專利名稱：：微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒及其制備、使用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及到陽性單克隆抗體的篩選方法的改進，具體的講就是微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒及其制備、使用方法，其屬于免疫學檢測
技術領域：
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背景技術：
：1975年Koohler和Milstein創(chuàng)造/雜交瘤技術，經過小斷提高，單克隆抗體已經應用于生物學各個領域。主要(1)在食品檢測上的應用，具有高度的準確性和敏感性。(2)應用單克隆抗體對病原體進行分型和對抗原結構進行精細研究。(3)用于抗原物質的純化。(4)在腫瘤方面，研究腫瘤特異性抗原；使用單克隆抗體聯(lián)接抗腫瘤藥，使它尤如導彈一樣能準確捕獲腫瘤細胞并將其殺死。(5)基礎學科上已廣泛用于病理、免疫、遺傳等學科的研究。(6)在繁殖內分泌學上的應用，促進了生殖生理的發(fā)展。(7)在醫(yī)學界，獸醫(yī)界，用于診斷與治療等。由于單克隆抗體的廣泛應用，單克隆體制備就越顯重要，其制備方法也不斷改進與探索，但目前仍以常規(guī)方法制備單克隆抗體，常規(guī)單克隆抗體制備過程是免疫原的制備，免疫Balb/C小白鼠，進行細胞融合，篩選陽性細胞株，克隆這樣幾個主要步驟。在制備單克隆抗體中，最難的是選用何種方法來篩選陽性細胞株，因篩選工作量較大，因而快速，簡單，準確的篩選方法是科學家們一直探索和追求的。目前常采用的篩選方法主要是間接EL工SA檢測，間接免疫熒光檢測。制備單克隆抗體的常規(guī)抗原主要有三種來源(1)微生物抗原，主要包括各種病原體，如真菌，細菌，病毒等，此類微生物制備的單抗主要用丁診斷和治療以及微生物精細形態(tài)的研究，此類抗原的來源多從生病的人類、家畜、水產養(yǎng)殖動物等體內提取，或是體外培養(yǎng)分離而來，在分離提純抗原時，很難將抗原提的很純，或多或少含有一定的組織抗原或是培養(yǎng)基抗原(以下將這些抗原統(tǒng)稱為基質抗原)，用ELISA篩選則必須加一基質抗原對照，通過對比篩選出陽性細胞株。來源96孔細胞培養(yǎng)板上同一孔中的抗體，需在酶標板上分入兩孔進行檢測，一是抗原，二是基質抗原，通過OD值得測量和計算比較才能得到結果，較為繁瑣，達不到直觀，簡便，快速的篩選。另外，來源96細胞培養(yǎng)板上同一孔中的抗體約50-100叱，量較少，再分入兩孔進行檢測，其量更少則使檢測的靈敏度，精確度降低。用間接免疫熒光檢測篩選，一是必須有含一定量的抗原的病理組織，二是工作量較大，每次可能需要制備并檢測卜.百張免疫熒光片子。(2)半抗原，在免疫原制備中需加載體，其載體就相當于基質抗原，在ELISA篩選中也存在以上同樣問題。間接免疫熒光檢測一般不用于此類單抗的篩選。(3)組織抗原，此類抗原提純中，也有基質抗原存在，因而，用ELISA篩選也存在以上同樣問題，此類單抗主要用間接熒光篩選。因此，目前，在單克隆抗篩選中，迫切需要一種直觀，快速，簡便，高通量準確的篩選方法，并能用于任何一種抗原產生的單克隆抗體的篩選
發(fā)明內容本發(fā)明是針對在單克隆抗篩選中，迫切需要一種直觀，快速，簡便，高通量準確的篩選方法，并能用于任何一種抗原產生的單克隆抗休的笳選而設計發(fā)明的，以達到直觀，快速，簡便，高通量準確的篩選陽性單克隆抗體的目的。本發(fā)明以現(xiàn)有的球術的實際特點，由于其一，現(xiàn)用于陽性單克隆抗體篩選方法的繁瑣，復雜，不直觀，如ELISA篩選，抗體不能在同一孔中分別與抗原和基質抗原結合來篩選陽性抗體，必需分孔檢測，造成用于篩選的抗體量更少，使其檢測精確度降低；再是每一實驗孔檢測結果都耍與其相應基質抗原對照孔檢測結果計算比較，因而較繁瑣，不直觀。其二，間接熒光篩選，雖精確，直觀，但不一定有合適的病理組織用于篩選，再是工作量大。而且以上無論是ELISA還是間接熒光篩選，每種方法檢測時間至少需要2-3h，并且需要一定的設備與儀器。因而，目前在單克隆抗篩選中，迫切需要一種直觀，快速，簡便，高通量準確的篩選方法，并能用于任何一種抗原產生的單克隆抗體的篩選。因此，本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測方法存在的問題，利用免疫金滲濾原理，提供了一種微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒及其制備、使用方法，達到了直觀，快速，簡便，高通量準確的篩選的目的，并可用于任何一種抗原產生的單克隆抗體的篩選和克隆。本發(fā)明是由以下技術方案實現(xiàn)的，研制一種微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其包括微孔蓋板，微矩陣點樣板，硅膠板，硝酸纖維素膜，吸水層，底板，微量點樣筆，A液含牛血清白蛋白吐溫-磷酸鹽緩沖液，B液膠體金標記的抗鼠IgG，C液吐溫-磷酸鹽緩沖液。所述微孔蓋板為96孔，上下貫通，其排列方式以及孔的標識同96孔培養(yǎng)板，孔的底面積為25-55mm、板的厚度為4-8mm，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖。所述微矩陣點樣板為192孔，上下貫通，孔的底面積為3-4mm2，其上每兩孔為一組，該組孔的位置應位于微孔蓋板上的其對應的微孔中，板的厚度為l-4mm，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖。所述的底板，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖，厚度為10-25mm。所述微孔蓋板，微矩陣點樣板和底板的四角上均留有固定硝酸纖維素膜或吸水層的針(釘)？L。通過此孔用針(釘)固定硝酸纖維素膜和吸水層，使其在更換微孔蓋板和微矩陣點樣板時，保持位置不變。所述的硅膠板共2塊，其形狀分別微孔蓋板，微矩陣點樣板相同，并分別與以上各板配套使用，將其放置在硝酸纖維素膜與以上各板之間，防止蓋板和微矩陣點樣板孔內液體向孔的四周滲漏的作用。如無滲漏可以不用。所述的硝酸纖維素膜，其膜孔徑為0.2-0.8um。所述的吸水層為高分子吸水材料，厚度為5-10mm。所述的微量點樣筆，是毛細玻璃管或是毛細塑料管。所述的A液含牛血清白蛋白吐溫-磷酸鹽緩沖液，B液膠體金標記的抗鼠IgG，C液吐溫-磷酸鹽緩沖液，均用公知的方法制備。本發(fā)明的微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒的使用方法，所述該使用方法的步驟如下(1)抗原的包被底板上放置吸水層，其上是硝酸纖維膜，再放置上微矩陣點樣板(可在硝酸纖維膜和微矩陣點樣板之間加硅膠板)，并將以上幾層上下固定起來，用微量點樣筆通過微矩陣點樣板上的孔分別將樣品點于硝酸纖維膜上，每組孔分別點抗原樣和對照樣(為基質抗原)，晾干。將微矩陣點樣板取下，換上微孔蓋板(可在硝酸纖維膜和微孔蓋板之間加硅膠板)，按上述方式固定。(2)經微孔蓋板上的微孔加入A液，滲入。(3)再加入被篩選的單克隆抗體液，滲入。(4)再加入B液，滲入。(5)再加入C液，滲入。(6)結果判定①每一組中抗原樣處出現(xiàn)紅色斑點，對照樣處無紅色斑點，表示此被篩選的抗體為陽性抗體，產生此抗體的細胞株則為篩選中首選的可進行克隆的細胞株。②每一組中抗原樣處出現(xiàn)紅色斑點，對照樣處也出現(xiàn)紅色斑點，可根據斑點的顏色強弱來判斷(注顏色強于>;顏色弱于<;顏色相同二)i抗原樣處紅色斑點>對照樣處紅色斑點，可篩選出繼續(xù)克隆。i丄抗原樣處紅色斑點=對照樣處紅色斑點，可篩選出，如果以上步驟篩選出的陽性細胞株較少，可考慮繼續(xù)克隆，反之，棄之。iii抗原樣處紅色斑點<對照樣處紅色斑點，一般棄之。③每一組結果中抗原樣處無紅色斑點，對照樣處無紅色斑點，棄之。本發(fā)明主要優(yōu)點(1)同步篩選本發(fā)明的微矩陣點樣板，其特點是此板上的孔是成對的，可分別點抗原與基質抗原兩個樣于硝酸纖維膜上，此成對樣點的位置恰好位于微孔蓋板h對應的微孔中，因而可對細胞培養(yǎng)板上同一培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液進行篩選。同孔同步檢測篩選出是抗抗原還是基質抗原的抗體。(2)成對點樣，結果直觀利用微矩陣點樣板成對樣點即抗原與基質抗原兩個樣，用這一成對樣同孔同步篩選陽性抗體，結果直觀，易判斷。(3)檢測快速本發(fā)明利用免疫金滲濾原理達到快速檢測目的，整個檢測過程不超過30分鐘。(4)高通量一次可篩選96個樣品，并且微孔蓋板上的孔與96孔培養(yǎng)板上標識一致，可用于對96孔培養(yǎng)板上的對應孔的抗體進行篩選。(5)操作簡單不需其他任何儀器設備，可適用于任何一個制備單克隆抗體的實驗室與企業(yè)。(6)應用性強可用于任何一種抗原產生的單克隆抗體的篩選和克隆。附圖l:為微孔蓋板俯視圖附圖2:為微矩陣點樣板俯視圖附圖3:為底板前視立體圖附圖4:整個試劑盒組裝圖附圖4中Al為微孔蓋板；。2為微矩陣點樣板；=i>3為硝酸纖維素膜；。4為吸水層；A5為底板；本發(fā)明的實施例結合附圖進一步描述如下具體實施方式實施例1.所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒具體使用方法如下(1)將微矩陣點樣板，硝酸纖維素膜，吸水層，底板按附圖4上下順序組裝，以上幾層用鏍絲或彈簧扣上下固定；(2)包被抗原用微量點樣筆將抗原通過微矩陣點樣板.匕的孔點在硝酸纖維膜上，每組孔點一抗原樣，點一對照樣(為基質抗原)，晾干。將微矩陣點樣板取下，換上微孔蓋板，按上述方法上下固定；(3)經微孔蓋板上的微孔加入含W。牛血清A蛋A、0.05。/。吐溫-0.01M磷酸鹽緩沖液100lil，滲入；(4)加入被篩選的單克隆抗體液50-100ul，滲入；(5)加膠體金標記的羊(兔)抗鼠IgG100ul，滲入；(6)加入O.05%吐溫-0.OlM磷酸鹽緩沖液lOOy1，滲入。(7)篩選結果判斷，所述篩選結果判斷方法見實施例2注以上實施過程中，如果微孔板或微矩陣點樣板孔內液體向孔的四周滲漏時，將與其配套的硅膠板加在硝酸纖維膜與以上各板之間，以防滲漏。實施例2.如實施例1所述篩選結果判斷方法，由以下現(xiàn)象與原理實現(xiàn)的(1)每一組結果中抗原樣處出現(xiàn)紅色斑點，對照樣處無紅色斑點，此結果說明此被篩選的抗體中只有抗抗原的抗體，無抗基質抗原的抗體，因而其為陽性抗體，產生此抗體的細胞株為首選，可繼續(xù)克隆。(2)每一組結果中抗原樣處出現(xiàn)紅色斑點，對照樣處也出現(xiàn)紅色斑點，此結果說明產牛此抗體的細胞株中既有抗抗原的，也有抗基質抗原的細胞株。以何種細胞株為主，則可根據斑點的顏色強弱來判斷i抗原樣處紅色斑點>對照樣處紅色斑點，此結果說明產生此抗體的細胞株以抗抗原的細胞株為主，可篩選出繼續(xù)克隆。ii抗原樣處紅色斑點=對照樣處紅色斑點，此結果說明產牛此抗體的細胞株既有抗抗原的，也有抗基質抗原細胞株，或是以抗基質抗原細胞株為主。如果以上步驟篩選的陽性細胞株較少，可篩選出，考慮繼續(xù)克隆，反之，棄之。iii抗原樣處紅色斑點<對照樣處紅色斑點，此結果說明產生此抗體以抗基質抗原細胞株為主，或是只有抗基質抗原細胞株，一般棄之。(3)每一組結果中抗原樣處無紅色斑點，對照樣處無紅色斑點，此結果說明既無抗抗原的抗體也無抗基質的抗體，棄之。實施例3.微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒篩選結果與間接免疫熒光檢測法篩選結果比較。共取30孔雜交瘤(抗蝦白斑病毒)細胞培養(yǎng)液，用微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒檢測結果見表1，用間接免疫熒光檢測感染蝦白斑病毒的蝦鰓結果見表2:表1試劑盒檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1可見抗體現(xiàn)較強陽性，并可繼續(xù)克隆的共9孔；從表2可見抗體現(xiàn)較強陽性，并可繼續(xù)克隆的共9孔；并且，兩組孔號均是對應的。相符率100%。其余21孔只有1孔結果不同，相符率達95%以上。結論微矩陣快速篩選陽性爭克隆抗體試劑盒在篩選陽性單克隆抗體中其精確度同間接免疫熒光檢測篩選法。權利要求1、微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒包括微孔蓋板，微矩陣點樣板，硅膠板，硝酸纖維素膜，吸水層，底板，微量點樣筆，A液含牛血清白蛋白吐溫-磷酸鹽緩沖液，B液膠體金標記的羊(兔)抗鼠IgG，C液吐溫-磷酸鹽緩沖液。2、如權利要求1所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗休試劑盒，其特征為所述微孔蓋板為96孔，上下貫通，其排列方式以及孔的標識同96孔培養(yǎng)板，孔的底面積為25-55咖2，板的厚度為4-8鵬，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖。3、如權利要求l所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述微矩陣點樣板為192孔，上下貫通，孔的底面積為3-5mm2，其上每兩孔為一組，該組孔的位置應位于權利要求2所述微孔蓋板上的其對應的微孔中。板的厚度為l-4mm，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖。4、如權利要求1所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述的底板，其材質為亞克力，或是塑料，或是化纖，厚度為10-25mm。5、如權利要求1所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述微孔蓋板，微矩陣點樣板，底板各板的四角上均留冇固定硝酸纖維素膜和吸水層的針(釘)孔。通過此孔用針(釘)固定硝酸纖維素膜和吸水層，使其在更換微孔蓋板和微矩陣點樣板時，保持位置不變。6、如權利要求l所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述的硅膠板共2塊，其形狀分別與微孔蓋板，微矩陣點樣板相同，并分別與以上各板配套使用，將其放置在硝酸纖維素膜與以上各板之間，防止板孔內液體向孔的四周滲漏的作用。7、如權利要求l所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述硝酸纖維素膜其膜孔徑為0.2-0.8um。8、如權利要求1所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述吸水層為高分子吸水材料，厚度為5-10mm。9、如權利要求l所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述微量點樣筆是毛細管?？梢允遣ＡЩ蚴撬芰厦毠?。10、如權利要求1所述微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒，其特征為所述微孔蓋板，微矩陣點樣板，硅膠板，硝酸纖維素膜，吸水層，底板的組裝可用彈簧夾子，或是彈簧扣子，或是螺絲固定。全文摘要本發(fā)明提供一種微矩陣快速篩選陽性單克隆抗體試劑盒及其制備、使用方法，涉及免疫檢測
技術領域：
。該試劑盒包括微孔蓋板，微矩陣點樣板，硅膠板，硝酸纖維素膜，吸水層，底板，微量點樣筆，A液含牛血清白蛋白-吐溫-磷酸鹽緩沖液，B液膠體金標記的羊(兔)抗鼠IgG，C液吐溫-磷酸鹽緩沖液。該試劑盒使用方法是利用免疫金滲濾原理對微孔中硝酸纖維素膜上包被的抗原-單抗-金標羊(兔)抗鼠IgG復合物進行檢測。該試劑盒特點是高通量檢測樣本，每一微孔中可通過微矩陣點樣板包被一陽性抗原和一對照抗原，同時對其進行檢測比較，使單克隆抗體的篩選工作直觀快速，簡便高效，可用于任何一種抗原產生的單克隆抗體的篩選和克隆。文檔編號G01N33/577GK101275949SQ200810015070公開日2008年10月1日申請日期2008年4月2日優(yōu)先權日2008年4月2日發(fā)明者王曉潔申請人:魯東大學