專利名稱：：作為腫瘤診斷和治療的靶的叢蛋白d1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的可靶向蛋白的鑒定，該蛋白可用于腫瘤，尤其是實(shí)體瘤，和病癥包括炎癥，尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈粥樣硬化和多發(fā)性硬化的治療和診斷。
背景技術(shù)：
：為了生長超過2-3mn^的大小，胂瘤必須通過血管發(fā)生來補(bǔ)充新生血管。腫瘤通過血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)的表達(dá)，通過腫瘤中心的低氧誘導(dǎo)或者由于使腫瘤抑制基因產(chǎn)物或活化原癌基因功能失常的結(jié)果來完成這個(gè)過程。已經(jīng)開發(fā)了許多靶向VEGF-A信號(hào)傳導(dǎo)途徑的化合物，其旨在抑制血管發(fā)生并，因此，抑制腫瘤生長。盡管這種抗血管生成療法在動(dòng)物肺瘤模型中是有效的，但是轉(zhuǎn)化到臨床水平迄今為止證明是不太成功的(Eichhorn，ME等人，DrugResistUpdate7:125—138(2004))。對(duì)此，存在許多可能的解釋。臨床上相關(guān)的狀況中，在診斷的時(shí)候，肺瘤已經(jīng)生長幾個(gè)月或甚至幾年，而且顯著比例的脈管系統(tǒng)可能或多或少成熟，從而對(duì)血管發(fā)生抑制不敏感。這種狀況與大多數(shù)動(dòng)物模型成為鮮明的對(duì)照，這些動(dòng)物模型中，通常，對(duì)攻擊性的，生長迅速的腫瘤進(jìn)行研究。而且，候選用于抗血管生成療法的患者一般是患有散布，無法控制的癌癥的患者，而且轉(zhuǎn)移性病灶的生長通常可能不嚴(yán)格地依賴于血管發(fā)生。因?yàn)榇蠖鄶?shù)轉(zhuǎn)移性病灶是血液傳播的，它們在器官中向外生長，這些器官本質(zhì)上具有較高的脈管密度如肝臟，肺和大腦，轉(zhuǎn)移性病灶在這些器官中可以通過之前原有的脈管的共選擇以血管發(fā)生獨(dú)立的方式生長。實(shí)際上，在許多皮下的腫瘤模型(Wedge，SR等人，CancerRes62:4645-4655(2002))中十分有效地抑制腫瘤生長的血管發(fā)生抑制劑，不能抑制小鼠大腦中滲透性腫瘤的生長。而且，當(dāng)對(duì)攜帶高度血管生成腦腫瘤的小鼠進(jìn)行治療時(shí)，血管發(fā)生抑制沒有導(dǎo)致更進(jìn)一步的腫瘤進(jìn)展的停止，而是導(dǎo)致了表型轉(zhuǎn)變到共選擇和浸潤以后的進(jìn)展(Leenders，WP等人，ClinCancerRes10:6222-6230(2004))。這些結(jié)果意味著，抗血管生成療法將通過血管的靶向療法進(jìn)行補(bǔ)充，其中存在的腫瘤血管床被攻擊，由于胂瘤的血液供給破壞，導(dǎo)致繼發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡。為了實(shí)現(xiàn)有效的血管靶向療法，必須鑒定腫瘤脈管系統(tǒng)特異性的標(biāo)記。已經(jīng)對(duì)此進(jìn)行了許多努力，但是取得了不同的成功。使用針對(duì)纖粘連蛋白的ED-B功能域的單鏈抗體，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了有效的血管瘤靶向，其選擇性表達(dá)并存在于血管生成腫瘤的新形成脈管的胞外基質(zhì)中(Santimaria,M等人，ClinCancerRes9:571-579(2003))。使用RGD肽或Vitaxin，ouP「整聯(lián)蛋白(其表達(dá)只限于未成熟的脈管)，產(chǎn)生了令人失望的結(jié)果，然而內(nèi)皮糖蛋白表達(dá)不是腫瘤血管特異性的(Posey，JA等人，CancerBiotherRadiopharm16:125-132(2001);Balza，E等人，IntJCancer94:579-585(2001))。在炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或動(dòng)脈粥樣硬化中，血管發(fā)生和脈管系統(tǒng)的活化也常常是病理的一部分。脈管系統(tǒng)此時(shí)為炎性細(xì)胞溢出和發(fā)揮它們的破壞作用做好準(zhǔn)備。這些疾病從而也可以受益于靼向血管。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種新的可靶向蛋白，其可用于癌癥和炎癥性疾病或涉及炎癥的疾病的治療和診斷。在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，發(fā)現(xiàn)叢蛋白Dl表達(dá)于腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞的腔側(cè)，腫瘤細(xì)胞本身，以及肺瘤，炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的蝕斑中發(fā)現(xiàn)的活化巨噬細(xì)胞。本發(fā)明因此涉及用作涉及叢蛋白Dl的表達(dá)的病癥的治療或診斷中的可耙向蛋白的叢蛋白Dl。哺乳動(dòng)物中叢蛋白家族的受體包括4類(PLXNA-D)和9個(gè)成員。叢蛋白包括一個(gè)大的，單通膜的家族，其與分散因子受體同源，由MET基因家族編碼。叢蛋白家族的成員共有Sema功能域，Met-相關(guān)序列(MRS)，一個(gè)橫跨膜的區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)基序，其是Rac/Rho-GTP酶信號(hào)的預(yù)示(圖1)。因?yàn)橥ㄟ^GTP酶的發(fā)出信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞骨架重排，該事件決定性地涉及線狀偽足和片狀偽足以及細(xì)胞遷移的形成，所以叢蛋白被認(rèn)為是遷移的調(diào)節(jié)劑。叢蛋白是腦信號(hào)蛋白的受體，一個(gè)分泌的，GPI錨定的或橫跨膜的蛋白質(zhì)家族，其被再劃分為7個(gè)亞類。每個(gè)叢蛋白都具有它自身的(一套)腦信號(hào)蛋白結(jié)合伴侶，而且每個(gè)叢蛋白-腦信號(hào)蛋白結(jié)合都導(dǎo)致一個(gè)特異性的反應(yīng)。第3類腦信號(hào)蛋白是有效的軸突驅(qū)避劑，而且同樣涉及神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生(綜述，參加，(Pasterkamp，RJ等人，Curr0pinNeurobiol13:79-89(2003);Fujisawa，H，JNeurobiol59:24-33(2004))。為了通過腦信號(hào)蛋白活化叢蛋白，可能需要另外的叢蛋白結(jié)合伴侶。這些結(jié)合伴侶，神經(jīng)氈蛋白-l和-2(NP-I和NP-2)在細(xì)胞內(nèi)功能域中沒有信號(hào)基序，而且被認(rèn)為是被動(dòng)的共同受體，能使腦信號(hào)蛋白與叢蛋白之間相互作用。一些叢蛋白還形成大的膜復(fù)合物，并活化信號(hào)受體作為出軌(Otk)與分散因子受體Met與Ron。叢蛋白Al與血管生成血管內(nèi)皮生長因子-受體-2(VEGFR2)之間的直接相互作用也已經(jīng)證實(shí)了(Toyofuku，T等人，E-publicationinGenesDev18:435-447(2004))。因?yàn)镹P-I結(jié)合叢蛋白家族成員，而且也結(jié)合VEGFR2，可以想像多組分的膜蛋白復(fù)合物存在，包括VEGFR2，NP-I和叢蛋白，建立了叢蛋白與血管發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)(也參見Weinstein，BM，Cell,120:299-302(2005))。神經(jīng)氈蛋白也是有效的血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A165)的共同受體，并增強(qiáng)它對(duì)VEGFR2的親合力。有趣地，NP-1上的VEGF-A165結(jié)合位點(diǎn)與腦信號(hào)蛋白3A的相一致(Miao，HQ等人，JCellBiol146:233-242(1999))。已經(jīng)假設(shè)，VEGF-A結(jié)合NP-1通過竟?fàn)幗Y(jié)合第3類腦信號(hào)蛋白來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，其后面通常是F肌動(dòng)蛋白解聚和細(xì)胞延伸的排斥(Bachelder，RE，CancerRes63:5230-5233(2003))。VEGF-A與第3類腦信號(hào)蛋白的類似拮抗行為已經(jīng)描述于神經(jīng)元的祖細(xì)胞系中(Bagnard，D等人，JNeurosci21:3332-3341(2001))andtumorcells(Bachelder(2003)，上文)。因?yàn)樵谌狈EGF受體的胂瘤細(xì)胞中觀察到拮抗作用，可以想像根本的機(jī)制涉及叢蛋白家族的成員，建立了叢蛋白與VEGF-A信號(hào)之間更進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明人已經(jīng)預(yù)先發(fā)現(xiàn)，家庭成員叢蛋白Dl(plxnDl)不僅僅在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，而且在生長初期階段期間在脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(vanderZwaag，B等人，DevDyn225:336-343(2002))，anobservationthatwasconfirmedbytwoothergroups(Gitler,AD等人，DevCell7:107-116(2004);Torres-Vazquez,J等人，DevCell7:117-123(2004))。在成人脈管系統(tǒng)中，plxnDl是缺乏的。Plxndl敲除小鼠與攜帶plxndl基因突變的斑馬魚的特征為心血管系統(tǒng)發(fā)育不良(Gitler,AD等人(2004)，見上；Torres-Vazquez,J等人，(2004)，上文)。神經(jīng)氈蛋白-1(NP-1)與NP-l/神經(jīng)氈蛋白-2(NP-2)雙重敲除小鼠也遭受血管形成的致命缺陷，和胚胎發(fā)育期間主動(dòng)脈弓畸形(Kawasaki，T等人，Development126:4895-4902(1999);Takashima，S等人，ProcNatlAcadSci美國99:3657—3662(2002);Gu，C等人，DevCell5:45-57(2003))。而且，斑馬魚中嗎啉代介導(dǎo)的NP-1敲除導(dǎo)致節(jié)間脈管的發(fā)育不良，而且在該模型系統(tǒng)中建立了NP-1與VEGF-A165之間的清楚關(guān)聯(lián)(Lee，P等人，ProcNatlAcadSciUSA99:10470—10475(2002))。plxnDl,神經(jīng)氈蛋白-1與腦信號(hào)蛋白3C敲除小鼠的表型相似性(Feiner，L等人，Development128:3061-3070(2001)),與叢蛋白Dl是腦信號(hào)蛋白3C的神經(jīng)氈蛋白-1依賴性受體的發(fā)現(xiàn)一致(Gitler,AD等人(2004)，上文)。但是，PlxnDl也是腦信號(hào)蛋白3E的受體，而且這種相互作用不需要神經(jīng)氈蛋白用于腦信號(hào)蛋白3E介導(dǎo)的信號(hào)(Gu，C等人，Science307:265-268(2005))。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)叢蛋白Dl也涉及肺瘤生長期間的血管發(fā)生，并表達(dá)于腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞的腔側(cè)。此外叢蛋白Dl被認(rèn)為是由活化巨噬細(xì)胞表達(dá)。叢蛋白Dl也被認(rèn)為在各式各樣的腫瘤類型中在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)。本本發(fā)明因此涉及用作涉及叢蛋白Dl的表達(dá)的病癥的治療或診斷中的可耙向蛋白的叢蛋白Dl。診斷通過檢測體內(nèi)或身體組織或液體中叢蛋白Dl或叢蛋白Dl編碼核酸的存在而實(shí)現(xiàn)。通過干擾叢蛋白Dl與它的配體之間的相互作用，通過干擾叢蛋白Dl基因的表達(dá)或通過捕獲叢蛋白Dl配體以抑制與叢蛋白Dl的相互作用，治療通過靶向叢蛋白Dl用于傳遞治療劑到需要治療的叢蛋白位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明因此更進(jìn)一步涉及結(jié)合叢蛋白Dl，編碼叢蛋白Dl的核酸或叢蛋白Dl的配體的分子，用于制備治療或診斷涉及叢蛋白Dl的表達(dá)的病癥的治療組合物的應(yīng)用。所有的這些分子這里鑒定為"結(jié)合分子"或"結(jié)合個(gè)體"。病癥包括，尤其是其中叢蛋白Dl表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，腫瘤血管或活化巨噬細(xì)胞的病癥。叢蛋白Dl表達(dá)于其上的腫瘤細(xì)胞包括腦腫瘤，尤其是星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤與成血管細(xì)胞瘤，結(jié)腸癌，尤其是結(jié)腸導(dǎo)管癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌，尤其是腎透明細(xì)胞癌，乳房癌，尤其是乳腺導(dǎo)管癌，子宮癌，鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，肺癌，尤其是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，軟組織肉瘤等等。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的病癥是炎癥性的疾病時(shí)，它們尤其是自身免疫性疾病，更特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，或者它們是動(dòng)脈粥樣硬化或多發(fā)性硬化。結(jié)合叢蛋白Dl的分子例如選自抗體，抗體片段，蛋白質(zhì)，蛋白功能域，肽，小分子。這些分子可用于靶向叢蛋白。結(jié)合編碼叢蛋白Dl的核酸的分子是例如寡核苷酸，如RNA或DNA適體，例如選自siRNA，反義RM，反義磷硫代寡核苷酸。這些分子可用于干擾叢蛋白Dl的表達(dá)。結(jié)合叢蛋白Dl配體的分子例如選自抗配體的抗體，叢蛋白Dl的可溶性胞外域或小分子，如肽，其結(jié)合叢蛋白Dl配體。這些分子可用于捕獲循環(huán)叢蛋白Dl配體，預(yù)防配體與腫瘤脈管細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞或活化巨噬細(xì)胞上的叢蛋白Dl結(jié)合，妨礙這些細(xì)胞上叢蛋白Dl的功能。為了進(jìn)行診斷，結(jié)合分子合適地用可檢測的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。這種可檢測的標(biāo)記例如選自放射性標(biāo)記，順磁性的標(biāo)記，熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。可以在體內(nèi)，原位或體外，在體液或組織的樣本中進(jìn)行診斷。診斷技術(shù)的例子是在活組織檢查或腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行例如叢蛋白DlmRNA的原位雜交或免疫組織化學(xué)。為了進(jìn)行治療，結(jié)合分子是例如擁有損傷或殺死腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)體，特別是細(xì)胞毒素實(shí)體，如放射性核素，毒素，用于硼中子俘獲治療法(BNCT)的硼，或通過可裂解的接頭與結(jié)合個(gè)體偶聯(lián)的前體藥物，其隨接頭，或誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的肽的裂解而活化，其的一個(gè)例子是(KLAKLAK)2序列。通過分子遺傳工程技術(shù)把這種肽添加于結(jié)合個(gè)體中。如上所述的實(shí)體可以直接與結(jié)合個(gè)體配合，或它們可以納米裝置存在，如脂質(zhì)體或聚合體，其與結(jié)合個(gè)體配合。硼中子俘獲治療法(BNCT)包括用中子對(duì)患病區(qū)域如腫瘤或炎癥進(jìn)行輻射，其中硼在脂質(zhì)體綴合物的靜脈注射以后已經(jīng)積累，之后在破壞性的a-粒子發(fā)射之下硼原子將衰退為鋰。作為選擇，治療可能受到在腫瘤脈管中誘導(dǎo)局部血栓形成，以阻擋血液供給到腫瘤并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響。這種分子的一個(gè)例子是組織因子(TF)。有利地，緊接著靜脈內(nèi)給藥，叢蛋白Dl可以用特異性的結(jié)合分子耙向，因?yàn)閰驳鞍譊l表達(dá)于腫瘤血管中的內(nèi)皮細(xì)胞的腔側(cè)。與結(jié)合分子偶聯(lián)的治療化合物，其用于損傷或殺死腫瘤細(xì)胞，可以從內(nèi)部到達(dá)腫瘤，而且誘導(dǎo)血栓形成的化合物可以被容易地傳遞到它們的作用位點(diǎn)。干擾叢蛋白Dl功能表示一種抑制血管發(fā)生，抑制腫瘤細(xì)胞遷移，和抑制巨噬細(xì)胞遷移的方法。因此，本發(fā)明提供了通過使用特異性存在的叢蛋白Dl以局部地傳遞治療到疾病組織，和/或通過干擾叢蛋白Dl的功能或叢蛋白Dl與它的配體之間的相互作用，治療或抑制其中涉及叢蛋白Dl的病癥的方法。發(fā)明詳述本發(fā)明因此基于叢蛋白Dl可用作腫瘤血管中的可耙向標(biāo)記，用作腫瘤血管發(fā)生中涉及的可耙向蛋白，用作腫瘤細(xì)胞中的可粑向標(biāo)記，和用作細(xì)胞遷移中涉及的可靶向蛋白的事實(shí)。本發(fā)明因此也涉及結(jié)合叢蛋白Dl，它的基因或mRNA或它的配體的分子在診斷和治療中的應(yīng)用。各種特異性結(jié)合分子及其衍生物可用于本發(fā)明，尤其是蛋白質(zhì)的化合物，如，但不限于，抗體，抗體片段，單結(jié)構(gòu)域抗體片段，其他的蛋白質(zhì)的結(jié)合功能域，如，但不限于，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，和特異性結(jié)合叢蛋白Dl或它的配體的小分子。為了結(jié)合叢蛋白Dl基因或從叢蛋白Dl基因核酸分子轉(zhuǎn)錄的mRNA，可以使用如DNA或RNA適體。在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，叢蛋白Dl或叢蛋白Dl配體結(jié)合分子是抗體，特別是單克隆抗體，更特別是人或人源化的抗體，其中原始抗體的恒定區(qū)被人抗體的恒定區(qū)或其片段取代，而仍然結(jié)合叢蛋白Dl或它的配體?？贵w優(yōu)選是人IgGl抗體。但是，本發(fā)明也包含其他的人抗體同種型，包括IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgAl，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。所有動(dòng)物來源的抗體的各種同種型也可用于本發(fā)明?？贵w可以是全長抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，包括Fab，F(xiàn)(ab')2，單鏈Fv片段，或單結(jié)構(gòu)域VHH，VH或VL單結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，抗叢蛋白Dl的抗體是由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的人單克隆抗體，該雜交瘤包括獲自免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的B細(xì)胞，其與無限增殖化細(xì)胞融合，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因與人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，或者由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)物來源的抗體或抗體片段，該雜交瘤細(xì)胞包括獲自免疫的動(dòng)物的B細(xì)胞，其與無限增殖化細(xì)胞融合，或者由用編碼所述抗體或抗體片段的cDNA或基因組DNA轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞產(chǎn)生的人和動(dòng)物抗體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了具有對(duì)叢蛋白Dl的親合力的單結(jié)構(gòu)域(VHH)入抗體，更具體地說是入單結(jié)構(gòu)域抗體A12(SEQIDNO:1)與F8(SEQIDNO:2),或不展示于M13噬菌體上，本領(lǐng)域技術(shù)人員也已知作為噬菌體展示VHH抗體。一個(gè)優(yōu)選的單鏈抗體來源于抗體11F5H6與17E9C12。單鏈抗體的序列示于SEQIDNO:3與SEQIDNO:4。用于本發(fā)明的抗體可以是高親合力抗體，其在非轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中內(nèi)源的球蛋白基因座已經(jīng)被人球蛋白基因座取代，從而允許在這種動(dòng)物中產(chǎn)生人抗體(Jakobovits，A.CurrOpinBiotechnol6:561-566(1995))。本發(fā)明更進(jìn)一步地涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的方法，包括用叢蛋白Dl，或表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞，或編碼叢蛋白Dl融合核酸，或叢蛋白Dl的胞外域的一部分免疫動(dòng)物，以便通過動(dòng)物的B細(xì)胞產(chǎn)生抗叢蛋白Dl的抗體，從動(dòng)物分離B細(xì)胞，并使B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，以獲得分泌抗體的無限增殖化細(xì)胞。動(dòng)物優(yōu)選是具有包括人重鏈轉(zhuǎn)基因與人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以便得到的抗體被人源化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括用合成肽，選自叢蛋白Dl胞外域，例如相當(dāng)于成熟叢蛋白Dl氨基酸序列的氨基末端的肽47-63，來免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是優(yōu)選對(duì)重組體胞外域，優(yōu)選與叢蛋白的其他家族成員具有低相似性的區(qū)域，例如包括氨基酸47-546的區(qū)域，缺乏Met-相關(guān)序列，進(jìn)行免疫?？梢酝ㄟ^插入編碼核酸到適合的原核表達(dá)載體中，例如在p-半乳糖苷酶啟動(dòng)子的調(diào)控下，用所述的栽體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，并從純化的包涵體分離重組體蛋白，在大腸桿菌細(xì)胞中產(chǎn)生所述的重組體叢蛋白Dl胞外域。但是優(yōu)選通過用所述的重組體叢蛋白Dl胞外域免疫來產(chǎn)生，該重組體叢蛋白Dl胞外域由真核細(xì)胞產(chǎn)生，因此包含翻譯后修飾，其與天然叢蛋白Dl中存在的那些胞外域非常類似，例如由用包含在巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子調(diào)控下的，編碼所述胞外域的核酸的載體轉(zhuǎn)染以后的中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞產(chǎn)生。重組體胞外的叢蛋白Dl片段可以與或不與便于純化的標(biāo)簽融合，例如VSV標(biāo)簽或免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)。生產(chǎn)抗體的方法也可包括把來自于所述的叢蛋白Dl特異性B細(xì)胞的抗體編碼區(qū)克隆到表達(dá)載體中，并表達(dá)該編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體是pHENIXHISVSV，能通過抗體的大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)，其羧基末端的旁鄰為水泡性口炎病毒(VSV-標(biāo)簽)與8個(gè)His標(biāo)簽。VSV標(biāo)簽是指使用特異性抗體，便于免疫組織化學(xué)的檢測。8個(gè)His標(biāo)簽是指便于基于鎳親和層析的純化。其他的表達(dá)載體同樣可以使用。更具體地說，本發(fā)明提供了一種分離的單結(jié)構(gòu)域抗體A12，其解離常數(shù)小于2x10」M，其結(jié)合叢蛋白Dl的氨基末端，其在免疫組織化學(xué)染色中檢測叢蛋白Dl,并朝向表達(dá)叢蛋白Dl的腫瘤血管，還提供了一種分離的單結(jié)構(gòu)域抗體F8，其解離常數(shù)小于3xl0」M，其結(jié)合叢蛋白Dl的氨基末端，其在免疫組織化學(xué)染色中檢測叢蛋白Dl，并朝向表達(dá)叢蛋白Dl的腫瘤血管。兩個(gè)分離的單結(jié)構(gòu)域抗體都可與人IgGl重鏈的恒定區(qū)或小鼠IgGl重鏈的恒定區(qū)融合。優(yōu)選地，完全的人抗體可用于本發(fā)明范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用人源化的或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物來源的抗體。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了雙特異性抗體，其具有叢蛋白Dl的結(jié)合特異性，和人抗原遞呈細(xì)胞或Fc受體的結(jié)合特異性，其中Fc受體是Fc(y)Rl或人Fc(oc)受體。本發(fā)明還提供了編碼優(yōu)選抗體，或抗原結(jié)合部分的核酸分子。重組體表達(dá)載體，其包括編碼本發(fā)明的抗體的核酸，以及用這種載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，也包括在本發(fā)明中。用于本發(fā)明的其它結(jié)合分子是特異性結(jié)合叢蛋白Dl的小分子。術(shù)語"小分子"常常涉及分子量為500或以下的分子。術(shù)語是目前通常使用的，因此對(duì)技術(shù)人員來說是清楚的。而且，小分子文庫已經(jīng)是可用的或正在開發(fā)中。這種文庫的一個(gè)例子是NIH分子文庫小分子貯藏庫(MLSMR)。對(duì)這種文庫進(jìn)行高通量篩選(HTS)，以鑒定能結(jié)合叢蛋白Dl的分子。本發(fā)明還涉及來源于這種文庫的篩選的小分子?？梢杂糜诒景l(fā)明的其它化合物包括肽或適體，其結(jié)合叢蛋白Dl的胞外域，從而干擾叢蛋白Dl配體與叢蛋白Dl的結(jié)合(Ulrich，Med.Chem.1(2):199-208(2005))。相反地，這種肽或適體也可與叢蛋白Dl配體的叢蛋白Dl結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而干擾配體結(jié)合叢蛋白Dl。為了干擾叢蛋白Dl基因的表達(dá)，使用另一種結(jié)合分子，特別是siRNA，反義RNA或反義磷酸硫代核苷酸。小的干擾RNA(siRNA)包括干擾信使RNA翻譯的小鏈RNA。SiRNA與靶信使RNA的互補(bǔ)部分結(jié)合并加用于降解的標(biāo)簽于它，從而抑制基因表達(dá)。這通常被稱為基因"沉默"。SiRNA的長度通常為21到23個(gè)核苷酸。反義RNA是從DNA的編碼鏈，而不是模板鏈轉(zhuǎn)錄的RNA分子，因此它與有義mRNA互補(bǔ)。有義與反義RNA之間形成的雙螺旋阻斷了翻譯，還可使兩個(gè)分子都經(jīng)受雙鏈特異性核酸酶，從而抑制基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)的抑制可用于阻斷血管發(fā)生和腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的遷移。優(yōu)選地，上面描述的結(jié)合分子與真核細(xì)胞中的叢蛋白Dl，它的基因或它的配體結(jié)合。所述分子在靜脈注射之后在腫瘤中特異性累積，或在靜脈注射之后在腫瘤血管中特異性累積。全部都結(jié)合叢蛋白Dl的抗體，其片段，小分子或其它蛋白質(zhì)的化合物，可以各種方式使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及結(jié)合叢蛋白Dl的胞外部分的化合物，并且該結(jié)合導(dǎo)致干擾叢蛋白Dl的功能。作為選擇，本發(fā)明涉及結(jié)合叢蛋白Dl的細(xì)胞內(nèi)功能域的化合物，其通過叢蛋白Dl阻止發(fā)出信號(hào)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，這種結(jié)合分子與叢蛋白Dl結(jié)合，以通過抑制叢蛋白Dl配體，特別是神經(jīng)氈蛋白-1，神經(jīng)氈蛋白-2，腦信號(hào)蛋白3C，神經(jīng)氈蛋白3E，VEGF-受體-l，VEGF-受體-2或VEGF-A與叢蛋白Dl的結(jié)合，來干擾多組分的膜復(fù)合物的形成。這種結(jié)合分子導(dǎo)致通過叢蛋白Dl對(duì)配體誘導(dǎo)的GTP酶發(fā)出信號(hào)的抑制，或抑制表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞，特別是腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞，肺瘤細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的遷移。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其涉及一種誘導(dǎo)表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞裂解的方法，包括在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，使表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞與結(jié)合分子，特別是本發(fā)明的抗體接觸，以便發(fā)生表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞的裂解。仍然在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)合分子與效應(yīng)化合物結(jié)合或偶聯(lián)，該效應(yīng)化合物可以檢測叢蛋白Dl的存在用于診斷目的，或者可以執(zhí)行對(duì)表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞的作用。診斷或治療的效應(yīng)化合物可以與結(jié)合分子直接偶聯(lián)，或者可以存在于運(yùn)載栽體中，如納米裝置，特別是脂質(zhì)體或聚合體，其與結(jié)合分子偶聯(lián)。作為選擇，結(jié)合分子可以是結(jié)合叢蛋白Dl與效應(yīng)化合物的雙特異性抗體，從而使效應(yīng)化合物靶向表達(dá)叢蛋白Dl的位點(diǎn)或細(xì)胞。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供了這種結(jié)合分子在診斷由叢蛋白Dl的表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法中的應(yīng)用，該方法包括蛋白質(zhì)的，適體的或小分子叢蛋白Dl結(jié)合分子的靜脈傳遞，該結(jié)合分子與效應(yīng)化合物配合，以允許進(jìn)行結(jié)合分子的體內(nèi)檢測。診斷效應(yīng)化合物是例如放射性同位素或用于核磁共振成象(MRI)的造影劑，如釓-DTPA,或熒光染料。放射性物質(zhì)的例子包括，但不限于锝""("，c),碘-123(1231)，硤-131(1311)，錸-186或-188(186/188Re),鎵-67(67Ga)，P-射線發(fā)射物質(zhì)釔-90(9°Y)或镥-177(177Lu)，正電子發(fā)射同位異量素氟-18CF)與碳-11("C)。這種放射性同位素可用于檢測或損傷或殺死表達(dá)叢蛋白Dl的細(xì)胞。通常各種同位異量素用于診斷與治療。技術(shù)人員熟知哪種同位異量素用于哪種組織和用于哪種應(yīng)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的，適體的和小分子的結(jié)合分子，與毒劑如化療劑直接結(jié)合或偶聯(lián)，或位于運(yùn)輸載體上，特別是納米裝置，如脂質(zhì)體或者聚合體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的叢蛋白Dl結(jié)合個(gè)體與一種或多種化療劑偶聯(lián)，該化療劑選自氮芥(例如，環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺)，氮丙啶(例如，硫替派)，烷基磺酸鹽(例如，白消安)，亞硝基脲(例如亞硝脲氮芥和鏈脲霉素)，鉑復(fù)合物(例如，卡鉑和順氯氨鉑)，非典型的烷化劑(例如，氮烯唑胺和temozolamide),葉酸類似物(例如，氨甲喋呤)，嘌呤類似物(例如，氟達(dá)拉濱和巰基嘌呤)，腺苷類似物(例如，克拉屈濱和噴司他丁)，嘧啶類似物(例如，氟尿嘧咬(單獨(dú)或與甲酰四氫葉酸結(jié)合)和吉西他賓)，代用品尿素(例如，羥基脲)，抗腫瘤抗生素(例如，爭光霉素和阿霉素)，表鬼臼脂素(例如，鬼臼亞乙苷和表鬼臼毒噻吩糖苷)，微管劑(例如，docetaxel和紫杉醇)，喜樹堿類似物(例如，依立替康和托泊替康)，酶(例如，天冬酰胺酶)，細(xì)胞因子(例如，干擾白細(xì)胞素-2和千擾素-a),單克隆抗體(例如，曲妥單抗和貝伐單抗)，重組體毒素和免疫毒素(例如，重組體霍亂菌毒素-B和TP-38)，癌癥基因治療劑，和癌癥疫苗(例如，抗端粒末端轉(zhuǎn)移酶的疫苗)。化療劑優(yōu)選選自阿霉素，順氯氨鉑，爭光霉素硫酸鹽，亞硝脲氮芥，苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲。其他的化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。也可以通過誘導(dǎo)腫瘤脈管系統(tǒng)中局部血栓形成，來阻斷它的血液供給，對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。在這個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子可用于把血栓形成誘導(dǎo)分子，如凝血輔因子TF(組織因子)，放射性實(shí)體或毒素如篦麻毒素，靶向腫瘤的位點(diǎn)。效應(yīng)化合物可以與結(jié)合分子，特別是叢蛋白Dl結(jié)合分子偶聯(lián)，或者可以存在于納米裝置中，如脂質(zhì)體或聚合體，其與叢蛋白Dl結(jié)合分子偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明，治療癌癥或炎癥性病癥的一種可選擇的方法是用硼。本發(fā)明的結(jié)合分子可與運(yùn)輸載體，特別是納米裝置，如脂質(zhì)體或聚合體配合，這些栽體帶有硼以獲得治療組合物。該組合物在患病的區(qū)域傳遞和累積以后，用中子對(duì)該區(qū)域進(jìn)行輻射，導(dǎo)致能損傷或殺死胖瘤內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和/或活化巨噬細(xì)胞的放射性和細(xì)胞毒素a顆粒的發(fā)射。用于腫瘤血管靶向的抗體最好對(duì)叢蛋白Dl具有高的親合力，例如高于1(T8，優(yōu)選高于1(T9，更優(yōu)選高于1(T。M。但是抗體的高親合力和高分子量將限制穿透到腫瘤組織。因此，通過RT-PCR克隆獲得的，編碼所述單克隆抗體的核酸，可用于產(chǎn)生抗體衍生物，例如缺乏恒定區(qū)而且是一價(jià)的抗體，或抗體片段，其適于通過誘變步驟進(jìn)行的血管乾向或肺瘤穿透的最佳親合力。這些抗體衍生物降具有較低的親合力和較低的分子量，而且將具有改良的腫瘤細(xì)胞靶向特性。本發(fā)明的各種結(jié)合分子可以組合到一個(gè)混合物中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，混合物的成員具有相異的親合力。這種組合的一個(gè)例子是單克隆抗體和/或抗體片段的混合物或小分子抗體的混合物。高親合力的單克隆抗體可用于靶向脈管，但是較低親合力的較小片段能較好地穿透并到達(dá)腫瘤細(xì)胞。作為選擇，叢蛋白Dl結(jié)合分子的混合物可與叢蛋白Dl配體結(jié)合分子，和/或能與編碼叢蛋白Dl的核酸結(jié)合的分子一起使用?；蛘邊驳鞍譊l配體結(jié)合分子可以與能結(jié)合編碼叢蛋白Dl的核酸的分子聯(lián)合。本發(fā)明的叢蛋白Dl結(jié)合分子可用于治療由叢蛋白Dl的表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法中，包括以能有效治療該疾病的劑量靜脈傳遞本發(fā)明的結(jié)合分子。結(jié)合分子還可用于診斷由叢蛋白Dl的表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法中，包括靜脈傳遞叢蛋白Dl結(jié)合分子與順磁性，熒光或放射性示蹤劑的綴合物，接著核磁共振成象，光學(xué)成象，SPECT或PET。結(jié)合分子更進(jìn)一步地可用于治療或抑制由叢蛋白Dl的表達(dá)介導(dǎo)的疾病的方法中，包括靜脈傳遞本發(fā)明的蛋白質(zhì)和小分子結(jié)合分子，或蛋白質(zhì)和小分子結(jié)合分子的組合物。待治療或診斷的疾病可以是癌癥，炎性疾病，特別是自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，或動(dòng)脈粥樣硬化，或多發(fā)性硬化。診斷可以在體內(nèi)和體外進(jìn)行。體內(nèi)方法是如上所述的，而且可以在放射性標(biāo)記的結(jié)合分子在疾病組織中累積以后，用核磁共振成象(MRI)或用SPECT或PET照相進(jìn)行。另一種診斷方法包括體外或經(jīng)體內(nèi)檢測樣本中叢蛋白Dl的存在。這種方法包括在抗體與叢蛋白Dl之間的復(fù)合物形成的條件下，使樣品與叢蛋白Dl的結(jié)合分子，或結(jié)合叢蛋白Dl基因或它的mRNA或來源于該mRNA的拷貝DNA的核酸接觸，所有這些結(jié)合分子和核酸都與可檢測標(biāo)記連接，并檢測復(fù)合物的形成。可以通過目測可檢測標(biāo)記來檢測復(fù)合物。樣品可以是體液，如血液，血清，血漿，唾液，尿，精液，糞便，或組織，如肺瘤細(xì)胞的活組織檢查。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及一種表達(dá)載體，其包括Llama抗體F8或A12,或來源于抗體11F5H6的單鏈抗體的編碼序列，和合適的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明還涉及用所述的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及通過表達(dá)該表達(dá)載體可獲得的重組蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種表達(dá)栽體，其包括叢蛋白Dl的胞外域的編碼序列，其任選地與人重鏈的恒定區(qū)融合，以及合適的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明還涉及用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及通過表達(dá)該表達(dá)載體可獲得的重組蛋白。重組蛋白包括叢蛋白Dl的胞外域，其與叢蛋白Dl配體結(jié)合，從而阻止配體與細(xì)胞締合的叢蛋白Dl結(jié)合。優(yōu)選地，編碼重組蛋白的編碼序列包括叢蛋白Dl的第47-506位氨基酸，其與叢蛋白Dl配體結(jié)合，從而阻止配體與細(xì)胞締合的叢蛋白Dl的結(jié)合，或者叢蛋白Dl的胞外域的第507-1274氨基酸，其與叢蛋白Dl配體結(jié)合，從而阻止配體與細(xì)胞締合的叢蛋白Dl的結(jié)合。這種重組蛋白可攜帶能增加對(duì)叢蛋白Dl配體的親合力的突變，從而具有增加的作為誘導(dǎo)受體的效力。這種突變通常通過改變用于產(chǎn)生重組蛋白的編碼序列誘導(dǎo)。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及本發(fā)明的結(jié)合分子在治療或抑制由叢蛋白Dl介導(dǎo)的疾病的方法中的應(yīng)用，包括靜脈或腫瘤內(nèi)傳遞如上所述的誘導(dǎo)叢蛋白Dl胞外域，或在治療或抑制由叢蛋白Dl介導(dǎo)的疾病的方法中的應(yīng)用，包括腺病毒或慢病毒的靜脈傳遞，其含有編碼叢蛋白Dl的重組體胞外域的核苷酸或其如上所述的部分。這些拮抗的誘導(dǎo)叢蛋白Dl受體干擾了叢蛋白Dl與它的配體，特別是神經(jīng)氈蛋白-1，腦信號(hào)蛋白3C和腦信號(hào)蛋白3E之間的相互作用，從而干擾了叢蛋白Dl的功能。優(yōu)選地，相較于叢蛋白Dl，誘導(dǎo)叢蛋白Dl受體具有增加的對(duì)叢蛋白Dl配體的親合力。可通過產(chǎn)生叢蛋白Dl胞外域的文庫，攜帶隨機(jī)引入的突變，并選擇在細(xì)胞遷移分析中具有最有效的拮抗行為的誘導(dǎo)受體，來獲得這種增加的親合力。為了產(chǎn)生所述的蛋白質(zhì)的分子(包括肽，多肽與糖基化的多肽或具有其他的翻譯后或翻譯前修飾的多肽)，需要插入編碼叢蛋白Dl的胞外域片段的重組體核酸到表達(dá)栽體中，該片段包含腦信號(hào)蛋白3C，腦信號(hào)蛋白3E與NP-1的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的拮抗劑優(yōu)選由本發(fā)明的核酸或表達(dá)載體產(chǎn)生，優(yōu)選在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。本發(fā)明的分子可用于如上所述的治療方法和/或與常規(guī)的療法，或用于更進(jìn)一步預(yù)防腫瘤新血管生成形成的抗血管生成的療法，或放射治療和/或輔助化療聯(lián)合。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及一種鑒定能與叢蛋白Dl結(jié)合的分子的方法，該方法包括使許多分子的集合與叢蛋白Dl接觸，并從該集合選擇顯示與叢蛋白Dl結(jié)合的分子作為叢蛋白Dl的結(jié)合分子。分子的集合可以例如小分子文庫，蛋白質(zhì)陣列等等存在。用于篩選分子集合的技術(shù)本身是已知的。本發(fā)明在于鑒定被結(jié)合的靶，其是叢蛋白Dl。在本申請中，術(shù)語"結(jié)合分子，，用于各種結(jié)合分子，也即，與叢蛋白Dl結(jié)合的分子，與編碼叢蛋白Dl基因的核酸結(jié)合的分子，以及與叢蛋白Dl配體結(jié)合的分子。所有這些類型的分子可與如上所述的效應(yīng)化合物偶聯(lián)。在下述的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更進(jìn)一步地舉例說明，而且實(shí)施例的目的決不是為了限制本發(fā)明。實(shí)施例涉及下列圖圖l:叢蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)域已經(jīng)鑒定了4個(gè)亞族，命名為叢蛋白A-D。水平畫影線的盒表示Sema功能域，斜著畫影線的盒表示Met-相關(guān)序列(MRS)基序，空心的盒表示PLXND1的非典型MRS基序。叢蛋白B亞族成員具有可能的弗林蛋白酶樣的蛋白水解位點(diǎn)，由灰色條帶標(biāo)記。橫跨膜區(qū)域由陰影的盒標(biāo)記，后面是2個(gè)保守的細(xì)胞內(nèi)功能域，都包括SP-功能域，其由2個(gè)橢圓形標(biāo)記。圖2:A)使用地高辛標(biāo)記的小鼠特異性W,/^RNA探針，對(duì)大腦的Mel57-VEGF-A165病變進(jìn)行原位雜交分析。腫瘤脈管是強(qiáng)陽性的(箭頭)，然而遠(yuǎn)離病變的大腦毛細(xì)管是陰性的(圖2B中比較了ISH分布圖與CD34染色)。圖3:多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(A)，肉瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶(B)，黑素瘤(C)與乳房癌(D)的人PLXNDl-特異性ISH分析。插圖顯示連續(xù)切片的CD31染色。使用有義探針，對(duì)照ISH是陰性的(未顯示)。注意，在這些肺瘤中，PLXNDl表達(dá)不限于血管在腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了高水平的PLXNDl轉(zhuǎn)錄物。t-肺瘤，V-脈管。圖4:使用人特異性地高辛標(biāo)記的RNA探針(A)進(jìn)行ISH分析，并用正常大腦的CD31(B)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。注意，脈管豐富存在，但是這些脈管不表達(dá)叢蛋白Dl轉(zhuǎn)錄物。圖5:噬菌體(A)與對(duì)應(yīng)的單結(jié)構(gòu)域抗體(sdabs)(B)A12和F8對(duì)肽H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2的特異性。在A中，1(T噬菌體允許與PLXNDl肽，BSA，人IgG或本文中描迷的不相關(guān)的肽結(jié)合。嚴(yán)格的洗滌以后，使用抗-M13抗體對(duì)結(jié)合的噬菌體進(jìn)行檢測。在B中，現(xiàn)在對(duì)可溶性sdabs進(jìn)行類似的孵育。洗滌以后，檢測結(jié)合的sdabs，并通過VSV-G-標(biāo)簽進(jìn)行不完全定量。圖6:單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8之間結(jié)合的解離常數(shù)(kd's),使用Biacore2000(Uppsala，瑞典)生物傳感器進(jìn)行測定。傳感器芯片與蛋白質(zhì)偶聯(lián)化學(xué)制品購自BiacoreAB。PLXNDl肽-KLH綴合物(27Mg/ml溶于乙酸鈉，pH4.0)或BSA(1ing/ml溶于乙酸鈉，pH5.0)，使用N-乙基-N'-(二曱基氨基丙基)碳二亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺，在制造商建議的條件下，與活化的CM5表面偶聯(lián)。未反應(yīng)的基團(tuán)通過1M乙醇胺，pH8.5進(jìn)行滅活。25X:，在HBS-EP緩沖液(10mMHepes，pH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005°/。表面活性劑P20)中，以10ml/分鐘的流速，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的測定。6個(gè)濃度的Ni親和純化的sdabs(lmM到50pM的范圍)，用于確定PLXND1肽的相互作用的解離常數(shù)(Kds)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)以后，傳感器表面用10mMNaOH進(jìn)行再生。由PLXNDl-表面的結(jié)合減去對(duì)照BSA-表面的結(jié)合所定義的特異性結(jié)合，使用BIAevaluation4.1軟件和1:1Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行分析。單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8的親和性是2.1x10—W與3.5xl(T8M。圖7:單結(jié)構(gòu)域抗體的叢蛋白Dl特異性的評(píng)估。圖A顯示了用單結(jié)構(gòu)域抗體A12,利用用于該抗體檢測的VSV-G標(biāo)簽，對(duì)小鼠胚胎(E16.5)的小梁骨的生長板進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色。插圖顯示了使用小鼠特異性的地高辛標(biāo)記的叢蛋白Dl探針，對(duì)類似的胚胎結(jié)構(gòu)進(jìn)行的原位雜交。注意，原位雜交與免疫染色中叢蛋白Dl的重疊。圖7B是棵鼠的大腦中Mel57-VEGF-A165病變的一個(gè)代表性的例子。在叢蛋白DlISH中也是陽性的脈管系統(tǒng)(也參見圖2)，用單結(jié)構(gòu)域抗體F8是免疫陽性的。圖8:用單結(jié)構(gòu)域抗體A12對(duì)人腦腫瘤的選擇物進(jìn)行免疫染色。顯示的腫瘤是A)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，B)黑素瘤的轉(zhuǎn)移性病灶，C)乳房癌與D)腎細(xì)胞癌。A和B中的插圖包括僅僅用抗VSV抗體進(jìn)行的對(duì)照染色，表明腫瘤染色是特異性的。注意，脈管與腫瘤細(xì)胞與抗體高度反應(yīng)。圖9:用單結(jié)構(gòu)域抗體A12對(duì)黑素瘤的一組進(jìn)展進(jìn)行免疫染色。對(duì)黑素瘤的痣，發(fā)育異常的痣與橫向和縱向生長階段進(jìn)行免疫染色。注意，僅僅贅生性細(xì)胞表達(dá)叢蛋白Dl。圖10:用單結(jié)構(gòu)域抗體A12,對(duì)用ZD6474處理的小鼠中的Mel57-VEGF-A腦腫瘤切片進(jìn)行免疫染色。在未處理的或空白對(duì)照劑處理的小鼠中，用該抗體肺瘤脈管染色是陽性的。然而，在ZD6474處理的小鼠中，叢蛋白Dl表達(dá)存在劑量依賴的降低。ZD6474以指定的劑量，口服，每天一次給予。圖11:用巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD68(染色藍(lán)色)和單結(jié)構(gòu)域抗體A12(染色紅色)，對(duì)乳房癌進(jìn)行雙重免疫染色。如通過紫色染色蛋白所揭示的，巨噬細(xì)胞的亞群表達(dá)叢蛋白Dl。圖12:噬菌體A12，F(xiàn)8或不相關(guān)的噬菌體體內(nèi)返回到Mel57-VEGFH5大腦病變中。帶有腫瘤的小鼠在尾部靜脈中注射1012噬菌體，5分鐘以后，麻醉小鼠，并用15ml磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行心臟灌注。處死小鼠，取出大腦，并分析冷凍切片的噬菌體含量和分布。A)大腦Mel57-VEGF^病變的凍結(jié)切片的M13染色。噬菌體明顯地是脈管締合的，如通過對(duì)連續(xù)切片的抗CD34免疫染色所證明的，示于B。箭頭指遠(yuǎn)離病變的CD34陽性脈管，其沒有被抗M13染色突出。(A)中的插圖顯示了其中注射不相關(guān)的噬菌體的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。C)在帶有腫瘤的小鼠中靜脈注射以后，sdabF8的分布。Sdabs使用抗VSV抗體，通過免疫組織化學(xué)目測檢驗(yàn)。注意，sdab發(fā)現(xiàn)于腫瘤脈管中，而不是正常大腦毛細(xì)管中。插圖顯示了其中注射不相關(guān)的sdab的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。觀察到間隙的局部化，其與這些腫瘤中脈管有漏隙的性質(zhì)一致。D)噬菌體返回的定量。使用激光捕獲解剖顯微術(shù)，對(duì)來自10nm的冷凍切片進(jìn)行腫瘤組織解剖。TG1細(xì)胞感染以后，對(duì)形成克隆的噬菌體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。從腫瘤洗脫的F8噬菌體，比從未受影響的腦組織的類似區(qū)域洗脫的多20倍。圖13:單結(jié)構(gòu)域抗體返回到本身不是新形成的腫瘤脈管中?？檬蠊噍斎松窠?jīng)膠質(zhì)瘤異種移植E98的1.5xl()5細(xì)胞的細(xì)胞懸液，其獲自皮下E98腫瘤。3周以后，在尾部靜脈中注射攜帶單結(jié)構(gòu)域抗體F8的噬菌體，5分鐘以后，麻醉小鼠，并用15ml磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行心臟灌注。然后處死小鼠，取出大腦并固定在福爾馬林中。用抗M13p8蛋白的抗體(A)，內(nèi)皮標(biāo)記CD34(B)和glut-1(C，一種用于之前原有的大腦毛細(xì)管的標(biāo)記)對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行染色。A，B與C的比較揭示，不僅新形成的腫瘤脈管累積噬菌體F8，而且未膨脹的大腦脈管也累積噬菌體F8，未膨脹的大腦脈管表達(dá)glut-l，并因此被認(rèn)為是已經(jīng)整合到腫瘤中的之前原有的大腦脈管。圖14:叢蛋白Dl的胞外域?qū)Ψ瘟雒}管系統(tǒng)發(fā)育的影響。人黑素瘤細(xì)胞系Mel57的雙重轉(zhuǎn)染子，其表達(dá)VEGF-A^和包括第1-850位氨基酸的叢蛋白Dl的胞外域，被注射到棵鼠的右頸內(nèi)動(dòng)脈。3周以后，小鼠經(jīng)受釓-DTPA增強(qiáng)的核磁共振成象。圖14A顯示帶有Mel57腦腫瘤的2只對(duì)照小鼠的MR圖象，其只表達(dá)VEGF-A165，圖14B顯示了帶有雙重轉(zhuǎn)染子的2只小鼠的大腦的MR圖像。脈管滲漏，如通過Gd-DTPA溢出所分析的，在雙重轉(zhuǎn)染子中趨向較少，其表明VEGF-A-誘導(dǎo)的脈管滲漏被叢蛋白Dl胞外域所抵制。更重要地，雙重轉(zhuǎn)染的肺瘤中血管被活化，如CD34的上調(diào)所指示的，然而它們表達(dá)glut-l，強(qiáng)烈地表明這些脈管是之前原有的脈管，其通過共同選擇現(xiàn)象整合到腫瘤中。注意，只表達(dá)VEGF-A^的腫瘤中的血管，是glut-l陰性的，因此可以認(rèn)為是新形成的。圖15:用重組體叢蛋白Dl胞外域產(chǎn)生的Western印跡，其在大腸桿菌中表達(dá)，并包含第47-506位(第l泳道)或第225-388位(第2泳道)氨基酸。在用叢蛋白Dl區(qū)域47-506免疫之前(圖A)和之后(圖B)，對(duì)小鼠25的血清進(jìn)行檢測。如圖15B所示，小鼠免疫血清特異性識(shí)別大腸桿菌重組蛋白47-506(52kDa，第1泳道)，與含有叢蛋白Dl殘基225-388的蛋白(18kDa蛋白，其完全存在于用于免疫的序列內(nèi)部，第2泳道)。免疫之前的血清不顯示這種反應(yīng)性(圖A)。當(dāng)在對(duì)肺泡的軟組織肉瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶的免疫組織化學(xué)染色中進(jìn)行檢測時(shí)，小鼠免疫血清(圖D)，而不是免疫之前的血清(圖C)，顯示對(duì)血管和腫瘤細(xì)胞陽性，其染色模式與單結(jié)構(gòu)域抗體A12的染色模式類似。圖16:用獲自小鼠25的B-淋巴細(xì)胞的單克隆IgM抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。抗體11F5H6和17E9C12基于ELISA中對(duì)蛋白47-506的反應(yīng)性選擇，并分析它們在人腫瘤的冷凍切片中檢測叢蛋白Dl的可能性。這些抗體在肉瘤和黑素瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶中顯示強(qiáng)陽性，如圖中所例示的。值得注意的，圖C-F中的插圖表示對(duì)照染色，其中不包括第一抗體。圖A和B表明，這些抗體不能特別地識(shí)別正常腦組織中的脈管結(jié)構(gòu)。圖17:抗體11F5H6的腫瘤返回，以更進(jìn)一步地評(píng)價(jià)單克隆抗體11F5H6是否能識(shí)別腫瘤血管，血管生成Mel57-VEGF-A腫瘤生長在棵鼠的大腦中，基本上如實(shí)施例10中所述?？贵w11F5H6(1mg)注射到外側(cè)尾部靜脈中，并循環(huán)15分鐘。這個(gè)階段以后，小鼠用1.3%異氟烷麻醉，并打開胸部，接著用20ml磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行心臟灌注。該步驟之后，處死小鼠，并取出大腦，急速冷凍或固定于福爾馬林中。4jjm的冷凍切片用抗IgM抗體進(jìn)行染色。圖17A中，表明抗體11F5H6返回到肺瘤脈管而不是正常脈管中，并在其中累積(比較圖1"7A中的抗-IgM染色與圖17B中的抗內(nèi)皮CD31染色)。當(dāng)對(duì)未注射的小鼠進(jìn)行抗IgM染色時(shí)，觀察不到這種染色。因此，11FSH6是一種允許腫瘤靶向的有希望的抗體。圖18:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，叢蛋白Dl在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。用單結(jié)構(gòu)域抗體A12進(jìn)行染色。圖19:叢蛋白Dl在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)。人動(dòng)脈粥樣硬化的蝕斑中巨噬細(xì)胞的亞型表達(dá)叢蛋白Dl。用單結(jié)構(gòu)域抗體AH進(jìn)行染色。進(jìn)行雙重染色，其顯示叢蛋白Dl成紅色，巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD68成藍(lán)色。紫色表明共表達(dá)。表格表示以下內(nèi)容表i:用于叢蛋白Dl表達(dá)的各種病理的分析。表n:黑素細(xì)胞病變中叢蛋白di的表達(dá)從開始到惡性病變增加。具體實(shí)施方案實(shí)施例1叢蛋白Dl在腫瘤締合的血管中的特異性表達(dá)在胚胎發(fā)生期間的血管生成脈管中，叢蛋白Dl不但表達(dá)于神經(jīng)元而且表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明證實(shí)了，叢蛋白Dl表達(dá)于腫瘤締合的血管，而不是正常的血管。這已經(jīng)通過小鼠大腦的原位雜交表明，該小鼠大腦包含血管生成的人黑素瘤病變(圖2)。動(dòng)物腫瘤模型描述于(Kusters，B等人，CancerRes63:5408-5413(2003))。筒而言之，肺瘤細(xì)胞通過微外科手術(shù)注射到右頸動(dòng)脈中，導(dǎo)致腫瘤在右腦半球軟組織中的生長。3周以后，在神經(jīng)病學(xué)癥狀發(fā)病時(shí)，處死小鼠，取出大腦并固定于福爾馬林中。使4jam的切片與地高辛標(biāo)記的有義和反義RNA片段進(jìn)行原位雜交。使用T3和T7RNA聚合酶，分別從PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA探針，其包含3，-非翻譯區(qū)的600個(gè)堿基，而且其旁鄰為T7和T3啟動(dòng)子(VanderZwaag等人(2002)，上文)。原位雜交中，使用反義RNA探針與有義RNA探針作為陰性對(duì)照，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行原位雜交。通過60X:熔化石蠟，并用二曱苯與乙醇順序處理，來對(duì)切片進(jìn)行脫蠟。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中再水化以后，37C進(jìn)行蛋白酶K消化(10jag/mlPBS溶于20mMTris-HClpH7.4/5mMEDTA中)15分鐘。切片然后固定于4°/。緩沖的甲醛中10分鐘，并在0.1M乙酸酐中乙?；?。載玻片接著在^SSC(檸檬酸鈉/氯化鈉)和milliQ中洗滌。干燥以后，載玻片與地高辛標(biāo)記的RNA探針在50。/。甲酰胺/2xSSC中65C雜交過夜。使用小鼠特異性的叢蛋白DlRNA探針，在血管生成的Mel57腫瘤的脈管中觀察到了高水平的叢蛋白D1RNA(圖2)。腫瘤細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)錄物也是陽性的。小鼠與人叢蛋白Dl之間的不理想的同源性，導(dǎo)致使用小鼠探針，在人腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生了較弱的信號(hào)。實(shí)施例2叢蛋白Dl在腫瘤中的表達(dá)為了研究叢蛋白DlRM在人腫瘤樣本中的表達(dá)，我們用人特異性的叢蛋白DlRNA探針進(jìn)行了原位雜交。在許多人腫瘤中發(fā)現(xiàn)了高的叢蛋白D1RNA表達(dá)水平，其中(多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，肉瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病，，腎細(xì)胞癌，結(jié)腸和乳房的腺癌)，腫瘤脈管系統(tǒng)與胂瘤細(xì)胞中都有。表l中提供了表達(dá)叢蛋白Dl的腫瘤類型的概述。圖3顯示了原位雜交的一些例子，例如惡性膠質(zhì)瘤，黑素瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶與結(jié)腸癌的大腦轉(zhuǎn)移性病灶。不僅在腫瘤脈管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了叢蛋白D1RNA，而且在腫瘤細(xì)胞本身發(fā)現(xiàn)了過量的叢蛋白DlRNA。重要地，如圖4A中，在正常的大腦脈管系統(tǒng)中沒有觀察到叢蛋白DlRNA表達(dá)。圖4B中，顯示了CD31染色，其證明豐富的脈管存在于這些切片中。實(shí)施例3抗叢蛋白Dl抗體的制備為了檢測叢蛋白Dl蛋白，選擇對(duì)叢蛋白Dl具有親和性的抗體。為此，構(gòu)建表達(dá)Llama單結(jié)構(gòu)域V-H抗體的M13pHENIX噬菌體文庫，其通過如所述的從LlamaB-淋巴細(xì)胞的RT-PCR構(gòu)建(vanKoningsbruggen，S等人，JImmunolMethods279:149-161(2003))。得到的編碼V-H單結(jié)構(gòu)域抗體(sdab)片段的cDNAs的群體，連接到噬菌粒載體pHENIXHis8VSV中(結(jié)果未顯示)，得到C-末端具有8*His標(biāo)簽與VSV-G-標(biāo)簽的融合產(chǎn)物。大腸桿菌TG1細(xì)胞中進(jìn)行電穿孔以后，收集氨節(jié)青霉素抗性克隆，并合并。得到的文庫具有8xl()8克隆的復(fù)雜組成。百分之八十的質(zhì)粒包含全長sdab插入，如通過PCR分析和sdabs中的VSV-G-標(biāo)簽的免疫學(xué)點(diǎn)印跡檢測所測定的(參見以下)。噬菌體文庫在大腸桿菌TG1細(xì)菌中繁殖作為噬菌粒。噬菌體顆粒通過用胰蛋白酶敏感的輔助噬菌體M13K07(50)感染進(jìn)行拯救。通過用20%聚乙二醇/2.5MNaCl沉淀，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)方法，從培養(yǎng)物上清液純化并濃縮噬菌體。為了選擇噬菌體，其顯示具有對(duì)叢蛋白Dl的親和性的抗體，免疫管用溶于50raMNaHC03(pH9.6)中的5ng/mlKLH綴合肽(H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-C0NH2，相當(dāng)于成熟人PLXND1蛋白的第l-16位氨基酸(登陸號(hào)AY116661)4'C涂層過夜。值得注意的，該肽中第3位的谷氨酸是小鼠序列中的賴氨酸，剩余的氨基酸與小鼠plxndl相同。用PBS/0.05%吐溫20(PBST)嚴(yán)格洗滌以后，非特異性結(jié)合位點(diǎn)用溶于PBST的5%marvel封閉(MPBST，室溫下(RT)1小時(shí))，來自文庫原液的1013噬菌體顆粒與固定的肽一起室溫孵育90分鐘。用PBST與PBS嚴(yán)格洗滌以后，結(jié)合的噬菌體通過胰蛋白酶處理洗脫(10mg/ml，室溫30分鐘)。胰蛋白酶用1%新生的小牛血清滅活以后，洗脫物用于感染對(duì)數(shù)期的TG1細(xì)胞，以擴(kuò)大結(jié)合PLXND1的噬菌體，并計(jì)算結(jié)合物的數(shù)目。為了富集結(jié)合噬菌體，進(jìn)行4輪選擇。從第二輪開始，對(duì)固定于DNA結(jié)合平板(Costar)上的，非結(jié)合肽進(jìn)行選擇，以防止KLH-結(jié)合物的選擇。檢測具有PCR證實(shí)的全長sdab插入的單獨(dú)的PLXND1結(jié)合噬菌體對(duì)叢蛋白Dl的特異性。DNA結(jié)合平板或免疫平板(Nunc)的孔用PLXND1肽或不相關(guān)的肽(1Mg/孔，溶于PBS/0.5MNaClpH9.0)，牛血清蛋白(ljng/孔，溶于50mMNaHC03pH9.6)或人免疫球蛋白G(1jug/孔，溶于50mMNaHC03pH9.6)涂層過夜。用MPBST封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)以后，孔用溶于MPBST的噬菌體室溫孵育1小時(shí)，而且未結(jié)合的噬菌體通過嚴(yán)格洗滌除去。使用HRP-配合的抗Ml3(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ，美國)與四曱基聯(lián)苯胺，對(duì)結(jié)合的噬菌體進(jìn)行檢測(TMB;bioM"ieuxB.V.，荷蘭)。反應(yīng)用2MH2S04結(jié)束，使用ELISA讀數(shù)計(jì)于450nm測定吸光度來定量酶活性。使用這種選擇過程，它們表面上的噬菌體展示V-H單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8確定為特異性結(jié)合物。圖5A表明，M13噬菌體締合的抗體A12與F8特異性結(jié)合叢蛋白Dl肽，而不是牛血清蛋白，免疫球蛋白或不相關(guān)的肽。通過30'C培養(yǎng)于2xTYA培養(yǎng)基/lmMIPTG中，在對(duì)數(shù)期大腸桿菌TG1細(xì)胞中誘導(dǎo)可溶性單結(jié)構(gòu)域抗體的表達(dá)。使用含有蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Basel,瑞士)的水冷的TES緩沖液(200mMTrisHCl，0.5biMEDTA，500fflM蔗糖)，通過滲透裂解來收集Sdabs。使用小鼠單克隆抗VSV-GP5D4，堿性磷酸酶-配合的兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako，丹麥)與NBT/BCIP染色，通過點(diǎn)印跡分析來估算Sdab濃度。在ELISA中測試Sdabs的PLXND1肽特異性。單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8不結(jié)合不相關(guān)的肽，不結(jié)合牛血清蛋白，而且不結(jié)合人免疫球蛋白G(圖5B)。單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8之間結(jié)合的解離常數(shù)(kd's)，使用Biacore2000(Uppsala，瑞典)生物傳感器進(jìn)行測定。傳感器芯片與蛋白質(zhì)偶聯(lián)化學(xué)制品購自BiacoreAB。PLXND1肽-KLH綴合物(27pg/ml，溶于乙酸鈉，pH4.0)或BSA(lyg/ml，溶于乙酸鈉，pH5.0)，使用N-乙基-N'-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺，在制造商建議的條件下，與活化的cm5表面偶聯(lián)。未反應(yīng)的基團(tuán)通過lM乙醇胺，pH8.5進(jìn)行滅活。25°C，在HBS-EP緩沖液(10mMHepes，pH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005%表面活性劑P20)中，以10ml/分鐘的流速，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的測定。6個(gè)濃度的Ni親和純化的sdabs(在1mM到50fiM的范圍內(nèi))，用于測定PLXND1肽的相互作用的解離常數(shù)(Kds)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)以后，傳感器表面用lOmMNaOH再生。由PLXNDl-表面的結(jié)合減去對(duì)照BSA-表面的結(jié)合所定義的特異性結(jié)合，使用BIAevaluation4.1軟件和1:1Langmuir結(jié)合模型進(jìn)行分析。單結(jié)構(gòu)域抗體A12與F8的親和性分別是2.1x10—8M與3.5x10—8M(圖6)。實(shí)施例4用單結(jié)構(gòu)域抗體A12和F8進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色在羧基末端用VSV-His標(biāo)簽對(duì)單結(jié)構(gòu)域抗體進(jìn)行標(biāo)簽，使能用抗VSV抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。按照下列方案，用單結(jié)構(gòu)域抗體A12和F8進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。脫蠟以后，通過用0.03%11202孵育來封閉內(nèi)源過氧化物酶活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過用鏈霉蛋白酶處理來進(jìn)行抗原恢復(fù)。接著，載玻片用正常的馬或山羊血清進(jìn)行預(yù)孵育(以分別封閉人與小鼠組織的切片中的非特異性結(jié)合位點(diǎn))，然后用sdabs孵育l小時(shí)。通過用小鼠或兔抗VSV-G抗血清(Sigma-AldrichChemieB.V.，Zwijndrecht,荷蘭)，視情況而定生物素化的抗小鼠或抗兔抗體(Vector,Burlingame，CA)，和抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物(Vector,Burlingame,CA)連續(xù)孵育1小時(shí)，來檢測Sdabs。最后，通過與蘇木精作為復(fù)染色的3-氨基-9-乙基arbazole(ScyTek，Utah,美國)過氧化物酶反應(yīng)，目測檢驗(yàn)過氧化物酶。所有步驟于室溫進(jìn)行。在免疫組織化學(xué)染色中，抗體A12和F8對(duì)叢蛋白Dl的特異性，首先通過染色小鼠胚，其中叢蛋白Dl在RNA水平的表達(dá)模式,皮較好表征(VanderZwaag等人(2002)，上文)比較分布圖與用抗內(nèi)皮的抗體抗CD31(DAKO,Glostrup，丹麥)進(jìn)行的免疫染色來進(jìn)行檢驗(yàn)。在E16.5的小鼠胚的小梁骨的生長板中，觀察到CD31-陽性血管的免疫染色。染色分布圖與叢蛋白Dl轉(zhuǎn)錄物的原位雜交較好的相關(guān)(圖7A)。血管來源的PLXND1表達(dá)，通過用sdabs和抗人抗CD31抗體(抗人CD31)對(duì)連續(xù)切片進(jìn)行染色，更進(jìn)一步被證實(shí)。實(shí)施例5用F8對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色人黑素瘤細(xì)胞系Me157-VEGF-A的4pm切片大腦的小鼠異種移植(Kusters等人(2003)，上文)，用單結(jié)構(gòu)域抗體F8進(jìn)行染色，根據(jù)實(shí)施例4中舉例說明的方案。抗體明顯地識(shí)別腫瘤血管上的叢蛋白D1(圖7B)。為了更進(jìn)一步地研究叢蛋白Dl蛋白在腫瘤上的表達(dá)，與之有關(guān)的石蠟包埋或各種來源(多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(圖8A)，黑素瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶(圖8B)，結(jié)腸癌(圖8C)和腎細(xì)胞癌(圖8D))的腫瘤組織，用抗PLXND1sdabs進(jìn)行免疫染色。使用抗體的免疫組織化學(xué)和對(duì)連續(xù)切片上的抗人CD31染色進(jìn)行的比較，表明在所有檢驗(yàn)的腫瘤上都表達(dá)，并證實(shí)叢蛋白Dl在腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管中蛋白水平的表達(dá)。實(shí)施例6叢蛋白在惡性細(xì)胞上表達(dá)的時(shí)間選擇為了研究叢蛋白Dl的表達(dá)是否發(fā)生在惡變前的細(xì)胞中，我們?nèi)旧撕谒亓龅囊幌盗羞M(jìn)展，包括良性痣，發(fā)育異常的痣，放射狀生長期的黑素瘤，侵入性黑素瘤和散布的黑素瘤。良性痣和發(fā)育異常的痣中的黑色素細(xì)胞不表達(dá)該蛋白，但是惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在放射狀生長期和徑向生長期腫瘤中對(duì)該蛋白都是陽性的(圖9和表I1)。實(shí)施例7叢蛋白Dl表達(dá)細(xì)胞的活化狀態(tài)叢蛋白Dl表達(dá)與腫瘤血管中內(nèi)皮細(xì)胞的活化狀態(tài)相關(guān)。用ZD6474,—種VEGFR2和EGFR的抑制劑進(jìn)行處理，預(yù)先表明阻斷小鼠腦腫瘤模型中的血管發(fā)生，其導(dǎo)致從血管生成到非血管生成，脈管共同選擇表型的表型轉(zhuǎn)移(43)。用ZD6474進(jìn)行處理，導(dǎo)致腫瘤締合血管中叢蛋白Dl的表達(dá)以劑量依賴的方式降低(圖10)。因此，叢蛋白Dl表達(dá)是活化的內(nèi)皮細(xì)胞的特征。實(shí)施例8用A12對(duì)正常組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)叢蛋白Dl在正常大腦，心臟，皮膚，腎，脾，腸，子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，使用抗體A12通過免疫組織化學(xué)進(jìn)行檢驗(yàn)。增殖的子宮肌層中的脈管表達(dá)叢蛋白Dl，其表明叢蛋白Dl不僅與病理學(xué)的血管發(fā)生相關(guān)，而且與生理學(xué)的血管發(fā)生相關(guān)(未顯示)。在有些情況下，用CD68巨噬細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行共同免疫染色。這些染色揭示，巨噬細(xì)胞的亞群表達(dá)該蛋白(圖11)。皮膚中的成纖維細(xì)胞和一些增殖的腸上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)表達(dá)叢蛋白Dl(未顯示)。實(shí)施例9炎癥性疾病中巨噬細(xì)胞的染色為了更進(jìn)一步檢驗(yàn)叢蛋白Dl在患有顯著的巨噬細(xì)胞牽連的疾病中的牽連，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的蝕斑，多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。巨噬細(xì)胞表達(dá)叢蛋白Dl。實(shí)施例10叢蛋白Dl通過靜脈注射到達(dá)腫瘤脈管叢蛋白Dl蛋白在腫瘤血管中的表達(dá)，表明叢蛋白Dl通過靜脈注射是可到達(dá)的。為了測試這個(gè)，表達(dá)VEGF-Aw同工型的2xl()5個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Mel57細(xì)胞，顯微外科手術(shù)注射到BALB/C棵鼠的右側(cè)內(nèi)頸動(dòng)脈。18天以后，當(dāng)動(dòng)物顯示神經(jīng)病學(xué)癥狀時(shí)(Kusters等人，(2003)，上文)，10"克隆A12，F(xiàn)8的PLXND1結(jié)合噬菌體或不相關(guān)的噬菌體注射到棵鼠的尾部靜脈中，其帶有確定的Mel57-VEGF-A"s大腦轉(zhuǎn)移性病灶(A12的n-2,F8的n-4，對(duì)照噬菌體的n=3)。在兩組其它的小鼠中，我們靜脈內(nèi)注射30jngsdabF8或?qū)φ誷dab(每組的n-2)。5分鐘以后，小鼠使用異氟烷，麻醉，打開胸部，并用15ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，通過心臟灌注把未結(jié)合的噬菌體從系統(tǒng)洗滌掉。然后，通過頸部脫位處死小鼠，大腦，心臟，肺，肝臟，脾和腎的一部分在液氮中迅速冷凍。其他的部分固定于福爾馬林中進(jìn)行石蠟包埋。短暫的蘇木精染色以后，使用激光捕獲解剖顯微術(shù)(Leica激光解剖顯微鏡)，從10jam大腦切片解剖腫瘤。從腫瘤對(duì)側(cè)的，未受影響的大腦解剖相當(dāng)?shù)膮^(qū)域。接著，使用胰蛋白酶處理，從解剖的組織樣本洗脫噬菌體，并用于感染TG1細(xì)胞。對(duì)許多形成克隆的噬菌體計(jì)數(shù)，并用作肺瘤返回的測定。為了通過噬菌體或sdabs定性地確定腫瘤返回，4jam切片，與用于激光解剖的切片連續(xù)，用抗M13p8抗體(AbeamLimited,Cambridge,UK)染色以檢測結(jié)合的噬菌體，或抗VSV-G抗體(Sigma-Aldrich)染色以檢測單結(jié)構(gòu)域抗體。M13噬菌體的靜脈注射顯示，在帶有血管生成的黑素瘤病變的小鼠中，抗PLXND1單結(jié)構(gòu)域抗體F8，而不是攜帶不相關(guān)的單結(jié)構(gòu)域抗體的噬菌體，導(dǎo)致噬菌體在腫瘤脈管中的累積，而不是噬菌體在正常大腦脈管，或肝臟，脾，腎的血管中可檢測的特異性存在(圖12A，D，未顯示)。這表明叢蛋白Dl表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的腔側(cè)，具體地表達(dá)于胂瘤血管中，因此可用作可耙向的標(biāo)記。部分純化的單結(jié)構(gòu)域抗體的注射從而導(dǎo)致優(yōu)先的腫瘤局部化(圖12C)。在后者的情況中，人們認(rèn)為20kDa的小分子量的單結(jié)構(gòu)域抗體能從高滲透性的腫瘤脈管溢出，并在腫瘤間質(zhì)中累積。這種后面的作用是非特異性的，而且在不相關(guān)的單結(jié)構(gòu)域抗體中也觀察到。可以想象，小分子量和相對(duì)低親和性的抗體具有通過腫瘤的較高滲透性，并且更適于靶向腫瘤細(xì)胞間隔。實(shí)施例11F8在腫瘤血管中的累積用E98,神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植系經(jīng)頭蓋注射小鼠。E98腫瘤作為皮下腫瘤保持。殺死帶有皮下E98腫瘤的Balbc/cnu/nu無胸腺小鼠，并取出腫瘤。腫瘤用無菌的解剖刀切碎，而且勻漿通過無菌的70mdi目尼龍過濾器。20ja1得到的細(xì)胞懸浮液，包含150,000細(xì)胞，經(jīng)頭蓋注射到棵鼠的腦中。3周以后，M13噬菌體顯示單結(jié)構(gòu)域抗體F8被靜脈內(nèi)注射，5分鐘以后，小鼠用15ml磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行心臟灌注。殺死小鼠，取出大腦并固定在福爾馬林中。4jam切片用抗M13抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)，而且連續(xù)切片用抗CD34的抗體(內(nèi)皮標(biāo)記)和glut-l(—種用于之前原有的大腦內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記(Kusters，B等人，CancerRes62:341-345(2002))進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。帶有抗叢蛋白Dl單結(jié)構(gòu)域抗體的噬菌體在腫瘤締合的血管，而不是正常脈管中特異性累積(圖13)。重要地，噬菌體也在glut-l陽性的肺瘤血管中累積，因此其可以被認(rèn)為是之前原有的血管，而不是新形成的血管。這表明，不僅腫瘤中血管生成的血管，而且非血管生成的，但是活化的血管，也經(jīng)受了用抗叢蛋白Dl抗體進(jìn)行的乾向。實(shí)施例12叢蛋白Dl胞外域的重組體抑制血管形成人黑素瘤Mel57細(xì)胞用載體pIREShyg中的VEGF-A"5編碼序列轉(zhuǎn)染。通過在補(bǔ)加10%胎牛血清(FCS)和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，200ug/ml潮霉素中培養(yǎng)，來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因?yàn)槌泵顾乜剐曰虻谋磉_(dá)通過體內(nèi)的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)與VEGF-AcDM的表達(dá)相關(guān)，所有的潮霉素抗性細(xì)胞也將產(chǎn)生VEGF-A蛋白。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Mel57-VEGF細(xì)胞，接著用pIRESneo-叢蛋白DlED轉(zhuǎn)染。該矢量包含編碼從第1-2745位核苷酸的胞外域的cDNA，其通過IRES與新霉素抗性基因的表達(dá)相關(guān)。雙重轉(zhuǎn)染子被注射到棵鼠的右側(cè)頸動(dòng)脈，并允許腫瘤發(fā)育。在神經(jīng)病學(xué)癥狀發(fā)病時(shí)(大約18天)，對(duì)小鼠進(jìn)行釓-DTPA增強(qiáng)的核磁共振成象。隨后，處死小鼠，把大腦固定于福爾馬林中，并經(jīng)受免疫組織化學(xué)染色以檢測腫瘤脈管系統(tǒng)。當(dāng)與對(duì)照進(jìn)行比較時(shí)，其包括只表達(dá)VEGF-A的腫瘤，Tl-重量的核磁共振成象(MRI)中Gd-DTPA的增強(qiáng)較少(比較圖14A與14B,圖14A代表Mel57-VEGF-A165腫瘤的2個(gè)實(shí)例，圖l化代表Mel57-VEGF-A^/叢蛋白D1-ED腫瘤的2個(gè)實(shí)例)。在表達(dá)VEGF-A165和叢蛋白Dl胞外域的腫瘤中，脈管系統(tǒng)顯示內(nèi)皮標(biāo)記CD34(—種由VEGF-A^內(nèi)皮活化的標(biāo)志)的上調(diào)。在只表達(dá)VEGF-A165的腫瘤中，脈管系統(tǒng)是腦內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記g1Ut-1陰性的，其與這脈管是新產(chǎn)生的并因此缺乏大腦-內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的事實(shí)是一致的。如圖12B中可以觀察到的，脈管與也表達(dá)叢蛋白Dl胞外域，表達(dá)glut-l的腫瘤相關(guān)。這是這些脈管實(shí)際上是之前原有的的強(qiáng)烈指示。因此，叢蛋白Dl胞外域不能通過VEGF-A^防止內(nèi)皮細(xì)胞的活化，但是它阻止了新脈管系統(tǒng)的形成。實(shí)施例13抗叢蛋白Dl的高親和性抗體使用表達(dá)載體pQE16(Qiagen),在大腸桿菌M15pREP4細(xì)胞中，表達(dá)相當(dāng)于第47-506位氨基酸的蛋白序列(成熟蛋白質(zhì)的459個(gè)最氨基末端的氨基酸)。重組蛋白質(zhì)，其在細(xì)菌細(xì)胞中作為包涵體產(chǎn)生，溶于變性緩沖液中，其含有4M尿素和lmM二硫蘇糖醇(DTT)，然后用PBS逐步透析。該蛋白用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，免疫BALBc/c小鼠25。圖15顯示了小鼠血清的特征。如圖15B所示，小鼠免疫血清特異性識(shí)別大腸桿菌重組蛋白47-506(52kDa，第1泳道)，和18kDa的第二個(gè)重組體叢蛋白Dl序列，其包括第225-388位氨基酸(因此完全存在于用于免疫的序列內(nèi)部，第2泳道)。免疫之前的血清不顯示這種反應(yīng)性(圖A)。當(dāng)在對(duì)肺泡的軟組織肉瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶的免疫組織化學(xué)染色中進(jìn)行檢測時(shí)，小鼠免疫血清(圖D)，而不是免疫之前的血清(圖C)，顯示對(duì)血管和腫瘤細(xì)胞陽性，染色模式與單結(jié)構(gòu)域抗體A12的染色模式類似。因此，這種小鼠的B-淋巴細(xì)胞認(rèn)為適于用骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0產(chǎn)生脾B-淋巴細(xì)胞的雜交瘤?；贓LISA中對(duì)蛋白47-506的反應(yīng)性，從這些雜交瘤中選擇許多抗體生產(chǎn)細(xì)胞系，并分析它們在人腫瘤的冷凍切片中檢測叢蛋白Dl的可能性。這些抗體中，11F5H6和17E9C12，IgM亞型的兩個(gè)抗體，在肉瘤和黑素瘤的大腦轉(zhuǎn)移性病灶中顯示強(qiáng)陽性，如圖16中舉例說明的。圖C-F中的插圖表示對(duì)照染色，其中不包括第一抗體。圖A和B表明，這些抗體不能特別地識(shí)別正常腦組織中的脈管結(jié)構(gòu)。實(shí)施例14單克隆抗體11F5H6能識(shí)別腫瘤血管為了更進(jìn)一步地評(píng)價(jià)單克隆抗體11F5H6是否能識(shí)別腫瘤血管，血管生成Mel57-VEGF-A腫瘤生長在棵鼠的大腦中，基本上如實(shí)施例10中所述?？贵w11F5H6(1mg)注射到外側(cè)尾部靜脈中，并循環(huán)15分鐘。這個(gè)階段以后，小鼠用1.3%異氟烷麻醉，并打開胸部，接著用20ml磷酸鹽緩沖鹽水進(jìn)行心臟灌注。該步驟之后，處死小鼠，并取出大腦，急速冷凍或固定于福爾馬林中。4jum冷凍的切片用抗IgM抗體染色。圖17A中，表明抗體11F5H6返回到腫瘤脈管而不是正常脈管中，并在其中累積(比較圖17A中的抗-IgM染色與圖17B中的抗內(nèi)皮CD31染色)。當(dāng)對(duì)未注射的小鼠進(jìn)行抗IgM染色時(shí)，觀察不到這種染色。因此，11F5H6是一種允許腫瘤靼向的有希望的抗體。實(shí)施例15叢蛋白Dl在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，叢蛋白Dl在巨噬細(xì)胞中表達(dá)(圖18)。人動(dòng)脈粥樣硬化的蝕斑中巨噬細(xì)胞的亞型也表達(dá)叢蛋白Dl(圖19)。用單結(jié)構(gòu)域抗體A12進(jìn)行染色。圖19中，進(jìn)行雙重染色，其顯示叢蛋白Dl呈紅色，巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD68呈藍(lán)色。紫色表明共表達(dá)。序列A12卿IDNO:1):ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCAGTATCAGTATCAATAACTGGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGAAAACAGCGCGAGCGGGTCGCAGCTATATCTGGTGGTGGTAAAACAGTCTATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACGGCCGTCTATTACTGTAGAGCAGTCCGGAAAAGTACGGGTTGGCTTAGGGGGCTTGACGTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCATCACCATCATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAGMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSSISIGWYRQAPGKQRERVAAISGGGKTVYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCRAVRKSTGWLRGLDVWGQGTQVTVSAEPKTPKPQPAAAHHHHHHYTDIEMNRLGKGAAF8IDNO:2):ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGAGACGTAGCACAAGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACGCGGTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAAACCTGATGACACGGCCGTCTATTACCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCATCACCATCATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAGMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTFSTLIMAWFRQAPGKEREFVAAISRGGGSTSYADSVKGRFTIS麗SKMVYLQMNSLKPDDTAVYYCNARYGSRIYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQPAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLGKGAA扭序列單鏈抗體，來源于抗體11F5H6(SEQIDNO:3)TDI麗RLGKGAA序列單鏈抗體，來源于抗體17E9C12(SEQIDNO:4)GAA<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權(quán)利要求1.用作涉及叢蛋白D1的表達(dá)的病癥的治療或診斷中的可靶向蛋白的叢蛋白D1。2.如權(quán)利要求l要求的叢蛋白Dl，其中診斷通過檢測體內(nèi)或身體組織或體液中叢蛋白Dl的存在而實(shí)現(xiàn)。3.如權(quán)利要求l要求的叢蛋白Dl，其中治療通過靶向叢蛋白Dl用于傳遞治療劑到需要治療的位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)。4.如權(quán)利要求l要求的叢蛋白Dl，其中治療通過干擾叢蛋白Dl與它的配體的相互作用而實(shí)現(xiàn)。5.如權(quán)利要求l要求的叢蛋白Dl，其中治療通過干擾叢蛋白Dl的功能而實(shí)現(xiàn)。6.如權(quán)利要求l要求的叢蛋白Dl，其中治療通過干擾編碼叢蛋白Dl的基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。7.結(jié)合叢蛋白Dl，編碼叢蛋白Dl的核酸或叢蛋白Dl的配體的分子用于制備治療或診斷涉及叢蛋白Dl的表達(dá)的病癥的治療組合物的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7要求的應(yīng)用，其中所述病癥包括其中叢蛋白Dl在腫瘤細(xì)胞，胂瘤血管或活化巨噬細(xì)胞上表達(dá)的病癥。9.如權(quán)利要求7或8要求的應(yīng)用，其中所迷病癥選自腦腫瘤，特別是星形細(xì)胞瘤，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤與成血管細(xì)胞瘤，結(jié)腸癌，特別是結(jié)腸導(dǎo)管癌，前列腺癌，腎細(xì)胞癌，特別是腎透明細(xì)胞癌，乳房癌，特別是乳腺導(dǎo)管癌，卵巢癌，鱗狀細(xì)胞癌，黑素瘤，肺癌，特別是小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，軟組織肉瘤。10.如權(quán)利要求7或8要求的應(yīng)用，其中所述病癥是炎性疾病。11.如權(quán)利要求IO要求的應(yīng)用，其中所述炎性疾病是自身免疫病。12.如權(quán)利要求11要求的應(yīng)用，其中所述自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。13.如權(quán)利要求IO要求的應(yīng)用，其中所述炎性疾病是動(dòng)脈粥樣硬化或多發(fā)性硬化。14.如權(quán)利要求7要求的應(yīng)用，其中結(jié)合叢蛋白Dl的分子選自抗體，抗體片段，蛋白功能域，肽，小分子，DNA或RNA適體。15.如權(quán)利要求7要求的應(yīng)用，其中結(jié)合編碼叢蛋白Dl的核酸的分子選自siRNA，反義RNA，反義磷酸硫代寡核苷酸。16.如權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中結(jié)合叢蛋白Dl配體的分子選自抗配體的抗體，叢蛋白Dl的可溶性胞外域，具有對(duì)叢蛋白Dl結(jié)合位點(diǎn)的親和性的肽。17.如權(quán)利要求7-16中任一項(xiàng)要求的應(yīng)用，其中所述結(jié)合分子用可檢測4示i己進(jìn)4亍4示^己。18.如權(quán)利要求12要求的應(yīng)用，其中所述可檢測標(biāo)記選自放射性標(biāo)記，順磁性標(biāo)記，熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。19.如權(quán)利要求7-18中任一項(xiàng)要求的應(yīng)用，其中所述結(jié)合分子帶有效應(yīng)化合物或包括效應(yīng)化合物的納米裝置。20.如權(quán)利要求19要求的應(yīng)用，其中所述效應(yīng)化合物是毒素，血栓形成誘導(dǎo)化合物，化療劑，放射性部分，細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)肽，特別是(KLAKLAK)2。21.如權(quán)利要求20要求的應(yīng)用，其中所述毒素?fù)p傷或殺死內(nèi)皮細(xì)胞以誘導(dǎo)血栓形成，而且特別是篦麻毒素。22.如權(quán)利要求20要求的應(yīng)用，其中所述血栓形成誘導(dǎo)化合物是截短的組織因子。23.如權(quán)利要求20要求的應(yīng)用，其中所述化療劑選自阿霉素，順氯氨鉑，博來霉素硫酸鹽，亞硝脲氮芥，苯丁酸氮芥和環(huán)磷酰胺羥基脲。24.如權(quán)利要求20要求的應(yīng)用，其中所述放射性實(shí)體選自锝99m，多典-123，多典-131，錸-186或-188，鎵-67，釔-90，镥—177。25.如權(quán)利要求19要求的應(yīng)用，其中所述納米裝置是脂質(zhì)體，聚合體，特別是由嵌段共聚物組成的聚合體。26.叢蛋白Dl結(jié)合分子。27.<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>28.如權(quán)利要求26要求的叢蛋白Dl結(jié)合分子，包含A12(SEQIDN0:1)，F(xiàn)8(SEQIDN0:2)，11F5H6(SEQIDN0:3)或17E9C12(SEQIDNO:4)的叢蛋白Dl結(jié)合部分。29.如權(quán)利要求26或27要求的叢蛋白結(jié)合分子，與如權(quán)利要求18要求的可檢測標(biāo)記偶聯(lián)。30.如權(quán)利要求26或27要求的叢蛋白結(jié)合分子，與效應(yīng)分子或包括效應(yīng)化合物的納米裝置偶聯(lián)，其中效應(yīng)化合物如權(quán)利要求20-24中任一項(xiàng)所限定。31.如權(quán)利限定26或27限定的叢蛋白結(jié)合分子，其中所述納米裝置如權(quán)利要求25中所限定。32.包含如權(quán)利要求29要求的叢蛋白結(jié)合分子的診斷組合物。33.包含如權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)要求的叢蛋白結(jié)合分子的治療組合物。34.單鏈抗體A12(SEQIDNO:1)。35.單鏈抗體F8(SEQIDNO:2)。36.單鏈抗體11F5H6(SEQIDNO:3)。37.單鏈抗體17E9C12(SEQIDNO:4)。38.鑒定能與叢蛋白Dl結(jié)合的分子的方法，該方法包括使許多分子的集合與叢蛋白Dl接觸，并從該集合選擇顯示與叢蛋白Dl結(jié)合的分子作為叢蛋白Dl結(jié)合分子。全文摘要本發(fā)明涉及用作涉及叢蛋白D1的表達(dá)的病癥的治療或診斷中的可靶向蛋白的叢蛋白D1。診斷合適地通過檢測體內(nèi)或身體組織或體液中叢蛋白D1的存在而實(shí)現(xiàn)，但是治療通過將用于傳遞治療劑的叢蛋白D1靶向到需要治療的部位而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明更進(jìn)一步涉及結(jié)合叢蛋白D1，編碼叢蛋白D1的核酸或叢蛋白D1的配體的分子用于制備治療或診斷涉及叢蛋白D1的表達(dá)的病癥的治療組合物的應(yīng)用。病癥包括其中叢蛋白D1在腫瘤細(xì)胞，腫瘤血管或活化巨噬細(xì)胞上表達(dá)的病癥。文檔編號(hào)G01N33/53GK101287758SQ200680030391公開日2008年10月15日申請日期2006年7月20日優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日發(fā)明者I·羅迪恩克,J·M·H·拉茨,W·P·J·林德斯申請人:天主教大學(xué)基金會(huì)