖液中(100mM NaOAc，pH4.0，0.2mM GaCl3)。樣品再離心5分鐘，將上清液洗出組份存起來(lái)用于分析。將沉淀物溶解于100微升50％乙腈、0.1％TFA的溶液中，用于進(jìn)一步的HPLC或者M(jìn)ALDI質(zhì)譜分析。也可將沉淀物溶于多種不同的理想堿性溶液中。
如果離心之后須除去磷酸根結(jié)合化合物，則可以用氯仿提取。同樣，沉淀程序中也可使用任何生物素標(biāo)記的磷酸根結(jié)合化合物，如化合物9。用有機(jī)或堿處理將沉淀物即磷酸化肽自使用磷酸根結(jié)合化合物/鎵絡(luò)合物的分離后，磷酸根結(jié)合化合物可以用固定的鏈霉親和素載體(例如，鏈霉親和素-瓊脂糖或鏈霉親和素磁珠)除去。
實(shí)例14用化合物2-Ga3+通過(guò)熒光偏振檢測(cè)溶液中的磷酸肽為了證明化合物2-Ga3+對(duì)磷蛋白及磷酸肽的絡(luò)合作用，對(duì)游離染料的熒光偏振進(jìn)行檢查并在存在磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)及肽的情況下與絡(luò)合物(化合物2-Ga3+)進(jìn)行比較。
首先，用(1)磷蛋白(卵白蛋白)和(2)對(duì)照非磷酸化蛋白(溶菌酶)來(lái)進(jìn)行分析。在室溫下將改良的含有1.0μM化合物2的結(jié)合液在50mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH3.0至3.5)、500mM NaCl溶液中培育，同時(shí)對(duì)另外含有(a)1μM氯化鎵、(b)100μM溶菌酶加1μM氯化鎵或(c)100μM卵白蛋白加1μM氯化鎵的溶液進(jìn)行培育。通過(guò)熒光分光光度計(jì)用530納米激發(fā)光及545至700納米發(fā)射光測(cè)定所得溶液的熒光偏振。整合的偏振發(fā)射光譜產(chǎn)生各向異性“r值”r＝0.10+/-0.003+/-0.02(化合物2加鎵)；r＝0.10+/-0.002(化合物2加溶菌素非磷酸化對(duì)照)；r＝0.34+/-0.002(化合物加鎵加卵白蛋白)，表明化合物2對(duì)該磷蛋白的磷酸化依賴(lài)性結(jié)合(見(jiàn)圖10A)。
其次，用(1)磷酸肽、(2)非磷酸化肽和(3)無(wú)肽的對(duì)照來(lái)進(jìn)行分析。磷酸化的和非磷酸化的δ睡眠誘導(dǎo)肽DSIP(Typ-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser(PO3)-Gly-Glu)購(gòu)自SynPep公司(Dublin，CA)，卵白蛋白(Cat.A-7641)和溶菌酶(Cat.A-7651)購(gòu)自SigmaChemical公司(St.Louis，MO)。為了進(jìn)行分析，100μM的每種肽和無(wú)肽對(duì)照溶解于結(jié)合液(50mM NaOAc(pH4.0)、500mM NaCl、1.0μM化合物2和1μM GaCl3)中，室溫培育30分鐘。使用Aminco-Bowman系列-2分光光度計(jì)(SpectronicInstruments公司，Rochester，NY)，將激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為555±4納米，發(fā)射光波長(zhǎng)設(shè)定為580±4納米，測(cè)量熒光偏振及各向異性?；蛘?，用Wallac1420 Multilabel Counter(多標(biāo)記計(jì)數(shù)器)(PerkinElmer Life Sciences)測(cè)定熒光，將激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為535±17.5納米，發(fā)射光波長(zhǎng)設(shè)定為590±17.5納米。單獨(dú)的結(jié)合液與存在非磷酸化肽的結(jié)合液，其熒光偏振和各向異性被證明為非常類(lèi)似。但是，當(dāng)存在磷酸肽時(shí)，熒光偏振和各向異性值顯著增加。這一結(jié)果表明，磷酸肽和化合物2-Ga3+絡(luò)合物在溶液中可以特異性結(jié)合，但是非磷酸化肽不行。見(jiàn)圖10B。
該分析也提供了一種篩選與三價(jià)鎵離子和標(biāo)記磷酸化肽結(jié)合的化合物的方法，及基于溶液的激酶分析方法。
實(shí)例15使用一固定在基質(zhì)上的磷酸根結(jié)合化合物對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)消化物的磷酸肽進(jìn)行分離和定性向磷酸根結(jié)合化合物-瓊脂糖管柱(化合物13或化合物14)(通常200微升基質(zhì))加入0.1M GaCl3，用去離子水洗滌直到穿過(guò)基質(zhì)的材料的pH值接近7.0。然后用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液(100mM NaOAc緩沖液(pH3.0))平衡該柱。將磷酸肽混合物在SpeedVac(Savant)或類(lèi)似裝置中真空干燥，然后用結(jié)合緩沖液溶解。如果肽混合物的最終pH值不是3.0，那么可以用1至10M乙酸適當(dāng)調(diào)節(jié)。施加1倍柱體積或者更少(但不少于柱體積的一半)的蛋白質(zhì)消化物(1至5毫克/毫升)，接著施加2倍柱體積的結(jié)合緩沖液。合并流出(FT)溶出份并保存用于進(jìn)一步的分析。管柱用2倍柱體積的100mM NaOAc(pH 7.0)、500mM NaCl、10％乙腈溶液沖洗，接著用1倍柱體積的NaOAc(pH 7.0)溶液沖洗。合并FT溶出份并保存用于進(jìn)一步的分析。所結(jié)合的肽用3份等柱體積的飽和Ba(OH)2分別洗脫，收集于一個(gè)試管中。最終的洗脫溶出份pH值大于pH 11.0，如果達(dá)不到，則立即用飽和Ba(OH)2調(diào)節(jié)。洗脫溶出份在30℃培育90分鐘。培育后，樣品分成兩等份，其中之一用冰乙酸將pH值中和至pH 5.0-7.0后凍存。另一份加入一半體積的去離子水，接著加入濃縮的親核性硫醇或胺(甲胺、胱胺或β-半胱胺)，使其終濃度達(dá)0.1至0.5M并且體積不超過(guò)最初樣品/H2O體積的1/6。將反應(yīng)混合物在30℃另外培育60分鐘，然后用冰乙酸中和到pH 5.0至7.0。為了進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，按照標(biāo)準(zhǔn)方案用C18 Zip Tips(Millipore)將肽從樣品中純化出來(lái)，用SpeedVac干燥機(jī)將其真空干燥，然后溶解于50％乙腈和0.1％TFA溶液中。在同樣溶劑中加入等體積的10毫克/毫升MALDI基質(zhì)(α-氰基-5-羥基肉桂酸)。將溶液充分混勻，點(diǎn)1微升在MALDI靶上。
兩種肽溶出份的示差質(zhì)量分析可以確定肽上磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量，以及磷酸氨基酸的種類(lèi)。在所用條件下，只有磷酸絲氨酸殘基經(jīng)受消去和親核加成(磷酸損失-98amu，+親核加成試劑分子量)。磷酸蘇氨酸殘基只經(jīng)受消去(僅磷酸損失-98amu)，磷酸酪氨酸保持不變，因?yàn)榱姿崂野彼嵩趶?qiáng)堿中很穩(wěn)定。
實(shí)例16定量卵白蛋白上的磷酸根數(shù)量將1μM和4μM的卵白蛋白在75mM NaOAc(PH 4.0)、140mM NaCl、0.1μM化合物4和1.7μM GaCl3的溶液中于室溫培育5至10分鐘。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定最終溶液在410納米處的熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽標(biāo)定曲線進(jìn)行比較以確定卵白蛋白上磷酸根的數(shù)量。標(biāo)準(zhǔn)磷酸標(biāo)定曲線通過(guò)以下產(chǎn)生將已知濃度(1μM、2μM、4μM、6μM、8μM和10μM)的含有磷酸絲氨酸的19個(gè)氨基酸的肽在75mM NaOAc(pH4.0)、140mM NaCl、0.1μM化合物4及1.7μM氯化鎵的溶液中平衡，測(cè)定該溶液在410納米處的熒光強(qiáng)度。接下來(lái)繪制熒光強(qiáng)度對(duì)磷酸肽的已知濃度的曲線圖。含有卵白蛋白的溶液的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較揭示其含有～2μM至～8μM的磷酸根。最后，根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度，確定每個(gè)卵白蛋白分子中含有兩個(gè)磷酸根基團(tuán)。
實(shí)例17磷脂的檢測(cè)為了測(cè)試本發(fā)明對(duì)磷脂的檢測(cè)，將不同的磷脂點(diǎn)樣到硝酸纖維素膜上。磷脂來(lái)自Echelon Research Labs，以被稱(chēng)為PIP ArrayTM的形式存在，其含有7種不同濃度的8種不同的磷酸肌醇(Ptdlns)。PIP ArrayTM用于imj定本發(fā)明檢測(cè)磷脂的敏感度限度。
PIP ArrayTM1.Ptdlns 100 50 25 12.5 6.3 3.2 1.6皮摩爾2.Ptdlns(3)P
3.Ptdlns(4)P4.Ptdlns(5)P5.Ptdlns(3，5)P26.Ptdlns(4，5)P27.Ptdlns(3，4)P28.Ptdlns(3，4，5)P3將一份PIP ArrayTM用50mM NaOAc(pH4.0)洗滌15分鐘。洗滌后PIP ArrayTM在50mM NaOAc(pH4.0)、20％1，2-丙二醇、500mM NaCl、1μM化合物1及1μM GaCl3中培育1小時(shí)，培育時(shí)ArrayTM在回旋式振蕩器上以100至150RPM振蕩。培育后PIP ArrayTM用50mM NaOAc(pH4.0)溶液在回旋式振蕩器上以100至150RPM洗滌3次，每次15分鐘，以除去未結(jié)合染料，減弱本底熒光。用激光掃描儀(Fuji FLA3000)通過(guò)473納米的激發(fā)波長(zhǎng)和520納米的發(fā)射濾波器形成PIP ArrayTM的圖像。在8種磷酸肌醇中，4種給出強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)。這些包括磷脂酸、磷酸肌醇(4、5)P2、磷酸肌醇(3、4)P2和磷酸肌醇(3、4、5)P3。最強(qiáng)信號(hào)通過(guò)磷酸肌醇(3、4)P2得到，接著是磷酸肌醇(4、5)P2，然后是磷酸肌醇(3、4、5)P3。
實(shí)例18微陣列上磷蛋白檢測(cè)將包括β-酪蛋白、卵白蛋白、胃蛋白酶和牛血清白蛋白在內(nèi)的四種特異性純化蛋白質(zhì)從水溶液濃度為0.975微克/毫升至0.5毫克/毫升的源板(384孔板)用BioChip PIPArrayTM(Packard Instrument公司，Meriden，CT)排列到水凝膠(HydroGel)包被的載片(Perkin Elmer)上。BioChip ArrayerTM使用由4個(gè)玻璃毛細(xì)管組成的PiezoTipTM分樣器。將蛋白質(zhì)從PiezoTipTM中以333皮升體積的小滴分發(fā)，產(chǎn)生直徑為170微米的陣列點(diǎn)，水平和垂直點(diǎn)距為500微米(點(diǎn)距＝點(diǎn)中心到點(diǎn)中心的間距)。將蛋白質(zhì)重復(fù)排列成四排，十個(gè)稀釋點(diǎn)，產(chǎn)生一160點(diǎn)陣列。得到的陣列濃度范圍是166.5皮克/點(diǎn)至0.325皮克/點(diǎn)。為檢測(cè)磷蛋白，將載片在1μM化合物2中在旋轉(zhuǎn)器上培育1小時(shí)，其緩沖液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3和0.05M NaOAc(pH4.0)。然后將載片在0.05M NaOAc(pH4.0)并含10％甲醇的溶液中在旋轉(zhuǎn)器上洗滌1小時(shí)，接著用水洗滌15分鐘。然后將載片在附加有帶載片固定器的轉(zhuǎn)子的微陣列高速離心機(jī)(Telechem)中以～6000rpm短暫旋轉(zhuǎn)，以除去多余液體。載片干燥后，將陣列通過(guò)ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光和或者570納米或者592納米的發(fā)射濾波器成像。每種蛋白質(zhì)中磷酸根含量確定如下β-酪蛋白，5個(gè)磷酸根；卵白蛋白，2個(gè)磷酸根；胃蛋白酶，1個(gè)磷酸根；牛血清白蛋白，不含磷酸根。
實(shí)例19在微陣列上磷酸肽的檢測(cè)兩種肽，Kemptide和pDSIP，從水溶液濃度為0.03125到2毫克/毫升肽的起源板(384孔板)排列到水凝膠包被的載片(Perkin Elmer)上。Kemptide的氨基酸序列是Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly(MW 771.9)。pDSIP的氨基酸序列是Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser(PO3H)-Gly-Glu(MW 929.5)。陣列用安裝有4排8點(diǎn)樣針(共32個(gè))的手動(dòng)玻璃載片陣列點(diǎn)樣器(V&P Scientific，San Diego，CA)點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)直徑～500微米，水平點(diǎn)距1125微米，垂直點(diǎn)距750微米(點(diǎn)距＝點(diǎn)中心到點(diǎn)中心的間距)。手動(dòng)陣列點(diǎn)樣器從起源板取6納升肽通過(guò)直接接觸轉(zhuǎn)移～6納升到陣列表面。得到的肽濃度為0.18至12納克/點(diǎn)。將肽重復(fù)排列6次，產(chǎn)生一84點(diǎn)陣列。對(duì)于特異性檢測(cè)磷酸肽pDSIP，將載片在1μM化合物2染料中在旋轉(zhuǎn)器上培育1小時(shí)，其緩沖液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3及0.05M NaOAc(PH4.0)。然后將載片在0.05M NaOAc(pH4.0)、10％甲醇溶液中于旋轉(zhuǎn)器上洗滌1小時(shí)，接著用水洗滌15分鐘。然后將載片在附加有帶載片固定器的轉(zhuǎn)子的微陣列高速離心機(jī)(Telechem)中以～6000rpm短暫旋轉(zhuǎn)，以除去多余液體。載片干燥后，將陣列用ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)通過(guò)543.5納米激光和或者570納米或者592納米的發(fā)射濾波器成像。
實(shí)例20微陣列形式固定的激酶底物的檢測(cè)；糖原合成酶1-10的選擇性檢測(cè)將兩種特異性肽，Ab1肽和糖原合成酶1-10，從水溶液濃度為0.03到2毫克/毫升的起源板(384孔板)排列到水凝膠包被的載片(Perkin Elmer)上。Ab1肽(New EnglandBiolabs)是Ab1酪氨酸激酶的底物，其氨基酸序列是E-A-I-Y-A-A-P-F-A-K-K-K(MW1336)，糖原合成酶1-10(Calbiochem)是鈣-鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶II的底物，其氨基酸序列是P-L-S-R-T-L-S-V-S-S(MW 1045.2)。陣列用安裝有4排8點(diǎn)樣針(共32個(gè))的手動(dòng)玻璃載片陣列點(diǎn)樣器(V & P Scientific，San Diego，CA)點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)直徑～500微米，水平點(diǎn)距1.125微米，垂直點(diǎn)距750微米(點(diǎn)距＝點(diǎn)中心到點(diǎn)中心的間距)。手動(dòng)陣列點(diǎn)樣器從起源板取6納升肽通過(guò)直接接觸轉(zhuǎn)移～6納升到水凝膠包被的陣列表面。得到的肽濃度為0.18到12納克/點(diǎn)。每個(gè)肽重復(fù)排列6次，產(chǎn)生一96點(diǎn)陣列(其中有12個(gè)點(diǎn)為0納克/點(diǎn))。載片于排列后置濕室內(nèi)過(guò)夜。然后將載片在100mM HEPES、1％BSA中封阻1小時(shí)，同時(shí)振蕩(Barnstead/Thermolyne Labquake電烤箱)。封阻后將載片在附加有帶載片固定器的轉(zhuǎn)子的小型微陣列高速(最大速度～6000rpm)離心機(jī)(Telechem)中短暫旋轉(zhuǎn)，以去掉多余液體。接下來(lái)，將Grace Biolabs HybriwellTM雜交密封系統(tǒng)(40×22×0.25毫米)附到水凝膠包被的載片上以密封含有水凝膠聚丙烯酰胺墊的區(qū)域，進(jìn)行激酶反應(yīng)。反應(yīng)用供給有酶的緩沖液、CaCl2、鈣調(diào)素及ATP在80微升反應(yīng)體積中進(jìn)行，其含有20,000U/毫升或者1600單位酶(鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶II，NEB)。1×CamKII緩沖液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、2mM二硫蘇糖醇、0.1mM Na2EDTA，pH 7.5。CaCl2、鈣調(diào)素和ATP的工作濃度是2mM、1.2μM和0.10mM。帶酶的反應(yīng)液通過(guò)封蓋上的2個(gè)開(kāi)口中的1個(gè)用移液管吸到HybriWellTM中。然后用封膠封口，置于CMT-雜交室內(nèi)(VWR Scientific)，在37℃培育器內(nèi)于章動(dòng)器(Clay Adams)上培育。激酶反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)。培育后，將載片從雜交室取出，用10％SDS洗滌兩次，5分鐘，接著用水洗滌5到7次，5分鐘，同時(shí)振蕩。然后將載片立即轉(zhuǎn)移到結(jié)合液中45分鐘，同時(shí)振蕩，該結(jié)合液在0.05M NaOAc(pH4.0)、500mMNaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3中包含1μM化合物2。載片然后用50mMNaOAc(pH4.0)、10％甲醇溶液洗滌3次，每次15分鐘，接著水洗15分鐘。然后干燥載片，通過(guò)ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光和或者570納米或者592納米發(fā)射濾波器成像。鈣調(diào)素依賴(lài)性激酶II特異性地磷酸化糖原合成酶1-10肽。用543.5納米激發(fā)光和570納米發(fā)射濾波器，糖原合成酶肽是陣列上唯一發(fā)熒光的標(biāo)記肽。激酶反應(yīng)后檢測(cè)的敏感度至少為0.375納克或0.35皮摩爾。
實(shí)例21陣列形式的固定化激酶底物的檢測(cè)；Ab1肽底物的特異性檢測(cè)以下試驗(yàn)基本按實(shí)施例20所述的方法進(jìn)行，但有以下差別。兩種特異性肽，Ab1肽和Kemptide，從水溶液濃度為0.03到2毫克/毫升的起源板(384孔板)排列到水凝膠包被的載片(Perkin Elmer)上。Kemptide(New England Biolabs)是cAMP依賴(lài)性蛋白激酶(PAK)催化亞單位的底物，其氨基酸序列是L-R-R-A-S-L-G(MW 771)。陣列點(diǎn)樣同實(shí)施例20所述，激酶反應(yīng)按前述方法進(jìn)行。反應(yīng)用供給有酶的緩沖液和ATP在80微升體積中進(jìn)行，其含有3,750U/毫升或者300單位酶(Ab1蛋白酪氨酸激酶，NEB)。1×Ab1緩沖液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM二硫蘇糖醇、0.01％Brii35，pH 7.5。載片的標(biāo)記和成像按前述方法進(jìn)行。用543.5納米激發(fā)光和570納米發(fā)射濾波，Ab1肽底物是唯一在陣列上熒光標(biāo)記的肽。激酶反應(yīng)后檢測(cè)的敏感度至少為0.18納克或0.14皮摩爾。
實(shí)例22用本發(fā)明結(jié)合液和總蛋白染色劑SYPRORuby凝膠染色劑對(duì)磷酸化靶分子進(jìn)行參比分析將系列稀釋的磷酸化蛋白和非磷酸蛋白上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，凝膠染色如實(shí)例2所述方法。對(duì)于每種蛋白質(zhì)濃度和每種染色(磷蛋白和總蛋白)，照射凝膠并進(jìn)行熒光信號(hào)定量(強(qiáng)度)。然后將磷蛋白和總蛋白的熒光強(qiáng)度比率對(duì)孔中蛋白上樣量(納克)繪成曲線。接下來(lái)將每種染色劑的熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，該曲線圖可計(jì)算兩種染色劑中每一種的常量Y-截距值。然后將熒光強(qiáng)度值減去Y-截距值，得到的比率(磷蛋白比總蛋白)再對(duì)蛋白濃度作出曲線。在這次得到的曲線生成的數(shù)據(jù)中，染色的磷蛋白比率值是非磷酸化蛋白的50到100倍，因此非特異性染色和低豐度磷蛋白能與非磷酸化蛋白區(qū)別開(kāi)來(lái)。見(jiàn)圖10。
實(shí)例23于微陣列上固定化肽磷酸化期間結(jié)合ATP-γ-S及隨后用本發(fā)明的結(jié)合液檢測(cè)硫代磷酸酯包括Ab1肽、Kemptide和糖原合成酶1-10在內(nèi)的三種特異性肽從水溶液濃度為0.03微克/毫升到0.5毫克/毫升的源板(384孔板)排列到水凝膠包被的載片(PerkinElmer)上。蛋白質(zhì)點(diǎn)樣用BioChip ArrayTM(Packard Instrument公司，Meriden，CT)，其使用由4個(gè)玻璃毛細(xì)管組成的PiezoTipTM分樣器。蛋白質(zhì)從PiezoTipTM中以333皮升體積的小滴分發(fā)，產(chǎn)生直徑為175微米的陣列點(diǎn)，水平和垂直點(diǎn)距500微米(點(diǎn)距＝點(diǎn)中心到點(diǎn)中心的間距)。每種肽自由15個(gè)稀釋點(diǎn)組成的2倍系列稀釋重復(fù)排列4次，產(chǎn)生一240點(diǎn)陣列(包括60個(gè)水點(diǎn)＝0皮克/點(diǎn)蛋白質(zhì))。得到的肽濃度從0.01皮克/點(diǎn)到166.5皮克/點(diǎn)。排成陣列后載片在濕室內(nèi)過(guò)夜。然后，用含有100mM HEPES、1％BSA(pH7.5)的溶液封阻1小時(shí)，同時(shí)振蕩(Barnstead/Thermolyne Labquake電烤箱)。封阻后將載片在附加有帶載片固定器的轉(zhuǎn)子的小型微陣列高速(最大速度～6000rpm)離心機(jī)(Telechem)中短暫旋轉(zhuǎn)，以去掉多余液體。接著，將Grace BiolabsHybriwellTM雜交密封系統(tǒng)(40×22×0.25毫米)附到水凝膠包被的載片上以封閉含有水凝膠聚丙烯酰胺墊的區(qū)域，進(jìn)行激酶反應(yīng)。反應(yīng)用供給有酶的緩沖液在80微升反應(yīng)體積中進(jìn)行，其含有3750U/毫升或者300單位酶(Ab1蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，NEB)。1×Ab1緩沖液包括50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM EGTA、2mM二硫蘇糖醇、0.01％Brij 35，pH 7.5。用ATP-γ-S(Sigma Chemical公司)代替ATP，其工作濃度是0.10mM。同時(shí)，在提供有酶的情況下，僅用ATP在第二塊載片上進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)，其工作濃度為0.10mM。含酶的反應(yīng)液通過(guò)封蓋上的兩個(gè)開(kāi)口中的一個(gè)用移液管吸到HybriWellTM中。然后用封膠封口，置于CMT-雜交室(VWR Scientific)內(nèi)，在37℃培育器內(nèi)于章動(dòng)器(Clay Adams)上培育。激酶反應(yīng)進(jìn)行3小時(shí)。培育后，載片從雜交室取出，用10％SDS洗滌兩次，5分鐘，接著用水洗滌7次，5分鐘，同時(shí)振蕩。載片然后立即轉(zhuǎn)移到含1μM化合物2的50mM NaOAc(pH4.0)、500mM NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3溶液中45分鐘，同時(shí)振蕩。載片然后用50mM NaOAc(pH4.0)、4％乙腈洗滌3次，每次15分鐘，接著水洗15分鐘。載片干燥后，通過(guò)ScanArray5000XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光和或者570納米或者592納米發(fā)射濾波器成像。Ab1蛋白質(zhì)酪氨酸激酶用硫代磷酸酯(或如對(duì)照用磷酸鹽)磷酸化Ab1肽底物的酪氨酸殘基。用543.5納米激發(fā)光和570納米發(fā)射濾波器，Ab1肽是陣列上唯一熒光標(biāo)記的肽。激酶反應(yīng)后檢測(cè)的敏感度是2.6皮克用ATP-γ-S標(biāo)記的肽。相反，在使用ATP的對(duì)照反應(yīng)中，0.325皮克Ab1肽用含有化合物2的結(jié)合液標(biāo)記和檢測(cè)。
實(shí)例24通過(guò)膜上的固定化鏈霉親和素或磷酸根結(jié)合化合物分離磷酸肽將購(gòu)自Pall的Immunodyne膜通過(guò)加入足量的5到10毫克/毫升的鏈霉親和素或者BAPTA-胺浸潤(rùn)該膜來(lái)標(biāo)記(大約15微升/厘米2)。空氣干燥15到30分鐘后，用50％的乙腈/0.1％的TFA洗滌三次5分鐘，然后用水沖洗兩次5分鐘。用六毫米直徑的圓膜進(jìn)行試驗(yàn)。鏈霉親和素標(biāo)記的膜通過(guò)在200微升40uM化合物9/250uM GaCl3中浸漬來(lái)填充，BAPTA標(biāo)記的膜通過(guò)在200微升250uM GaCl3中浸漬來(lái)填充。用10％乙腈/400mM NaCl、100mM NaOAc(pH 4)洗滌一次后，用水沖洗兩次，將膜在100微升含有2非磷酸肽和3磷酸肽各2微克(大約6納摩爾總肽)的肽混合液中浸漬15分鐘。該膜用10％乙腈/400mM NaCl/100mM NaOAc(pH 4)洗滌一次后，用100mM NaOAc(pH 4)洗滌兩次，每次5分鐘。最后將該膜用100微升50％乙腈/0.1％TFA洗脫。洗脫液和肽上清液(膜培育后的肽溶液)準(zhǔn)備用于MALDI分析。
實(shí)例25用鐵磁流體珠粒上的固定化鏈霉親和素分離磷酸肽
A.使用BAPTA-生物素染料和鏈霉親和素鐵磁流體磁粒分離磷酸肽鏈霉親和素鐵磁流體磁粒與BAPTA-生物素化合物一起使用以將磷酸肽從復(fù)雜混合物中分離。生物素和鏈霉親和素之間的結(jié)合作用使磁粒標(biāo)記有化合物9和兩種羅丹明(rhodamine)-生物素染料(化合物15和化合物25)。洗掉磷酸根結(jié)合化合物后，將磁粒用0.1M GaCl3填充，然后用0.1M NaOAc(pH 4.0)洗滌。將50微升磁粒漿液(4毫克/毫升)加入到磷酸肽混合液中，總體積為100微升。磁粒輕微旋振20分鐘培育，用磁性分離器分離磁粒。除去上清液，將珠粒用100微升100mM NaOAc(pH4.0)洗滌2次。磷酸肽用100微升50％乙腈、0.1％TFA洗脫。分離出的肽用MALDI分析，結(jié)果顯示只有磷酸化肽被分離出來(lái)。
B.利用鏈霉親和素鐵磁流體顆粒的磷酸肽的定量結(jié)合用標(biāo)記后的鐵磁流體顆粒完成磷酸肽的定量結(jié)合。用化合物9標(biāo)記鏈霉親和素鐵磁流體顆粒，直到飽和。洗掉未結(jié)合的染料后，將顆粒用0.1M的GaCl3填充，然后用0.1M NaOAc(pH 4.0)沖洗。在100微升磁粒(4毫克/毫升)中加入含有550皮摩爾磷酸肽的標(biāo)準(zhǔn)肽混合物?；旌衔镌谳p微旋振下培育20分鐘。用磁性分離器分離顆粒，除去得到的上清液。珠粒用100微升100mM NaOAc(pH 4.0)洗滌2次，磷酸肽用0.15M氫氧化銨洗脫。95％以上的肽(550皮摩爾)被分離出來(lái)。
C.與堿消去/加成聯(lián)合的磷酸肽的鐵磁流體顆粒分離化合物9標(biāo)記的鏈霉親和素鐵磁流體(StFF)顆粒聯(lián)合堿消去/加成用于分離磷酸肽。將磷酸肽分離于StFF上，用50微升0.15M Ba(OH)2洗脫該些磷酸肽。隨后將3微升甲胺加入到洗脫物中，將肽在37℃培育1小時(shí)。反應(yīng)物用冰乙酸中和到pH 4.0，用ZipTips將洗脫的肽脫鹽。使用鏈霉親和素標(biāo)記的鐵磁流體珠?？墒褂H和素與生物素之間產(chǎn)生強(qiáng)相互作用，促進(jìn)較大的磷酸化靶分子的分離。
實(shí)例26用DTPA化合物沉淀磷酸肽將包含DTPA的磷酸根結(jié)合化合物(化合物20、化合物21和化合物22)用于沉淀反應(yīng)中以從復(fù)雜溶液中分離磷酸肽。沉淀反應(yīng)物含有100uM的化合物20、化合物21或化合物22、200uM GaCl3、100mM NaOAc(pH 4)及5微升8-肽混合物(各250納克/微升)。將樣品劇烈旋振20分鐘，然后14,000rpm離心5分鐘。移走上清液并保存起來(lái)，通過(guò)用吸管尖端重新懸浮并再離心，將沉淀物在100mM NaOAc(pH 4)中洗滌兩次。最終沉淀物用100微升50％乙腈、0.1％TFA溶解。上清液和沉淀物部分用50％乙腈、0.1％TFA作1∶100稀釋?zhuān)缓笈cMALDI基質(zhì)1∶1混合，然后點(diǎn)到MALDI靶上。MALDI分析證明磷酸化肽被選擇性分離。
實(shí)例27用本發(fā)明的結(jié)合液系列檢測(cè)總磷酸肽的含量，接著用磷酸酪氨酸特異性單克隆抗體及(A)Alexa Fluor647山羊抗小鼠或(B)ZenonTMOne Alexa Fluor647小鼠IgG標(biāo)記試劑來(lái)特異性檢測(cè)肽中的磷酸酪氨酸殘基，兩者均以微陣列形式進(jìn)行(A)將磷酸化和非磷酸化形式的Kemptide、pp60 c-src和DSIP這三對(duì)肽，從水溶液濃度為0.95納克/毫升到0.5毫克/毫升肽的起源板(384孔板)排列到水凝膠包被的載片(Perkin Elmer)上，這如實(shí)例20所使用BioChip ArrayerTM(Perkin Elmer)進(jìn)行。為特異性檢測(cè)陣列上的磷酸肽，將載片在包含1μM化合物2的結(jié)合液中在電烤箱上培育1小時(shí)，其緩沖液含有0.5M NaCl、20％1，2-丙二醇、1μM GaCl3及0.05M乙酸鈉(pH 4.0)。然后將載片在含4％乙腈的0.05M乙酸鈉(pH 4.0)中在電烤箱上洗滌1小時(shí)，接著用水洗滌15分鐘。載片然后在附加有帶載片固定器的轉(zhuǎn)子的微陣列高速離心機(jī)(Telechem)中以～6000rpm短暫旋轉(zhuǎn)，以去掉多余液體。載片干燥后，陣列通過(guò)ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光和570納米發(fā)射濾波器成像。結(jié)合液特異性標(biāo)記1.3到2.6皮克pDSIP、2.6到5.2皮克pKemptide和10.4到20.8皮克pp60 c-src(pY)。在磷酸肽檢測(cè)后，將載片立即置于含有50mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCI、0.2％Tween-20、0.25％MOWIOL-488、0.5％BSA的封阻緩沖液中，培育同時(shí)振蕩3到5小時(shí)。載片然后轉(zhuǎn)入含1∶1000(終濃度為1.5微克/毫升)稀釋的磷酸酪氨酸單克隆抗體(供給濃度為1.5毫克/毫升，P-Tyr-100，Cell Signaling Tech.)的封阻緩沖液(上述)中，在4℃過(guò)夜培育，同時(shí)振蕩。將載片用一級(jí)抗體過(guò)夜培育后，用封阻緩沖液洗滌三次十分鐘，然后在含有1∶5000稀釋(終濃度為0.4微克/毫升)的Alexa Fluor647山羊抗小鼠抗體(供給濃度為2毫克/毫升)的封阻沖液中培育45分鐘，同時(shí)振蕩。最后，載片用封阻緩沖液洗兩次十分鐘，接著用50mM tris(pH 7.5)、150mM NaCl進(jìn)行兩個(gè)5分鐘洗滌，用微陣列高速離心機(jī)短暫旋轉(zhuǎn)。載片干燥后，陣列通過(guò)ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光/570納米發(fā)射濾波器套組和632.8納米激光/670納米發(fā)射濾波器套組這兩種方案成像。用543.5納米激發(fā)光和570納米發(fā)射濾波器，未檢測(cè)到信號(hào)。用632.8納米激發(fā)光和670納米發(fā)射濾波器，特異性地檢測(cè)到pp60 c-src(pY)，敏感度為5.2皮克。
(B)載片用一級(jí)抗體過(guò)夜培育后，用封阻緩沖液沖洗三次十分鐘，然后在含有1∶5000稀釋(終濃度為2微克/毫升)的ZenonTMOne Alexa Fluor647小鼠IgG標(biāo)記試劑(供給濃度為200微克/毫升)的封阻緩沖液中培育45分鐘，同時(shí)振蕩。最后，載片用封阻緩沖液洗滌一次，5分鐘，接著用50mM tris(pH 7.5)、150mM NaCl再次洗滌5分鐘，用微陣列高速離心機(jī)短暫旋轉(zhuǎn)。載片干燥后，陣列通過(guò)ScanArray5000 XL微陣列分析系統(tǒng)(Packard Instrument公司，Meriden，CT)用543.5納米激光/570納米發(fā)射濾波器套組和632.8納米激光/670納米發(fā)射濾波器套組這兩種方案成像。用543.5納米激發(fā)光和570納米發(fā)射濾波器，未檢測(cè)到信號(hào)。用632.8納米激發(fā)光和670納米發(fā)射濾波器，特異性地檢測(cè)到pp60 c-src(pY)，敏感度為0.65皮克。
實(shí)例28用本發(fā)明的結(jié)合液對(duì)磷酸肽進(jìn)行大小排除管柱(SEC)及反相(RP)HPLC分析含有2到60uM磷酸肽(或者100uM非磷酸肽對(duì)照)、20uM化合物2、40uMGaCl3、100mM乙酸鈉(pH 4)及0到20％乙醇或異丙醇的樣品10到40微升注射到大小排除管柱上(Superdex 30、10×300毫米或者Superdex Peptide 3.2×300毫米)。流動(dòng)相是50mM乙酸鈉(pH 4)、500mM NaCl加20％乙醇或異丙醇。運(yùn)行時(shí)間為45分鐘。分別監(jiān)測(cè)214納米紫外光信號(hào)和555ex/580em熒光信號(hào)。
SEC結(jié)果表明，與非磷酸肽相比，在存在本發(fā)明的結(jié)合液和磷酸肽的情況下熒光信號(hào)強(qiáng)。
也通過(guò)反相HPLC用Vydac 238TP52、2.1×250毫米C18管柱對(duì)同一樣品進(jìn)行分析。溶劑A＝100mM乙酸鈉(pH 4)、0到20％乙醇。溶劑B＝100mM乙酸鈉(pH4)、20％乙醇、60％甲醇。然后進(jìn)行梯度分離，0到55％的溶劑B以0.2毫升/分鐘流速洗脫30分鐘。監(jiān)測(cè)UV(214納米)和熒光(ex 555/em 580)信號(hào)。
RP結(jié)果表明，在存在本發(fā)明結(jié)合液和不含氯化鎵的溶液的情況下，熒光信號(hào)增強(qiáng)。分析含有一含單磷酸酪氨酸、單磷酸蘇氨酸和單磷酸絲氨酸的肽的樣品，可得到相似的結(jié)果。
實(shí)例29用本發(fā)明的結(jié)合液檢測(cè)鏈霉親和素-聚苯乙烯珠粒上的磷酸肽鏈霉親和素-聚苯乙烯珠粒(4.0到4.9uM)用兩種生物素化合成肽之一、磷酸肽或者非磷酸肽填充。磷酸肽的分子量為1812克/摩爾，其氨基酸序列為生物素基-ε-胺基己?；?Glu-Pro-Gln-Tyr(PO3H2)-Glu-Glu-Ile-Pro-Ile-Tyr-Leu-OH。非磷酸肽的分子量為2342.55克/摩爾，其氨基酸序列為生物素基-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。用100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)填充珠粒，緊接著填充在染色前用相同緩沖液洗滌幾次。兩套珠粒均用1uM化合物2在包含0.05M乙酸鈉(pH 4,0)、1uM GaCl3、0.5M NaCl和20％1，2丙二醇的緩沖液中染色45分鐘。染色后，用0.05M乙酸鈉(pH4.0)、4％乙腈洗滌，按不同比率將磷酸肽填充珠粒與非磷酸肽填充珠?；旌?。所有步驟均用振蕩、嚴(yán)格的超聲處理及旋渦振蕩進(jìn)行。然后混合珠體通過(guò)Nikon Eclipse 800Epi-熒光顯微鏡用Omega Optical公司濾波器套組XF102-2(Exciter560AF55；Dichroic595DRLP；Emitter645AF75)成像。發(fā)現(xiàn)磷酸肽填充珠粒的熒光信號(hào)的強(qiáng)度平均為非磷酸肽填充珠粒的6倍。
實(shí)例30用本發(fā)明的結(jié)合液檢測(cè)結(jié)合到鏈霉親和素-聚苯乙烯顆粒上的多底物的激酶調(diào)節(jié)磷酸化鏈霉親和素-聚苯乙烯珠粒(4.0到4.9μM)用稱(chēng)為crosstide的生物素化合成肽填充。Crosstide是絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt/蛋白激酶B的肽底物，其為一1808克/摩爾的肽，具有以下氨基酸序列Gly-Ary-Pro-Arg-Thr-Ser-Ser-Phe-Ala-Glu-Gly。用100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)填充珠粒，緊接著填充在染色前用相同緩沖液洗滌數(shù)次。然后將鏈霉親和素-聚苯乙烯顆粒上的crosstide用500納克的Akt/PKB激酶在補(bǔ)充有200uM ATP的40微升15mM MOPS(pH 7.2)、18.75mMβ-磷酸甘油、3.75mM EDTA、0.75mM原釩酸鈉、0.75mM DTT中進(jìn)行磷酸化。對(duì)照反應(yīng)在一除了激酶以外所有反應(yīng)組份(包括ATP)均加有的條件下進(jìn)行。磷酸化反應(yīng)在持續(xù)振蕩的條件下30℃反應(yīng)60分鐘，通過(guò)100℃培育珠粒和激酶5分鐘來(lái)中止反應(yīng)。然后通過(guò)在100mM tris、100mM NaCl(pH 7.5)中培育再次洗滌珠粒，接著用1uM的化合物2在含0.05M乙酸鈉(pH 4.0)、1uM GaCl3、0.5M NaCl和20％1，2丙二醇的緩沖液中染色45分鐘。染色后，用0.05M乙酸鈉(pH 4.0)、4％乙腈洗滌珠粒，通過(guò)Nikon Eclipse 800 Epi-熒光顯微鏡用Omega Optical公司濾波器套組XF102-2(Exciter560AF55；Dichroic595DRLP；Emitter645AF75)成像。發(fā)現(xiàn)暴露給Akt/PKB激酶的肽填充珠粒的熒光信號(hào)的強(qiáng)度是未暴露給Akt/PKB激酶的對(duì)照肽填充珠粒的2.2倍(在標(biāo)準(zhǔn)偏差中無(wú)交疊)。
實(shí)例31化合物2的合成將溶于20毫升丙酸中的3-二甲胺基酚(0.47克、3.5毫摩爾)及5-氟-5′-甲酰基BAPTA四甲基酯(1.00克、1.7毫摩爾)溶液在110℃加熱2小時(shí)，冷卻，倒入到120毫升NaOAc水溶液中。用水沖洗得到的紫色膠狀體，將其溶于乙酸中，蒸發(fā)，得到1.20克二氫-羅丹-5F四甲基酯，其為紅色泡沫。
將四氯苯醌(0.51克、2.0毫摩爾)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(40毫升)的二氫-羅丹-5F四甲基酯(1.2克、1.5毫摩爾)的溶液中。將溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜用氯仿/甲醇/乙酸(50∶5∶1)作為洗脫液純化，得到0.54克羅丹-5F四甲基酯，其為紅色泡沫。
將1M KOH(4.4毫升、4.4毫摩爾)加入到溶于二氧雜環(huán)己烷(25毫升)的羅丹-5F四甲基酯(0.48克、0.55毫摩爾)溶液中。將溶液攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)。殘留物溶于10毫升水中，再加入50毫升5％HCl。過(guò)濾沉淀物，干燥，得到275毫克羅丹-5F游離酸，其為紅色粉末。這一產(chǎn)物用KOH水溶液轉(zhuǎn)化為鉀鹽，接著通過(guò)柱色譜在SephadexLH-20上用水洗脫，得到三鉀鹽化合物2，其為紅色粉末。
實(shí)例32化合物5(羅丹明BAPTA化合物)的合成溶于20毫升丙酸溶液中的8-羥基久洛尼定(8-hydroxyjulolidine)(0.76克、4.1毫摩爾)、5-氟-5′-甲?；鵅APTA四甲基酯(1.16克、2.0毫摩爾)和p-TsOH(20毫克)在60℃加熱過(guò)夜，然后冷卻，倒入到150毫升3M NaOAc水溶液中。過(guò)濾收集紫色粉末，用水沖洗，干燥，得到2.15克二氫-X-羅丹-5F四甲基酯，其為紫色粉末。
將四氯苯醌(1.45克、5.9毫摩爾)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(80毫升)的二氫-X-羅丹-5F四甲基酯(2.1克、2.4毫摩爾)溶液中。將溶液在室溫下攪拌4小時(shí)，然后蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜用氯仿/甲醇/乙酸(50∶5∶1)純化，得到3.0克X-羅丹-5F四甲基酯，其為紅色泡沫。
將1M KOH(30毫升、30毫摩爾)加入到溶于二氧雜環(huán)己烷(25毫升)和甲醇(25毫升)的X-羅丹-5F四甲基酯(3.0克、2.9毫摩爾)溶液中。將溶液攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)。將殘留物溶于10毫升水中，加至50毫升5％HCl。過(guò)濾沉淀物，干燥，得到500毫克化合物5游離酸，其為紫色粉末。將100毫克該游離酸用KOH水溶液轉(zhuǎn)化為鉀鹽，接著通過(guò)色譜在Sephadex LH-20上用水洗脫，得到40毫克化合物5的鉀鹽，其為紫色粉末。
實(shí)例33喹唑啉酮標(biāo)記的BAPTA(Q-BAPTA)化合物(化合物7和化合物23)的合成5-氟-Q-BAPTA(化合物7)的制備將催化量的對(duì)甲基苯磺酸(TsOH)加入到溶于10毫升二氯乙烷/5毫升乙醇的氨基苯酰氨(29毫克、0.21毫摩爾)和5′-氟-5-甲?；?4-羥基-BAPTA四甲基酯(128毫克、0.21毫摩爾)溶液中。將該溶液回流過(guò)夜后，冷卻。加入四氯苯醌(57毫克、0.23毫摩爾)。兩個(gè)小時(shí)后，將溶液蒸發(fā)，殘留物通過(guò)快速色譜用5％甲醇/氯仿純化，得到50毫克化合物7的四甲基酯，其為淡琥珀色的不可流動(dòng)的油狀體；M/Z為711(用分子式C34H34N4O12F計(jì)算為710)。
將1M KOH水溶液(0.56毫升、0.56毫摩爾)加入到溶于1∶1二氧雜環(huán)己烷∶甲醇(5毫升)中的化合物7的四甲基酯(50毫克、0.07毫摩爾)的綠色溶液中。將黃色溶液攪拌過(guò)夜然后蒸發(fā)。殘留物在Sephadex LH-20上用水純化，得到53毫克化合物7的鉀鹽，其為黃色粉末；M/z(陽(yáng)性模式)為655(用分子式C30H23N4O12F計(jì)算為651)。
5.6-二氟-Q-BAPTA(化合物23)的制備將5，6-二氟-4′-羥基-5-甲酰基-5′-BAPTA四甲基酯(0.100克、0.163毫摩爾)及氨基苯酰氨(0.022克、0.162毫摩爾)溶于二氯甲烷(10毫升)與乙醇(5毫升)的混合物中。加入TsOH(5毫克)，將反應(yīng)混合物回流3小時(shí)。將四氯苯醌(0.044克、0.18毫摩爾)加到該溶液中。將混合物再回流兩個(gè)小時(shí)，然后蒸發(fā)。粗產(chǎn)物通過(guò)制備型TLC用2∶1氯仿∶乙酸乙酯作為洗脫液純化。將主要組份(Rf＝0.5)用乙酸乙酯分離，蒸發(fā)溶液后得到5，6-二氟-Q-BAPTA四甲基酯(0.029克、24％)，其為無(wú)色粉末。
將5，6-二氟Q-BAPTA四甲基酯(0.027克、0.037毫摩爾)溶解到1毫升甲醇與1毫升二氧雜環(huán)己烷混合物中。將1M KOH(1毫升)加到該溶液中，反應(yīng)混合物在室溫下過(guò)夜。蒸發(fā)掉揮發(fā)性物質(zhì)，將粗產(chǎn)物再溶于水，在Sephadex LH-20管柱上純化，用水洗脫。產(chǎn)物凍干后得到0.021克5，6-二氟-Q-BAPTA鉀鹽(化合物23)(R＝CH2CO2K)，其為黃色粉末。
化合物23 實(shí)例34(硼聚吖吲得辛BAPTA)化合物(化合物8和化合物24)的合成BODIPY FL染料BAPTA-5F(化合物8)的制備將70％的硝酸(0.15毫升、2.3毫摩爾)加入到溶于9毫升乙酸酐的5-氟BAPTA四甲基酯(1.00克、1.82毫摩爾)冷溶液中。10分鐘后，將反應(yīng)溶液倒入30毫升NaOAc水溶液中，然后加入飽和的碳酸氫鈉水溶液。將混合物用氯仿(2×30毫升)提取。提取物用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，濃縮成琥珀色殘留物。然后將殘留物通過(guò)快速色譜用乙酸乙酯/乙烷純化，得到0.43克5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯，其為黃色粉末。
將1M KOH(5.8毫升、5.8毫摩爾)加入到溶于1∶1的甲醇/二氧雜環(huán)己烷(10毫升)的5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯(0.43克、0.72毫摩爾)溶液中。將溶液攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)。將殘留物溶于10毫升水中，然后用HCl水溶液調(diào)低pH值到2。收集沉淀物，干燥，得到0.31克5-硝基-5′-氟-BAPTA游離酸，其為黃色粉末。
將溶于30毫升甲醇中的5-硝基-5′-氟-BAPTA游離酸(0.31克、0.58毫摩爾)溶液在10％鈀/炭(Pd/carbon)(0.15克)上在38psi的氫氣環(huán)境下振蕩6小時(shí)，然后過(guò)濾，蒸發(fā)，得到0.26克5-氨基-5′-氟-BAPTA游離酸，其為無(wú)色粉末。
將溶于5毫升無(wú)水THF中的BODIPY FL染料(Molecular Probes，公司D-2183，27毫克、0.09毫摩爾)用草酰氯(0.20毫摩爾)和二異丙基乙胺(DIEA，0.20毫摩爾)在氬氣環(huán)境下處理。15分鐘后，將溶液蒸發(fā)。將殘留物溶于3毫升無(wú)水二氧雜環(huán)己烷，然后將該溶液緩慢加入到已用碳酸鈉調(diào)pH到pH＝9.5的5-氨基-5′-氟-BAPTA游離酸(50毫克、0.1毫摩爾)溶于水(5毫升)中的溶液中該溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)濃縮到將干狀態(tài)。用水在Sephadex LH-20上洗脫純化該溶液，得到41毫克BODIYP FL染料DBAPTA-5F(化合物8)鈉鹽，為桔紅色粉末。
BODIPY FL染料-EDA-BAPTA(化合物24)的制備將溶于3毫升水的BODIYPFL鹽酸乙二胺鹽(15毫克、0.04毫摩爾，Molecular Probes)溶液的pH通過(guò)滴加碳酸氫鈉水溶液提高到7.6。添加溶解到2毫升二氧雜環(huán)己烷中的5-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸(22毫克、0.04毫摩爾)溶液。用碳酸鈉水溶液將pH調(diào)高到9.5，將該橙黃色溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。將溶液蒸發(fā)到2毫升，通過(guò)Sephadex LH-20用水洗脫純化，得到17毫克BODIPY FL-EDA-BAPTA鈉鹽(化合物24)，凍干后其為微細(xì)橙黃色粉末(R＝CH2CO2Na)。
化合物24 實(shí)例35生物素化BAPTA化合物(化合物9、化合物12及化合物18)的合成生物素-BAPTA-5F(化合物12)的制備將5-硝基-5′-氟-BAPTA四甲基酯的溶液通過(guò)溶于乙酸乙酯中的10％Pd/C的催化加氫作用還原。得到的5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯(0.10克、0.18毫摩爾)溶于無(wú)水二氯甲烷/THF(4∶1，5毫升)中，加入戊二酐(40毫克、0.36毫摩爾)及催化劑DMAP。將溶液攪拌過(guò)夜然后蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜用10％的甲醇/氯仿純化，得到0.13克油狀5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯戊二酰胺。
將四氟硼酸N-羥基琥珀酰亞胺鹽(108毫克、0.36毫摩爾)加入到溶于5毫升無(wú)水THF及5毫升無(wú)水乙腈中的5-胺基-5′-氟-BAPTA四甲基酯戊二酰胺(0.18毫摩爾)中。兩小時(shí)后，加入溶于2毫升無(wú)水DMF中的生物素氫溴酸乙二胺(66毫克、0.18毫摩爾，Molecular Probes)及DIEA(0.05毫升)。攪拌過(guò)夜后，將揮發(fā)物蒸發(fā)。殘留物用水(15毫升)粉碎，收集所得沉淀物，水洗，干燥得到0.10克生物素-BAPTA-5F四甲基酯，其為灰色粉末。
將1M KOH(1.0毫升、1.0毫摩爾)加入到溶于1∶1甲醇/二氧雜環(huán)己烷(4毫升)中的生物素-BAPTA-5F四甲基酯(0.10克、0.11毫摩爾)溶液中。將溶液攪拌過(guò)夜，然后蒸發(fā)。殘留物通過(guò)Sephadex LH-20用水純化，得到生物素-BAPTA-5F(化合物12)鉀鹽，凍干后為無(wú)色粉末。
羅丹-生物胞素(化合物18)的制備將1.1當(dāng)量的N-t-BOC-乙二胺及1.1當(dāng)量的DIEA加入到溶于無(wú)水THF中的0.5M4-(琥珀酰亞胺基氧基羰基)-羅丹-四甲基酯溶液中。將得到的溶液攪拌30分鐘，然后蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜用氯仿/甲醇/乙酸純化。將純化后的碳酸鹽溶于二氯甲烷中，用三氟乙酸(20當(dāng)量)處理。將該溶液攪拌30分鐘，然后蒸發(fā)，干燥，得到4-羧基-羅丹四甲基酯乙二胺甲酰胺。
將N-t-BOC-生物胞素琥珀酰亞胺酯(1.5當(dāng)量，在Wilbur等人，BioconjugateChemistry，11584-98(2000)中有描述)及DIEA(1.5當(dāng)量)加入到溶解于DMF的0.5M的4-羧基-羅丹四甲基酯乙二胺甲酰胺溶液中。得到的溶液在室溫下攪拌直到TLC顯示熒光起始物質(zhì)消耗盡。將揮發(fā)物真空除去，殘留物通過(guò)快速色譜用氯仿/甲醇/乙酸純化，得到N-t-BOC-羅丹-生物胞素四甲基酯。
用12當(dāng)量的1M KOH處理溶于1∶1甲醇/二氧雜環(huán)己環(huán)的0.5M N-t-BOC-羅丹-生物胞素四甲基酯溶液。將得到的溶液室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后蒸發(fā)到干燥。殘留物通過(guò)Sephadex LH-20用水純化，得到化合物18，凍干后為紅色粉末(R＝CH2CO2K)。
化合物18 羅丹-4-生物素-BAPTA(化合物9)的制備(2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(20.15克、0.10摩爾)、(4-羥基-3-硝基)苯甲酸甲酯(21.67克、0.11摩爾)和k2CO3(27.60克、0.20摩爾)的懸浮液在130℃攪拌16小時(shí)，冷卻至室溫，倒入冰水(1.2升)中。過(guò)濾沉淀物，水洗，干燥，得到32.00克(4′-甲氧羰基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷，其為黃色固體。將(4′-甲氧羰基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷(20.克、55.2毫摩爾)在DMF(300毫升)中的10％的Pd/C(3.0克)中于40psi下氫化5小時(shí)。將混合物通過(guò)硅藻土與催化劑過(guò)濾分開(kāi)。將濾出物蒸發(fā)，加入乙醚(100毫升)。將產(chǎn)物過(guò)濾，用乙醚(2×25毫升)洗滌，得到13.2克1′-胺基-4′-甲氧羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將(2′-胺基-4′-甲氧羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(13.20克、44毫摩爾)、甲醇(50毫升)、二氧雜環(huán)己環(huán)(50毫升)及1M KOH(100毫升、100毫摩爾)的混合物在65℃攪拌5小時(shí)，然后室溫過(guò)夜。將混合物蒸發(fā)，并將殘留物懸浮于H2O(500毫升)中。加入1M HCl水溶液至pH 5.0。過(guò)濾沉淀產(chǎn)物，用H2O洗滌，在濾器上干燥4小時(shí)，然后用乙醚洗滌(3×25毫升)，得到12.5克2′-胺基-4′-羧基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將二苯甲酮腙(benzphenone hydrazone)(6.66克、34毫摩爾)和黃色HgO(17.60克、80毫摩爾)在己烷(200毫升)中劇烈攪拌3小時(shí)，以制備二苯基重氮甲烷。將混合物過(guò)濾與無(wú)機(jī)物分開(kāi)，蒸發(fā)，殘留物溶于丙酮(50毫升)中。將該溶液加到丙酮中的2′-胺基-4-羧基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷的懸浮液中?；旌衔镌?5℃攪拌16小時(shí)，然后經(jīng)2小時(shí)用AcOH(2毫升)分解過(guò)量的二苯基重氮甲烷。將混合物蒸發(fā)，粗產(chǎn)物通過(guò)快速色譜在SiO2上用CHCl3作為洗脫液純化，得到6.80克2′-胺基-(4′-聯(lián)苯基甲氧基羰基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將MeCN(400毫升)中的2′-胺基-4′-聯(lián)苯基甲氧基羰基苯氧基-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(8.28克、18.24毫摩爾)、DIEA(16.3毫升、94毫摩爾)、溴乙酸甲酯(35.3毫升、376毫摩爾)及NaI(1.50克、10毫摩爾)混合物回流攪拌70小時(shí)，冷卻至室溫，蒸發(fā)。殘留物溶于CHCl3(500毫升)，用1％AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、飽和NaCl(200毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于己烷的30％到40％的EtoAC梯度液作為洗脫液純化，得到10.01克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-BAPTA四甲基酯，其為白色固體。
將溶于DMF(15毫升)的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-BAPTA四甲基酯(3.71克、5毫摩爾)溶液加入到溶于DMF(35毫升)的由POCl3(5毫升、50毫摩爾)制成的Vilsmeier試劑溶液中。將混合物于40℃攪拌24小時(shí)，然后加入另一部分Vilsmeier試劑(25毫摩爾)，將該混合物于40℃攪拌70小時(shí)。將混合物冷卻至室溫，迅速倒入冰-飽和K2CO3混合(1200毫升)中。1小時(shí)后，過(guò)濾沉淀物，用H2O洗滌，干燥，得到3.78克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-5′-甲醯基-BAPTA四甲基酯，其為無(wú)色固體。
將在丙酸(40毫升)中的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-5′-甲?；?BAPTA四甲基酯(2.90克、3.8毫摩爾)、m-二甲胺基酚(1.21克、8.8毫摩爾)和TsOH(100毫克)混合物在68℃攪拌20小時(shí)，然后冷卻至室溫并倒入3M NaOAc(600毫升)中。1小時(shí)后，過(guò)濾沉淀物，用水洗滌，干燥，得到3.70克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-二氫羅丹四甲基酯，其為紫紅色固體。
將在CHCl3及MeOH(每種40毫升)中的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-二氫羅丹四甲基酯(2.050克、2.0毫摩爾)和粉狀四氯苯醌(0.492克、2.0毫摩爾)的混合液攪拌2小時(shí)，過(guò)濾，蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于CHCl3的5到6.5％MeOH/1％AcOH作為洗脫液純化，得到粗產(chǎn)品，將其重溶于CHCl3中，與SiO2過(guò)濾分開(kāi)，蒸發(fā)，得到0.533克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
向溶于二氧雜環(huán)己烷(2毫升)及MeOH(1毫升)的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-羅丹四甲基酯(51毫克、0.05毫摩爾)中加入1M KOH至pH 12.0。將該混合液攪拌20小時(shí)，然后用0.1M HCl調(diào)pH至9.0。將混合液蒸發(fā)，殘留物在Sephadex LH-20上用H2O作為洗脫液純化。凍干產(chǎn)物，得到26毫克4-羧基-羅丹四鉀鹽，其為紅紫色固體。
將TFA(10毫升)加入到溶于CHCl3(10毫升)的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基-羅丹四甲基酯(102毫克、0.1毫摩爾)中，將得到的混合液攪拌1小時(shí)，然后蒸發(fā)，加入CHCl3(3×10毫升)共蒸發(fā)。加入乙醚(10毫升)，過(guò)濾沉淀物，用乙醚(3×10毫升)洗滌，得到82毫克4-羧基-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
將DIEA(0.35毫升、2毫摩爾)及干燥的O-三氟乙酰基-N-羥基琥珀酰亞胺(TFA-SE，225毫克、1毫摩爾)加入到溶于DMF(2毫升)的4-羧基-羅丹四甲基酯(80毫克、0.093毫摩爾)中。將混合液攪拌2小時(shí)，然后加入更多的TFA-SE(113毫克、0.5毫摩爾)，將混合液再攪拌16小時(shí)?；旌弦河肅HCl3(50毫升)稀釋?zhuān)?％AcOH(3×20毫升)、H2O(25毫升)、飽和NaCl(50毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。加入乙醚(25毫升)，過(guò)濾沉淀產(chǎn)物，用乙醚洗滌，得到86毫克4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
將4-(琥珀酰亞胺基氧基羰基)-羅丹四甲基酯(36毫克、0.038毫摩爾)溶液加入到溶于DMF(1毫升)及DIEA(0.055毫升、0.40毫摩爾)的生物素尸胺(34毫克、0.077毫摩爾)中。將混合物攪拌3小時(shí)，用CHCl3(200毫升)稀釋?zhuān)?％AcOH(3×150毫升)、H2O(100毫升)、飽和NaCl(200毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。殘留物在兩個(gè)制備型TLC SiO2板上用溶于CHCl3的12％MeOH和2.5％AcOH溶液作為洗脫液純化，得到38毫克4-(N-(5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-羅丹四甲基酯。
向溶于MeOH(2毫升)和H2O(1毫升)的4-(N-(5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-羅丹四甲基酯(30毫克、0.025毫摩爾)中加入1M KOH至pH12.0。將混合液攪拌20小時(shí)，然后用0.1M HCl調(diào)pH到pH 8.5。將混合液蒸發(fā)，殘留物在Sephadex LH-20上用H2O作為洗脫液純化。凍干產(chǎn)品，得到30毫克化合物9(4-N-5″-生物素基胺基戊基)胺基羰基)-羅丹四鉀鹽)，其為橙紅色固體。
實(shí)例364-(4′-胺基苯基-2-乙胺基)羧甲基羅丹三鉀鹽(化合物10)的合成將(2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(5.87克、29毫摩爾)、4-羥基-3-硝基苯基乙酸甲酯(6.15克、29毫摩爾)和K2CO3(8.28克、60毫摩爾)懸浮液在120℃攪拌16小時(shí)，冷卻至室溫，倒進(jìn)冰水(0.6升)中。過(guò)濾沉淀物，用H2O洗滌，干燥，得到4.49克(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷，其為黃色固體。
將(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(2″-硝基苯氧基)乙烷(9.6克、25.5毫摩爾)在40psi下用溶于DMF(250毫升)的10％Pd/C氫化16小時(shí)。將混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾與催化劑分開(kāi)。將濾液蒸發(fā)濃縮，殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于己烷的25到35％EtOAc梯度液純化，得到5.53克(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(5.50克17.4毫摩爾)、甲醇(40毫升)、二氧雜環(huán)己烷(40毫升)及1M KOH(35毫升、35毫摩爾)的混合物在45℃攪拌1小時(shí)，然后室溫過(guò)夜。蒸發(fā)混合物，將殘留物懸浮在H2O(100毫升)。加1M HCl水溶液到pH 3.0。過(guò)濾沉淀產(chǎn)物，用H2O洗滌，干燥，得到4.59克(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將二苯甲酮腙(2.94克、15毫摩爾)和黃色HgO(8.80克、40毫摩爾)在己烷(70毫升)中劇烈攪拌5小時(shí)，得到二苯基重氮甲烷。將混合物過(guò)濾，與無(wú)機(jī)物分開(kāi)，蒸發(fā)濃縮濾液，殘留物重溶于丙酮(20毫升)。將該溶液加入到溶于丙酮(120毫升)的2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(3.02克、10毫摩爾)中。將得到的混合物在35℃攪拌16小時(shí)，然后用AcOH(0.5毫升)經(jīng)2小時(shí)分解過(guò)量的二苯基重氮甲烷。蒸發(fā)混合物，粗產(chǎn)物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于CHCl3的1％的MeOH作為洗脫液純化，得到4.44克(2′-胺基-4′-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將溶于MeCN(90毫升)的2′-胺基-4′-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基苯氧基)乙烷(2.12克、4.5毫摩爾)、DIEA(4.0毫升、23.5毫摩爾)、溴乙酸甲酯(8.8毫升、94毫摩爾)及NaI(0.50克、4.7毫摩爾)混合物回流70小時(shí)，冷卻至室溫，蒸發(fā)。殘留物溶于CHCl3(500毫升)，用1％的AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、飽和NaCl(200毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。將殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2管柱上用溶于己烷的30到40％的EtOAC梯度液作為洗脫液純化，得到2.82克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-BAPTA四甲基酯，其為無(wú)色固體。
將溶于DMF(5毫升)的4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-BAPTA四甲基酯(3.78克、5毫摩爾)溶液加入到溶于DMF(10毫升)的由POCl3(1.5毫升，30毫摩爾)制備的Vilsmeier試劑溶液中。將混合物攪拌24小時(shí)，然后快速倒入到冰-飽和K2CO3混合液(500毫升)中。將混合液用CHCl3提取，用MgSO4干燥，蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物在SiO2上用溶于己烷的30到40％EtOAc梯度液純化，得到1.65克醛基4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-5′-甲醯基-BAPTA四甲基酯，其為無(wú)色固體。
將丙酸(10毫升)中的4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-5′-甲?；?BAPTA四甲基酯(784毫克、1.0毫摩爾)、m-二甲胺基酚(301毫克、2.2毫摩爾)及TsOH(20毫克，催化劑)的混合物在65℃攪拌20小時(shí)，然后冷卻到室溫，倒入到3M NaOAc(150毫升)中。1小時(shí)后，過(guò)濾沉淀物，用水洗滌，干燥，得到450毫克4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-二氫羅丹四甲基酯，其為紫紅色固體。
將CHCl3和MeOH(每種20毫升)中的4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-二氫羅丹四甲基酯(420毫克、0.43毫摩爾)和粉狀四氯苯醌(122毫克、0.5毫摩爾)的混合物攪拌3小時(shí)，過(guò)濾，蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于CHCl3的5到7％MeOH/0.5％AcOH梯度液作為洗脫液純化，得到粗產(chǎn)品，其重溶于CHCl3，過(guò)濾與SiO2分開(kāi)，蒸發(fā)，得到275毫克4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-5′-四甲基)-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
將TFA(20毫升)加入到溶于CHCl3(20毫升)的4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-5′-四甲基)-羅丹四甲基酯(250毫克、0.25毫摩爾)溶液中，并將得到的混合物攪拌1小時(shí)，然后蒸發(fā)，與CHCl3(3×30毫升)共蒸發(fā)。將乙醚(30毫升)加到殘留物中，過(guò)濾沉淀物，用乙醚(3×10毫升)洗滌，得到200毫克4-羧甲基-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
將干燥的TFA-SE(338毫克、1.5毫摩爾)加入到溶于DMF(5毫升)及DIEA(0.40毫升、2.2毫摩爾)的4-羧甲基-羅丹四甲基酯(128毫克、0.15毫摩爾)中。將混合物攪拌16小時(shí)，然后加入4-胺基苯乙胺(0.4毫升、4毫摩爾)及DIEA(0.4毫升、2.2毫摩爾)溶液。將混合物攪拌2小時(shí)，用CHCl3(500毫升)稀釋?zhuān)?％AcOH(3×100毫升)、飽和NaCl(2×200毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。將乙醚(25毫升)加到殘留物中，過(guò)濾沉淀產(chǎn)物，用乙醚洗滌，得到126毫克4-(4′-(胺基苯基)-2-乙胺基)羰基甲基-羅丹四甲基酯，其為深紅色固體。
向溶于二氧雜環(huán)己烷(2毫升)、MeOH(2毫升)及H2O(1毫升)的4-(4′-(胺基苯基)-2-乙胺基)羰基甲基-羅丹四甲基酯(100毫克、0.1毫摩爾)溶液中加入1M KOH至pH 12.0。將混合物攪拌50小時(shí)，然后用0.1M HCl調(diào)pH到9.0。將混合物蒸發(fā)，殘留物在Sephadex LH-20上用H2O作為洗脫液純化，產(chǎn)物凍干得到21毫克化合物10，其為橙紅色固體。
實(shí)例37BAPTA-瓊脂糖化合物(化合物13及化合物14)的合成BAPTA-瓊脂糖化合物(化合物13)的制備將溶于3毫升無(wú)水DMF的5-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸(65毫克、0.12毫摩爾，美國(guó)專(zhuān)利第5,453,517號(hào))的溶液加入到用15毫升DMF稀釋的胺基瓊脂糖漿液(50％水性漿液，16微摩爾胺/毫升，6毫升，96微摩爾胺，Pierce)中。用DIEA(1.5毫升)將pH提高到10。將得到的淡棕色混合物在室溫?cái)嚢?8小時(shí)，然后離心。將BAPTA-瓊脂糖(化合物13)沉淀小塊用丙酮(2x)及水(2x)漂洗，然后懸浮于水中。
BAPTA-5F-瓊脂糖(化合物14)的制備將溶于12毫升HCl水溶液中的5-胺基-5’-氟-BAPTA游離酸(0.26克、0.51毫摩爾)溶液用12毫升氯仿稀釋?zhuān)缓笥枚攘蚧?3毫升)處理。將該橙黃色混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后蒸發(fā)。將混合物離心，得到棕色膠狀物，干燥，然后溶于2毫升無(wú)水THF中。加入20毫升乙酸乙酯得到沉淀物，將沉淀物通過(guò)離心分離，得到5-氟-5’-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸，其為淡灰棕色粉末。
將溶于1毫升無(wú)水DMF的5-氟-5’-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸(25毫克、0.05毫摩爾)加入到用5毫升DMF稀釋的2毫升50％胺基瓊脂糖水性漿液中。用幾滴DIEA將pH提高到10。將該淡棕色混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，然后離心。將BAPTA-5F-瓊脂糖(化合物14)沉淀小塊用丙酮(2x)及水(2x)漂洗，然后懸浮于水中。
實(shí)例38化合物15(TAMRA-生物素BAPTA化合物)的合成將溶于5毫升二氧雜環(huán)己烷的BAPTA-4-異硫氰酸根基(18毫克、0.033毫摩爾)溶液加入到溶于4毫升水中的5-(和-6)-四甲基羅丹明生物胞素(Molecular Probes公司，29毫克、0.033毫摩爾)溶液中。得到的pH(3.5)用碳酸鈉水溶液提高到10。將得到的紅色溶液在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜，真空濃縮。殘留物通過(guò)柱色譜在SephadexLH-20上用水作為洗脫液純化。產(chǎn)物凍干，得到26毫克TAMRA-生物素-BAPTA，其為紅色粉末。LCMS m/2 726(按分子式C73H84N11O17S2計(jì)算為1452)。
實(shí)例39化合物16(羅丹明BAPTA化合物)的合成將溶于5毫升丙酸的5-甲?；?5’-硝基-BAPTA四甲基酯(200毫克、0.33毫摩爾)及8-羥基久洛尼定(125毫克、0.66毫摩爾)在70℃氮?dú)鈼l件下加熱1小時(shí)，冷卻到室溫，倒入到30毫升濃縮的乙酸鉀溶液中。將混合物用氯仿提取，然后用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)，得到紅色油狀體，將其通過(guò)快速色譜用乙酸乙酯/己烷純化，得到0.225克二氫-X-羅丹-5N四甲基酯，其為黃色泡沫。
將四氯苯醌(40毫克、0.16毫摩爾)加入到溶于1∶1氯仿/甲醇(5毫升)的二氫-X-羅丹-5N四甲基酯(0.12克、0.12毫摩爾)中。將溶液攪拌過(guò)夜，用50毫升氯仿稀釋?zhuān)名}水洗滌，用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜用15％甲醇/氯仿純化，得到63毫克X-羅丹-5N四甲基酯，其為紫色粉末。
將2M KOH(0.6毫升，1.2毫摩爾)加入到溶于5毫升甲醇的X-羅丹-5N四甲基酯(0.11克、0.11毫摩爾)中。將溶液在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，然后蒸發(fā)。將殘留物溶解于水(5毫升)中，用2M HCl將pH降低到2。通過(guò)離心收集沉淀物，將其溶解于新鮮KOH水溶液中，用HCl水溶液沉淀。將這一程序重復(fù)五次，得到90毫克化合物16游離酸，其為紫色粉末。
實(shí)例404-羥基-5-苯并噻唑基-BAPTA(化合物17)的合成將溶于DMSO(5毫升)的4-羥基-5-甲酰基-5’-甲基BAPTA四甲基酯(0.40克、0.68毫摩爾)及2-胺基苯硫酚(75毫克、0.70毫摩爾)的溶液加熱回流15分鐘。冷卻后將該黃色溶液用50毫升水稀釋。過(guò)濾黃色沉淀物，將其干燥，然后通過(guò)快速色譜用乙酸乙酯/己烷純化，得到0.22克4-羥基-5-苯并噻唑基-BAPTA四甲基酯，其為黃色泡沫。
將1M KOH(3.0毫升、3.0毫摩爾)加入到溶于1∶1甲醇/二氧雜環(huán)己烷(10毫升)的4-羥基-5-苯并噻唑基-BAPTA四甲基酯(0.21克、0.30毫摩爾)中。將溶液攪拌3小時(shí)，然后蒸發(fā)。殘留物在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到0.13克化合物17，其為黃綠色粉末(R＝CH2CO2K)。
化合物17
實(shí)例414′-羧甲基-4-甲氧基-羅丹鉀鹽(化合物19)的合成將(4′-甲氧基-2′-硝基苯氧基)-2-氯乙烷(11.29克、48.7毫摩爾)、4-羥基-3-硝基苯基乙酸甲酯(10.80克、51.2毫摩爾)及K2CO3(13.80克、100毫摩爾)的懸浮液在130℃攪拌4小時(shí)，冷卻至室溫，倒入到冰水(0.8升)中，讓其凝結(jié)2天。過(guò)濾沉淀物，將其用H2O洗滌，干燥，得到15.1克(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(4″-甲氧基-2″-硝基苯氧基)乙烷，其為黃色固體。
將(4′-甲氧基羰基甲基-2′-硝基苯氧基)-2-(4″-甲氧基-2″-硝基苯氧基)乙烷(15.0克、43.3毫摩爾)用溶于CH2Cl2(250毫升)的10％Pd/C(2.0克)在45psi下氫化16小時(shí)。將混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾。將濾液蒸發(fā)，殘留物用乙醚(200毫升)處理。過(guò)濾沉淀物，將其用乙醚(3×25毫升)洗滌，得到11.21克(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
將(2′-胺基-4′-甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷(8.65克、25毫摩爾)、甲醇(80毫升)、二氧雜環(huán)己烷(80毫升)及1M KOH(50毫升、50毫摩爾)的混合物在60℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫過(guò)夜。將混合物蒸發(fā)，殘留物懸浮于H2O(300毫升)中。加1M HCl水溶液到pH 4.0。過(guò)濾沉淀物，將其用H2O洗滌，干燥，得到6.84克(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其為米色固體。
通過(guò)劇烈攪拌己烷(150毫升)中的二苯甲酮腙(5.88克、30毫摩爾)及黃色HgO(17.60克、80毫摩爾)6小時(shí)，制備二苯基重氮甲烷。將混合物過(guò)濾與無(wú)機(jī)物分開(kāi)，將濾液蒸發(fā)濃縮，殘留物重溶于丙酮(40毫升)中。將該溶液加入到溶于丙酮(200毫升)的(2′-胺基-4′-羧甲基-1′-苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷酸(6.64克、20毫摩爾)的溶液中。將得到的混合物在35℃攪拌48小時(shí)，蒸發(fā)，將殘留物懸浮于CHCl3中。向懸浮液中加入AcOH(4毫升)以分解過(guò)量的試劑，將該混合物攪拌2小時(shí)，然后蒸發(fā)，粗產(chǎn)物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于CHCl3中的0.5％MeOH作為洗脫液純化，得到7.81克(78％)(2′-胺基-4′-二苯甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷，其為米色固體。將溶于MeCN(150毫升)的二胺(2′-胺基-4′-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基苯氧基)-2-(2″-胺基-4″-甲氧基苯氧基)乙烷(4.62克、9.3毫摩爾)、DIEA(52毫升、300毫摩爾)、溴乙酸甲酯(19毫升、200毫摩爾)及NaI(0.75克、5毫摩爾)的混合物在攪拌條件下回流70小時(shí)，冷卻到室溫，蒸發(fā)。將殘留物溶于CHCl3(400毫升)，用1％AcOH(3×200毫升)、H2O(200毫升)、飽和NaCl(2×200毫升)洗滌，過(guò)濾，蒸發(fā)。將殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于己烷的25到40％EtOAc梯度液作為洗脫液純化，得到3.01克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯，其為無(wú)色固體。
將溶于DMF(2毫升)的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯(762毫克、1毫摩爾)的溶液加入到溶于DMF(2毫升)的由POCl3(0.28毫升、3毫摩爾)制成的Vilsmeier試劑溶液中。將混合物攪拌2小時(shí)，然后快速倒入到冰-飽和K2CO3混合液(50毫升)中。將該混合物用CHCl3(7×20毫升)提取，用MgSO4干燥，蒸發(fā)。產(chǎn)物混合物通過(guò)柱色譜在SiO2(4×35厘米床體)上用溶于己烷的30到45％EtOAo梯度液分離，得到760毫克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-5’-甲?；?4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯，其為無(wú)色固體。
將溶于丙酸(20毫升)的4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-5’-甲酰基-4′-甲氧基-BAPTA四甲基酯(1.58克、2.0毫摩爾)、m-二甲胺基酚(602毫克、4.4毫摩爾)及TsOH(50毫克，催化劑)的混合物在65℃攪拌20小時(shí)，然后冷卻到室溫，倒入到3M NaOAc(300毫升)中。1小時(shí)后，過(guò)濾沉淀產(chǎn)物，用水洗滌，干燥，得到2.00克4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-5’二氫羅丹四甲基酯，其為紫紅色固體。
將在CHCl3及MeOH(各50毫升)中的化合物4-聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基-4′-甲氧基-5’-二氫羅丹四甲基酯(2.00克、1.9毫摩爾)及粉狀四氯苯醌(0.50克、2毫摩爾)混合物攪拌4小時(shí)，過(guò)濾，蒸發(fā)。殘留物通過(guò)快速色譜在SiO2上用溶于CHCl3的5到7％MeOH/0.5％AcOH梯度液純化，得到粗產(chǎn)物，將其重溶于CHCl3，過(guò)濾與SiO2分開(kāi)，蒸發(fā)，得到480毫克4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-4′-甲氧基-羅丹四甲基酯，其為深紫色固體。
向溶于二氧雜環(huán)己烷(1毫升)、MeOH(2毫升)及H2O(2毫升)的4-(聯(lián)苯基甲氧基羰基甲基)-4′-甲氧基-羅丹四甲基酯(45毫克、0.04毫摩爾)的溶液中加入1M KOH到pH 12.0。將混合物攪拌50小時(shí)，然后用0.1M HCl調(diào)pH到9.0。將混合物蒸發(fā)，殘留物在Sephadex LH-20管柱上(2.6×90厘米床體)用H2O作為洗脫液純化，凍干，得到12毫克化合物19，其為紅色固體(R＝CH2CO2K)。
化合物19 實(shí)例42含有DTPA金屬螯合部分的化合物20的合成將BODIPYTR尸胺分子探針D-6251(10毫克、0.019毫摩爾)溶解到在2毫升水中的(S)-1-p-異硫氰酰苯甲基二亞乙基三胺五乙酸(DTPA異硫氰酸酯，分子探針，1-24221，10毫克，0.019毫摩爾)混合物中。用碳酸鈉水溶液將pH提高到10。將得到的藍(lán)色溶液在室溫?cái)嚢鑳商欤缓笳婵諠饪s。殘留物通過(guò)柱色譜在SephadexLH-20上用純水作為洗脫液純化，得到2毫克化合物20，其為紫色粉末。
實(shí)例43含有DTPA金屬螯合部分的化合物21的合成為合成胺基甲酸鹽21a，向溶于20毫升二氯甲烷的1-(S)-(p-胺基苯基)-二亞乙基三胺五乙酸五-t-丁基酯(按照Donald T.Corson & Claude F.Meares.Bloconjugate Chen，11(2)292-299(2000)出版的程序制備，0.800克、1.03毫摩爾)溶液中加入1毫升吡啶，接著加入溶于5毫升二氯甲烷的N-CBZ-6-胺基己酸酸性氯化物(0.290克、1.02毫摩爾)溶液。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，真空濃縮。殘留物溶于100毫升乙酸乙酯，得到的溶液用10％HCl(2×30毫升)、水(30毫升)、鹽水(30毫升)洗滌，用硫酸鈉干燥。濃縮溶液，放在硅膠管柱上(用乙酸乙酯充填)。用乙酸乙酯洗脫管柱，去掉雜質(zhì)，然后用10∶1氯仿-甲醇洗脫預(yù)期產(chǎn)物。合并純化的溶出份，蒸發(fā)掉溶劑，得到酰胺21a(0.54克、54％)，其為粘性油。
為合成氨基酸21b，將胺基甲酸鹽21a(0.700克、0.683毫摩爾)溶解于10毫升TFA中。將反應(yīng)混合物在室溫下保持3天。將揮發(fā)物蒸發(fā)，殘留物用甲苯重蒸發(fā)濃縮兩次，剩下粘性油。將該油用乙酸乙酯攪拌直到其固體化。將得到的固體過(guò)濾，干燥，得到氨基酸21b(0.400克、96％)。
為合成化合物21，將氨基酸21b(0.090克、0.147毫摩爾)懸浮于10毫升水中。用1M KOH調(diào)pH到～8。將得到的溶液加入到溶于5毫升DMF的BODIPYTMR-X，SE，分子探針D-6117(0.03克、0.049毫摩爾)的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。監(jiān)測(cè)pH，并在開(kāi)始2小時(shí)期間調(diào)到～8。將溶液蒸發(fā)，殘留物重溶于水，在Sephadex LH-20上用水洗脫純化。
合并產(chǎn)物溶出份，濃縮到～3毫升，然后凍干，得到0.061克化合物21，其為紅色粉末。
化合物21實(shí)例44含有DTPA金屬螯合部分的化合物22的合成7毫克0.019毫摩爾的BODIPYFL EDA分子探針D-2390溶解于10毫克0.019毫摩爾DTPA異硫氰酸酯分子探針I(yè)-24221在2毫升水中的混合物中。加碳酸鈉水溶液調(diào)pH至10。將得到的橙黃色的溶液在室溫下攪拌3.5小時(shí)，然后蒸發(fā)。殘留物在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到29毫克化合物22，其為橙黃色粉末。
實(shí)例45化合物25-一BAPTA-生物素的合成將2滴飽和碳酸鈉溶液加入到溶于2毫升水的生物素-尸胺(21毫克、0.047毫摩爾，分子探針)溶液中。再加入溶于3毫升二氧雜環(huán)己烷的5-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸(25毫克、0.047毫摩爾)的溶液。反應(yīng)物用更多的碳酸鈉溶液將pH提高到9.5，將溶液在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜。揮發(fā)物真空除去，殘留物通過(guò)色譜在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到化合物25，其為40毫克淡棕色粉末(R＝CH2CO2Na)。
化合物25實(shí)例46化合物26-一羅丹-BAPTA-BAPTA的合成將溶于1∶1水∶二氧雜環(huán)己烷(8毫升)的5-異硫氰酸根基-BAPTA游離酸(24毫克、0.044毫摩爾)的溶液加入到溶于1∶1水∶二氧雜環(huán)己烷(5毫升)的4-羧基-羅丹明四甲基酯的乙二胺甲酰胺(如實(shí)例34，0.04毫摩爾)的溶液中。通過(guò)加入碳酸氫鈉水溶液將pH提高到8.5。將得到的紅色溶液在環(huán)境溫度下攪拌過(guò)夜，然后真空濃縮，通過(guò)柱色譜在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到中間體四羧酸四甲基酯，其為11毫克紅色粉末。將1M KOH(0.07毫摩爾)加入到溶于1.4毫升水中的該中間體的溶液中。3小時(shí)后，用乙酸將pH(13)降低到9，接著真空濃縮。將得到的殘留物通過(guò)柱色譜在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到化合物26，其為紅色粉末(R＝CH2CO2K)。
化合物26實(shí)例47化合物27a-i的合成化合物27a的合成用于舉例說(shuō)明制造化合物27a-27f所用的合成方法。將草酰氯(18微升、0.20毫摩爾)加入到溶于5毫升無(wú)水THF的4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-吖-s-吲得辛-3-丙酸(分子探針B-2183，50毫克、0.17毫摩爾)的溶液中，接著加入二異丙基乙胺(DIEA，35微升、0.20毫摩爾)。將得到的溶液在室溫下攪拌15分鐘，接著真空濃縮。將得到的酸性氯化物溶解于3毫升干燥的二氧雜環(huán)己烷中。將該溶液逐滴加入5毫升27′(83毫克、0.17毫摩爾，X＝H)溶液中同時(shí)進(jìn)行攪拌；用碳酸鈉將pH保持在9。將得到的混濁橙黃色混合物攪拌1小時(shí)，在硅膠上進(jìn)行TLC分析顯示形成了27a(Rf0.40，二氧雜環(huán)己烷-丙醇-水-氫氧化銨15∶58∶13∶14)。揮發(fā)物真空除去，殘留物通過(guò)柱色譜在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化。收集純產(chǎn)物溶出份，凍干，得到27a，其為99毫克蓬松的橙黃色粉末(68％產(chǎn)率)1H NMR(D2O)δ7.34(s，1H)，6.98-6.68(m，8H)，6.33(d，J＝4.0Hz，1H)，6.19(s，1H)，4.18(m，4H)，3.66(s，8H)，3.18(t，7.6Hz，2H)，2.72(t，7.6Hz，2H)，2.41(s，3H)，2.13(s，3H)；LCMS(m/z)765(按分子式C36H38N5O11BF2計(jì)算為765)。
R20R21X28a CH3CH3H27b Ph PhH27c H -CH＝CH-PhH27d H -(CH＝CH)2-PhH27e H 2-pyrrolylH27f H -CH2CH2CO2Na H8 CH3CH3F實(shí)例48化合物28(丹?；鵅APTA)的合成溶于3毫升二氧雜環(huán)己烷中的丹酰氯(22毫克、0.081毫摩爾)的溶液加入到溶于1∶1二氧雜環(huán)己烷/水(10毫升)的5-胺基-BAPTA(40毫克、0.081毫摩爾)溶液中，保持pH 9(用碳酸鈉維持)。將得到的溶液在室溫下攪拌1小時(shí)，然后真空濃縮。殘留物通過(guò)柱層析在Sephadex LH-20上用水作為洗脫液純化，得到化合物28，其為40毫克淺黃色粉末。
R＝CH2CO2Na化合物28實(shí)例49以質(zhì)譜分析為基礎(chǔ)由2-D凝膠鑒別磷蛋白按標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行2-D凝膠電泳。所有步驟均在50rpm旋轉(zhuǎn)振搖器上用500毫升/凝膠的量來(lái)進(jìn)行。為除去SDS，用50％MeOH、7％HAc過(guò)夜固定2-D凝膠，1小時(shí)后更換一次。第二天，用dH2O洗滌凝膠4×15分鐘，然后用本發(fā)明的結(jié)合液染色2.5到3小時(shí)。為除去非特異性染色及降低本底，用50mM乙酸鈉(pH 4.0)、4％乙腈溶液洗滌3次，每次1小時(shí)。接著用50mM NaAc、15+％1，2-丙二醇(pH 4.0)再洗滌1小時(shí)，然后用532納米激光激發(fā)和580納米發(fā)射濾波器成像。洗滌繼續(xù)過(guò)夜，于第二天重復(fù)成像。
進(jìn)行磷蛋白染色，接著用SYPRORuby進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠過(guò)夜染色，在再次成像前用10％MeOH、7％HAc脫色2到3小時(shí)。將凝膠用473納米激光激發(fā)和580納米發(fā)射濾波器掃描，切下斑點(diǎn)。為了脫色，將斑點(diǎn)置于1.5毫升離心管中用100微升50％MeOH、5％HAc脫色30分鐘，用100微升0.1％TFA脫色30分鐘，用100微升50％MeOH/5％HOAc脫色30分鐘，最后用100微升100％乙腈(ACN)脫水10分鐘。在還原和烷基化之前，將斑塊完全晾干。如果蛋白質(zhì)在2-D凝膠電泳前已還原并烷基化，則下一步驟可省略。
為了烷基化和還原半胱氨酸，加足夠量的溶于0.1M NH4HCO3的20mM二硫蘇糖醇(DTT)以便完全蓋住干凝膠塊(～50ul)?？赡苄枰痈郉TT，因?yàn)槟z可重新膨脹。在56℃培育1小時(shí)。除去DTT溶液，加等體積(50微升)的溶于50mM NH4HCO3的100mM碘乙酰胺(IAAm)。在室溫下暗處培育30分鐘，棄掉上清液，用100微升0.1M NH4HCO3將凝膠塊洗滌2次，15分鐘，不時(shí)進(jìn)行振搖以除去過(guò)量的反應(yīng)物。為從凝膠塊提取任何過(guò)量的反應(yīng)物，用100微升0.1M NH4HCO3/50％ACN洗滌15分鐘，并不時(shí)振蕩。棄掉上清液，完全干燥凝膠塊(晾干)。
為用胰蛋白酶進(jìn)行凝膠內(nèi)消化，配制溶于50mM NH4HCO3/10％ACN中的0.05毫克/毫升經(jīng)修飾胰蛋白酶(Promega)的新鮮溶液。如果不立即使用，則放在冰上保存。在進(jìn)行下一步驟前，加10微升新鮮胰蛋白酶溶液以讓凝膠塊在胰蛋白酶溶液中浸泡，即10分鐘。通過(guò)加入20微升50mM NH4HCO3/10％ACN(VTOT＝30微升)并在37℃過(guò)夜培育讓凝膠塊完全膨脹。
為提取肽，通過(guò)加入1微升10％TFA來(lái)終止消化；10分鐘/RT。旋渦振蕩、旋轉(zhuǎn)，取出上清液并置于0.5毫升eppendorf管中。加50微升0.1％TFA到小塊中培育30分鐘。振蕩、旋轉(zhuǎn)，將這次的上清液和第一次的合并。加50微升60％ACN/0.1％TFA作用30分鐘，振蕩、旋轉(zhuǎn)，和管中的第一次的上清液合并。用Speed-Vac干燥肽，將其再次溶解于10微升10％ACN/0.1％TFA中。
將肽混合物脫鹽，用Millipore的C18 ZipTip管柱濃縮，或按樣品濃度直接點(diǎn)樣。將0.5微升基質(zhì)(溶于50％乙腈、0.1％TFA的5毫克/毫升α-氰基4-羥基肉桂酸)及0.5微升樣品在靶上混合。干燥斑點(diǎn)，用質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
上述實(shí)例中用到的試劑均能購(gòu)得或可利用市售儀器和方法來(lái)配制，或是在本項(xiàng)技術(shù)中已為人所知的試劑，或其制備方法在這些實(shí)例中已有描述。從上文的描述及結(jié)果中顯然可知，對(duì)于在生物樣品上標(biāo)記磷酸化靶分子，本發(fā)明極大地優(yōu)于目前能得到的方法，因?yàn)槠淠軝z測(cè)出500到1000倍濃度范圍的磷酸化靶分子，這沒(méi)有前例。本發(fā)明克服了當(dāng)前所用方法的缺點(diǎn)，使得可以用簡(jiǎn)單程序標(biāo)記和分離磷酸化靶分子，而且提高了敏感度。應(yīng)了解，本發(fā)明的方法可對(duì)溶液中或固定的磷酸化靶分子進(jìn)行標(biāo)記，磷酸根結(jié)合化合物可以是固定的或者是在溶液中，由此可以鑒別將這些靶分子磷酸化的酶。這些實(shí)例并非意欲詳盡說(shuō)明本發(fā)明的多種不同實(shí)施例。因此，盡管為了清晰理解的目的，用圖示及實(shí)例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易認(rèn)識(shí)到，在不背離隨附權(quán)利要求書(shū)的精神或范圍的情況下可以對(duì)其進(jìn)行很多改變及修改。
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物及專(zhuān)利申請(qǐng)案均以引用的方式并入本文中，其并入程度如同明確地及單獨(dú)地指出將每一個(gè)別出版物或?qū)＠暾?qǐng)案以引文方式并入。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合液，其包括a)一BAPTA金屬螯合部分；b)一包括三價(jià)金屬離子的鹽；及，c)一酸。
2.一種結(jié)合液，其包括a)一化學(xué)式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；b)一包括三價(jià)金屬離子的鹽；及，c)一酸。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合液，其中所述結(jié)合液具有一約3到約pH6的pH。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合液，其中所述金屬離子選自由Ga3+、Fe3+和Al3+組成的組群。
5.如權(quán)利要求4所述的結(jié)合液，其中所述鹽為氯化鎵。
6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)合液，其中所述化學(xué)部分為一標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為一染料、一酶或一半抗原，但須所述染料未經(jīng)磺化，或所述化學(xué)部分為一反應(yīng)基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合液，其中所述半抗原為生物素。
8.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合液，其中所述染料選自由苯并呋喃、喹唑啉酮、呫噸、吲哚、苯并吡咯和硼聚吖吲得辛組成的組群。
9.如權(quán)利要求6所述的結(jié)合液，其中所述金屬螯合部分是BAPTA。
10.如權(quán)利要求所述9的結(jié)合液，其中所述化合物的化學(xué)式為(A)m(L)n(B)，其中A是一化學(xué)部分，其為一染料或一反應(yīng)基團(tuán)，L為一連接體，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)，B為一種具有所述化學(xué)式IV的金屬螯合部分； 化學(xué)式IV其中所述染料或反應(yīng)基團(tuán)通過(guò)一連接體連接到R1到R12中的至少一個(gè)上，或R1到R8中的至少一個(gè)與A環(huán)或B環(huán)聯(lián)合形成一染料；R1到R8不是一染料或反應(yīng)基團(tuán)，其各獨(dú)立選自由氫、鹵素、烷氧基、烷基、芳基、胺基、羧基、硝基、氰基、硫醚、羥基、亞磺?；瓦B接體組成的組群；R9、R10、R11和R12各獨(dú)立選自由氫、連接體和低烷基組成的組群，或相鄰取代基R9和R10聯(lián)合組成一五元或六元的脂環(huán)或雜環(huán)；R15、R16、R17和R18各獨(dú)立為氫、低烷基或烷基，其中烷基或低烷基視需要可被羧基或烷氧基取代；p為1或2；及，R13和R14各自獨(dú)立為氫或一鹽。
11.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合液，其中所述R1到R4中的至少一個(gè)獨(dú)立為染料或反應(yīng)基基，R5到R8各獨(dú)立選自由H、NO2、F、CF3、低烷基和連接體組成的組群，其中所述連接體視需要可以連接到一生物素、一反應(yīng)基團(tuán)或一染料上。
12.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合液，其中所述染料各獨(dú)立為R3、R2或R3、R2的聯(lián)合。
13.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合液，其中所述R6或R7為一連接體且所述連接體視需要可以連接到一生物素、一反應(yīng)基團(tuán)或一染料上。
14.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合液，其中所述R6和R5獨(dú)立為氟。
15.如權(quán)利要求11所述的結(jié)合液，其中所述R6為NO2。
16.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合液，其中具所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)的所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12組成的組群。
17.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合液，其中所述結(jié)合液進(jìn)一步包括一有機(jī)溶劑和一緩沖劑。
18.如權(quán)利要求17所述的結(jié)合液，其中所述有機(jī)溶劑為乙腈。
19.如權(quán)利要求9或10所述的結(jié)合液，其中所述磷酸根結(jié)合化合物溶于溶液中或固定在一固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上。
20.一種結(jié)合一樣品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)用如權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液接觸所述樣品；及，ii)將所述樣品和所述結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述磷酸根結(jié)合化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合，由此結(jié)合所述磷酸化靶分子。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包含用一合適光源照射所述磷酸根結(jié)合化合物，由此檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記磷酸化靶分子。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述磷酸化靶分子選自由蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、糖類(lèi)、磷酸酶底物、激酶底物、脂類(lèi)以及無(wú)機(jī)磷酸鹽組成的組群。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述磷酸化靶分子固定于一固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)上或溶解于溶液中。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述固態(tài)或半固態(tài)基質(zhì)為一凝膠、一膜、一聚合物粒子或一陣列。
25.一種檢測(cè)一固定在膜上的樣品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)視需要將所述樣品在凝膠上進(jìn)行電泳分離；ii)將所述樣品固定于一膜上；iii)視需要用一固定液接觸步驟ii)中的所述膜；iv)用如權(quán)利要求2到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液接觸步驟iii)中的所述膜，其中所述結(jié)合液包括a)一化學(xué)式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；b)一包括金屬離子的鹽；及，c)一酸；v)將步驟IV)的所述膜和所述結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述磷酸根結(jié)合化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合；及，vi)觀察所述化合物，由此檢測(cè)所述磷酸化靶分子。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中步驟iii)進(jìn)一步包括用所述固定液接觸所述膜之后接著用一洗液接觸所述膜。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述磷酸化靶分子選自由蛋白質(zhì)、肽及核苷酸組成組群。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述磷酸根結(jié)合化合物具有所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)，其中B包括化學(xué)式IV，所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12組成的組群。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述步驟v)進(jìn)一步包括用所述結(jié)合液接觸所述膜之后接著用一洗液接觸所述膜。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其進(jìn)一步包括將一附加檢測(cè)試劑加到所述膜上。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述附加檢測(cè)試劑為一針對(duì)總蛋白的染色液、一針對(duì)糖蛋白的染色液或一抗體。
32.一種檢測(cè)一固定在凝膠上的樣品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)將所述樣品固定于凝膠上；ii)視需要用一固定液接觸步驟i)的所述凝膠；iii)用如權(quán)利要求2到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液接觸步驟iii)中的所述凝膠，其中所述結(jié)合液包含a)一化學(xué)式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；b)一包括金屬離子的鹽；及，c)一酸；iv)將步驟iii)中的所述凝膠和所述結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述磷酸根結(jié)合化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合；及，vi)觀察所述化合物，由此檢測(cè)所述磷酸化靶分子。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述磷酸化靶分子選自由蛋白質(zhì)、肽及核苷酸組成的組群。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述磷酸根結(jié)合化合物具有所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)，其中B包括化學(xué)式IV，所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12組成的組群。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其進(jìn)一步包含將一附加檢測(cè)試劑加到所述凝膠上。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述附加檢測(cè)試劑為一針對(duì)總蛋白的染色液或一針對(duì)糖蛋白的染色液。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中步驟ii)進(jìn)一步包括用所述固定液接觸所述膜之后接著用一洗液接觸所述膜。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在步驟i)之前首先對(duì)所述樣品進(jìn)行電聚焦。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述方法中的所述步驟i)進(jìn)一步包括電泳分離所述樣品。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述步驟v)進(jìn)一步包括用所述結(jié)合液接觸所述凝膠之后接著用一洗液接觸所述凝膠。
41.一種檢測(cè)一固定在一基質(zhì)上的樣品中的磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)將所述樣品固定于一基質(zhì)上；ii)用如權(quán)利要求2到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液接觸步驟i)中的所述基質(zhì)接觸，其中所述結(jié)合液包括a)一化學(xué)式為(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)；b)一包括金屬離子的鹽；及，c)一酸；iii)將步驟ii)中的所述基質(zhì)與所述結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合；及，iv)觀察所述化合物，由此檢測(cè)所述磷酸化靶分子。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述樣品選自由蛋白質(zhì)、肽、核苷酸、脂類(lèi)、激酶底物、磷酸酶底物、磷酸根結(jié)合蛋白質(zhì)及糖類(lèi)組成的組群。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述基質(zhì)為一聚合物凝膠、玻璃、聚合物膜、塑料、聚合物微粒。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述磷酸根結(jié)合化合物具有所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)，其中B包括化學(xué)式IV，所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12組成的組群。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述步驟v)進(jìn)一步包括用所述結(jié)合液接觸所述基質(zhì)之后接著用一洗液接觸所述基質(zhì)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其進(jìn)一步包括將一附加檢測(cè)試劑加到所述基質(zhì)上。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述附加檢測(cè)試劑為一針對(duì)總蛋白的染色液、一針對(duì)糖蛋白的染色液或一抗體。
48.一種從一樣品中分離磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)用一如權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液接觸所述樣品；及，ii)將步驟i)中的所述樣品和所述結(jié)合液培育足夠時(shí)間，以使所述化合物與所述磷酸化靶分子結(jié)合，形成一三元絡(luò)合物；及，iii)從所述樣品中分離所述絡(luò)合物，由此分離所述磷酸化靶分子。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述結(jié)合液進(jìn)一步包括乙腈。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述分離進(jìn)一步包括沉淀所述絡(luò)合物。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述分離進(jìn)一步包括將一堿液加入到所述沉淀絡(luò)合物中，其中所述絡(luò)合物被離解，由此通過(guò)親和層析分離所述靶分子。
52.如權(quán)利要求50或51所述的方法，其中所述分離視需要進(jìn)一步包括向如權(quán)利要求50或51所述的絡(luò)合物中加入一有機(jī)提取液，由此將所述磷酸化靶分子從所述磷酸根結(jié)合化合物中分離。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述磷酸化靶分子選自由蛋白質(zhì)、肽及核苷酸組成的組群。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述磷酸根結(jié)合化合物具有所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)，其中B包括化學(xué)式IV，所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物9、化合物10、化合物11和化合物12組成的組群。
55.一種從一樣品中分離磷酸化靶分子的方法，所述方法包括以下步驟i)用一包括三價(jià)金屬離子的鹽裝填一基質(zhì)，所述基質(zhì)包括一選自由化學(xué)式IV組成的組群的金屬螯合部分；ii)用一酸性結(jié)合緩沖液平衡所述基質(zhì)；iii)將所述樣品加入所述基質(zhì)中，其中所述磷酸化靶分子結(jié)合到步驟ii)的所述基質(zhì)上；iv)用一堿液從所述基質(zhì)中洗脫所述磷酸化靶分子，由此所述磷酸化靶分子得到分離。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述基質(zhì)選自由聚合物粒子、聚合物膜、玻璃及塑料組成的組群。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述磷酸化靶分子為蛋白質(zhì)、肽或核苷酸。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述酸性結(jié)合緩沖液具有一約3到約6的pH。
59.如權(quán)利要求58所述的結(jié)合液，其中所述三價(jià)金屬離子選自由Ga3+、Fe3+和Al3+組成的組群。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述鹽為氯化鎵。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述基質(zhì)包括化合物2、化合物5、化合物13、化合物14、化合物15以及化合物16。
62.一種用于結(jié)合一樣品中的磷酸化靶分子的試劑盒，所述試劑盒包括i)如權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液；及，ii)其中所述試劑盒視需要包含分子量標(biāo)準(zhǔn)品，所述分子量標(biāo)準(zhǔn)品包含磷酸化和非磷酸化的多肽。
63.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，其中所述試劑盒可獨(dú)立地進(jìn)一步包括一固定液、附加檢測(cè)試劑、標(biāo)準(zhǔn)樣品或一洗液。
64.如權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述試劑盒進(jìn)一步包括一基質(zhì)。
65.如權(quán)利要求64所述的試劑盒，其中所述基質(zhì)進(jìn)一步包括一磷酸酶或激酶底物。
66.如權(quán)利要求63所述的試劑盒，其中所述附加檢測(cè)試劑為一針對(duì)總蛋白的染色液、一針對(duì)糖蛋白的染色液或抗體。
67.如權(quán)利要求62所述的試劑盒，其中具有所述化學(xué)式(A)m(L)n(B)的所述磷酸根結(jié)合化合物選自由化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物15和化合物16組成的組群。
68.一種包括一固定的化學(xué)式(A)m(L)n(B)磷酸根結(jié)合化合物的基質(zhì)，其中A為一化學(xué)部分，L為一連接體，B為一化學(xué)式IV的金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)。
69.一種化學(xué)式為(A)m(L)n(B)的化合物，其中A為一標(biāo)記物，L為一連接體，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)，B為一由化學(xué)式IV構(gòu)成的金屬螯合部分，其中所述化合物選自由下列化合物組成的組群， 化合物6 化合物7 化合物9 化合物10 化合物11 化合物12 化合物15 化合物17 化合物18 化合物19 化合物23 化合物24 化合物25 化合物26及 化合物29其中R19為-(CH2CO2R13)2，R13獨(dú)立為氫或一鹽。
70.一種包括一化學(xué)式IV的金屬螯合部分的化合物，即 化合物14或 化合物13其中R19為-(CH2CO2R13)2，R13獨(dú)立為氫或一鹽。
71.一種包括化學(xué)式IV的金屬螯合部分的化合物 其中X為H或F；R20為H、甲基或苯基；R21為CH3、Ph、-CH＝CH-Ph、-(CH＝CH)2-Ph、2-吡咯基或-CH2CH2CO2Na；R19為-(CH2CO2R13)2，R13獨(dú)立為氫或一鹽。
72.一種包括一三價(jià)鎵離子、一磷酸化靶分子和化學(xué)式(A)m(L)n(B)的磷酸根結(jié)合化合物的三元絡(luò)合物，其中A為一化學(xué)組份，L為一連接體，B為一金屬螯合部分，m為一從1到4的整數(shù)，n為一從0到4的整數(shù)。
73.一種包括一BAPTA螯合部分、一三價(jià)鎵離子及一磷酸化靶分子的三元絡(luò)合物。
74.一種通過(guò)將一包括磷酸化靶分子的樣品與如權(quán)利要求1到19任一項(xiàng)所述的結(jié)合液結(jié)合來(lái)測(cè)定的磷酸化靶分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸根結(jié)合化合物，其可用于結(jié)合、檢測(cè)和分離磷酸化靶分子，包括隨后鑒別與磷酸化靶分子相互作用的靶分子或能夠被磷酸化的分子。本發(fā)明提供一種結(jié)合液，其包含一種磷酸根結(jié)合化合物、一種酸和一種金屬離子，其中該金屬離子同時(shí)與靶分子上暴露的磷酸根基團(tuán)和磷酸根結(jié)合化合物的金屬螯合部分相互作用，在該磷酸根結(jié)合化合物與一磷酸化靶分子之間形成一橋鍵，由此形成一三元絡(luò)合物。本發(fā)明的結(jié)合液可用于結(jié)合及檢測(cè)固定的與溶解的磷酸化靶分子，以及用于從復(fù)雜混合物中分離磷酸化靶分子，并有助于進(jìn)行其中可鑒別激酶、磷酸酶底物及酶的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1665790SQ03815684
公開(kāi)日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月3日
發(fā)明者布萊恩·阿格紐, 約瑟夫·比徹, 凱爾·吉, 理查德·豪格蘭, 劉紀(jì)祥, 弗拉迪米爾·馬丁, 韋恩·巴頓, 托馬斯·斯坦伯格 申請(qǐng)人:莫萊丘萊爾探針公司