本發(fā)明涉及生物化學(xué)、檢測試劑領(lǐng)域，具體涉及的是一種采用硫酸銨沉淀、疏水層析兩步法從新鮮豬心中快速提取獲得高純度肌紅蛋白，通過噴霧干燥技術(shù)制成干粉，并將其應(yīng)用于制備人總抗氧化狀態(tài)(TAS)試劑盒，檢測人總抗氧化狀態(tài)的技術(shù)；具體的為一種豬心中提取肌紅蛋白的方法及含有其的人總抗氧化狀態(tài)試劑盒。
背景技術(shù)：
：活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)主要包括羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫。在機體的正常生理代謝過程中會產(chǎn)生活性氧，同時一些環(huán)境因子例如紫外照射、吸煙、污染等也會誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。自由基會引起DNA損傷從而導(dǎo)致突變，還能使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)進而影響細胞正常功能，同時自由基作為代謝中間產(chǎn)物，其強反應(yīng)能力可使細胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，參與早老性癡呆、帕金森病等諸多疾病的病理過程。目前研究人機體抗氧化能力主要通過分析機體某種特定抗氧化成分和(或)自由基代謝產(chǎn)物的變化，如脂質(zhì)過氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸、維生素E等。而這種通過體外檢測某組分中單一的抗氧化成分變化的方式并不能準確反映機體抗氧化水平?？偪寡趸癄顟B(tài)(TotalAntioxidantStatus,TAS)反映機體維持氧化-抗氧化狀態(tài)平衡的能力。文獻報道表明，機體的總抗氧化狀態(tài)與糖尿病、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝損傷、早老性癡呆、癌癥等多種疾病有著密切的關(guān)系，因此測定機體血漿、血清、尿液等成分中總的抗氧化物質(zhì)濃度，具有非常重要的生物學(xué)和臨床意義，有利于更全面地評估機體抗氧化狀態(tài)，掌握機體的防御能力，為實施抗氧化輔助治療提供依據(jù)，以期有效地預(yù)防疾病和控制相關(guān)疾病的惡化。肌紅蛋白(Myoglobin，MB)由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成的結(jié)合蛋白，是肌肉內(nèi)儲存氧的蛋白質(zhì)。MB特有的結(jié)構(gòu)使得其非常有利于氧的儲存和運輸，但正是這種富氧狀態(tài)使其極易受到自由基的攻擊，被氧化。氧化狀態(tài)的MB可以通過偶聯(lián)催化ABTS形成激活態(tài)ABTS，即ABTS+，ABTS+呈藍色，在600nm處有吸收峰，而體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)能夠抑制該反應(yīng)的產(chǎn)生，通過其抑制的大小判斷機體的抗氧化能力。肌紅蛋白的輔基為血紅素，其由四個吡咯類亞基組成一個環(huán)，環(huán)中心為一個亞鐵離子，該物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性和復(fù)雜性使得目前通過基因工程方式表達獲得的重組肌紅蛋白存在產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差等問題，限制了其在TAS試劑盒中的應(yīng)用。目前有文獻報道，可采用兩次柱層析法對豬心肌、沙丁魚肌肉等動物組織中的肌紅蛋白進行提取，但該方法繁瑣，提取效率不高；也有報道稱從野牛心肌、馬屬動物心肌中提取的肌紅蛋白穩(wěn)定性好，但缺點是原材料難以獲得、成本高，無法滿足試劑盒的批量生產(chǎn)需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對上述不足，提出了一種豬心中提取肌紅蛋白的方法，該方法產(chǎn)量高，提取成本低，獲得的肌紅蛋白具有良好的穩(wěn)定性，能應(yīng)用到TAS試劑盒中，以檢測機體血清、尿液等成分中總的抗氧化物質(zhì)濃度，同時原材料來源豐富，容易獲得，可滿足試劑盒的批量生產(chǎn)需求。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種豬心中提取肌紅蛋白的方法，主要步驟包括：1)將新鮮豬心去除脂肪和結(jié)締組織之后，加入破碎緩沖液，用組織勻漿機快速勻漿，并用高速冷凍離心機離心，去除沉淀，獲得粗提液；2)粗提液中加入硫酸銨，攪拌，室溫下沉淀0.5-1.5h后，用高速冷凍離心機離心，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨至飽和狀態(tài)，室溫下沉淀2h以上，并用高速冷凍離心機離心，棄去上清，獲得沉淀；4)沉淀用含硫酸銨的緩沖液復(fù)溶至原體積(此處的原體積為：步驟(1)中破碎緩沖液的體積)，過濾待上樣；5)疏水填料裝柱后，用含硫酸銨的緩沖液平衡，平衡結(jié)束后上樣，上樣完畢后，繼續(xù)平衡至無蛋白流出，然后用含有硫酸銨的緩沖液洗脫，根據(jù)洗脫峰收集目的蛋白；6)收集得到的目的蛋白通過SDS-PAGE檢測純度后，加入保護劑通過噴霧干燥技術(shù)制備干粉。本發(fā)明主要采用硫酸銨沉淀和疏水層析方法提取肌紅蛋白，硫酸銨沉淀具有適應(yīng)性廣、對蛋白無損傷、原料成本低等優(yōu)點；同樣疏水層析是一步純化，快速分離，具有處理時間短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，將二者結(jié)合使用，可快速、簡單地從豬心中提取獲得高純度的肌紅蛋白。通過上述純化方法，獲得的高純度肌紅蛋白，對其進行產(chǎn)量、純度等分析顯示：1000g豬心可以提取獲得2g天然肌紅蛋白，回收率50％以上，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，所提取的肌紅蛋白純度可達95％以上。該方法具有原材料易得、成本低、方法簡單、無需復(fù)雜設(shè)備、經(jīng)濟實惠、提取得率高等優(yōu)點，可實現(xiàn)批量生產(chǎn)。上述所用緩沖液為磷酸緩沖液、Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液、MOP(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)緩沖液、硼酸鹽緩沖液中的一種或幾種，使用濃度為1mM～1000mM，且pH范圍在6～9.5之間。其中各個步驟中所使用的緩沖液可以不一致，但為了操作簡易一般整個過程使用同種緩沖液；上述所用硫酸銨質(zhì)量濃度為：1)粗提液中為40-60％，此步驟通過鹽析作用，讓疏水性強的蛋白質(zhì)形成沉淀，離心加以去除；2)復(fù)溶沉淀、平衡緩沖液中為30-40％，在此濃度條件下，肌紅蛋白具有一定的疏水性，可以和疏水填料結(jié)合；3)洗脫緩沖液為15-25％，在此濃度條件下，肌紅蛋白疏水性減弱，可與疏水填料解離，從而被洗脫下來。上述所用疏水填料為苯基、丁基、辛基、異丙基中的一種。為市售產(chǎn)品，比如西安恒成生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品編號為13-0132-(01～06)的苯基類的疏水填料，產(chǎn)品編號為13-0132-(01～06)的13-0231-(01～06)的丁基類的疏水填料等等。上述噴霧干燥所用保護劑為海藻糖、玉米糊精、玉米淀粉、阿拉伯樹膠中的一種或幾種，以目的蛋白收集液的體積計算，保護劑使用的質(zhì)量濃度為0.1％～10％，保護劑的加入可保護肌紅蛋白在噴霧干燥高溫處理過程中不發(fā)生變性、聚集、沉淀，同時能有效增大噴霧干燥受熱面積，有利于噴霧干粉的形成。本發(fā)明還提供一種含有上述肌紅蛋白的人總抗氧化狀態(tài)(TAS)試劑盒，該試劑盒由試劑1和試劑2組成：試劑1為：緩沖液5～1000mM(mmol/L)2,2’-重氮-雙-(3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽)(ABTS、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)10～1000μM(10-6mol/L)肌紅蛋白1～100g/L防腐劑0.01～2g/L；試劑2為：過氧化氫(H2O2)2～100mM。本發(fā)明上述試劑盒中的緩沖液為為磷酸緩沖液、Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液、HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液、MOP(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)緩沖液、硼酸鹽緩沖液中的一種或幾種，且pH范圍在5.5～8.5之間。本發(fā)明上述試劑盒中的防腐劑為疊氮化合物、硫柳汞、PC系列防腐劑中的一種或幾種。本發(fā)明中的TAS試劑盒，可用于檢測和評估機體血清、血漿、尿液、唾液、細胞裂解液等成分的總抗氧化狀態(tài)。本發(fā)明的試劑盒，由于肌紅蛋白具有良好的穩(wěn)定性，可以配制成液體試劑，在37℃條件下可穩(wěn)定15d左右，在4℃條件下可穩(wěn)定1年左右，試劑盒性能指標基本保持不變；同時肌紅蛋白來源于豬心，提取工藝簡單、提取得率高，生產(chǎn)成本低，解決了從馬屬動物心肌、骨骼肌提取的高成本問題，有效降低試劑盒的生產(chǎn)成本，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果：1、本發(fā)明通過硫酸銨沉淀、疏水層析作用直接從新鮮豬心中提取肌紅蛋白，原材料易得、提取步驟簡單、提取率高、生產(chǎn)成本低、易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。2、通過上述提取方法，可獲得純度達95％以上的天然肌紅蛋白，穩(wěn)定性良好，可應(yīng)用于TAS試劑盒中，TAS試劑盒37℃條件下可穩(wěn)定15d左右，在4℃條件下可穩(wěn)定1年左右。3、通過本發(fā)明中的TAS試劑盒，各方面性能滿足要求，能用于檢測機體血清、尿液等成分中總的抗氧化物質(zhì)濃度，評估總抗氧化狀態(tài)。附圖說明圖1本發(fā)明實施例1的SDS-PAGE圖譜。圖2本發(fā)明實施例2的SDS-PAGE圖譜。具體實施方式：下面結(jié)合具體實例進一步闡述本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)力保護范圍內(nèi)所做的任何修改，都將納入本發(fā)明的保護范疇。實例1：從豬心中提取肌紅蛋白1)將500g新鮮豬心去除脂肪和結(jié)締組織之后，加入1000ml50mM磷酸緩沖液pH8.0，用組織勻漿機快速勻漿5min后，高速冷凍離心機12000rpm離心40min，去除沉淀，獲得粗提液；2)粗提液中加入占粗體液體質(zhì)量40％的硫酸銨固體，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉淀1h后，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去沉淀，保留上清液；3)在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨固體至飽和狀態(tài)，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉淀2h后，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去上清，獲得沉淀；4)沉淀用含30％硫酸銨的緩沖液復(fù)溶至1000ml，用0.45μm濾膜過濾以致澄清；5)將200ml苯基疏水填料裝入層析柱中，用3000ml30％硫酸銨的100mM磷酸緩沖液pH8.0平衡，平衡結(jié)束后上樣，上樣完畢后，繼續(xù)平衡至無蛋白流出，然后用含有15％硫酸銨的100mM磷酸緩沖液pH8.0洗脫，根據(jù)洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結(jié)果表明純度不低于95％(圖1)，將收集液根據(jù)體積加入2％阿拉伯樹膠，通過噴霧干燥技術(shù)制備干粉，其中噴霧干燥條件為進口溫度150℃、噴霧速度100ml/h。實例2：從豬心中提取肌紅蛋白1)將1000g新鮮豬心去除脂肪和結(jié)締組織之后，加入2000ml120mMTris緩沖液pH8.8，用組織勻漿機快速勻漿10min后，高速冷凍離心機12000rpm離心40min，去除沉淀，獲得粗提液；2)粗提液中加入50％的硫酸銨固體，輕微攪拌，待溶解完全，室溫下沉淀1h后用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨固體至飽和狀態(tài)，輕微攪拌，待完全溶解，室溫下沉淀2h后，用高速冷凍離心機12000rpm離心40min，棄去上清，獲得沉淀；4)沉淀用35％硫酸銨150mMTris緩沖液pH8.5復(fù)溶至2000ml，0.45μm濾膜過濾后，準備上樣；5)將500ml辛基疏水填料，裝入層析柱中，用含35％硫酸銨的150mMTris緩沖液pH8.5平衡，平衡結(jié)束后上樣，上樣完畢后，繼續(xù)平衡至無蛋白流出，然后用含有25％硫酸銨的150mMTris緩沖液pH8.5洗脫，根據(jù)洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結(jié)果表明純度不低于95％(圖2)，將收集液按體積加入5％海藻糖，通過噴霧干燥技術(shù)制備干粉，其中噴霧干燥條件為進口溫度170℃，噴霧速度250ml//h。實例3：從豬心中提取肌紅蛋白1)將800g新鮮豬心去除脂肪和結(jié)締組織之后，加入1400ml，250mM.硼酸緩沖液pH7.2中，用組織勻漿機快速勻漿25min后，高速冷凍離心機8000rpm離心40min，去除沉淀，獲得粗提液；2)粗提液中加入60％的硫酸銨固體，輕微攪拌，室溫下沉淀1h后用高速冷凍離心機8000rpm離心40min，保留上清；3)在上清液中加入硫酸銨固體至飽和狀態(tài)，室溫下沉淀2h后用高速冷凍離心機7500rpm離心50min，棄去上清，獲得沉淀；4)沉淀用40％的飽和硫酸銨緩沖液復(fù)溶至1400ml，0.8μm濾膜過濾待上樣；5)將600ml丁基疏水填料裝柱后，用含40％硫酸銨的200mM硼酸鹽緩沖液pH7.2平衡3000ml，平衡結(jié)束后上樣，上樣完畢后，繼續(xù)平衡至無蛋白流出，然后用含有20％硫酸銨200mM硼酸鹽緩沖液pH7.2洗脫，根據(jù)洗脫峰收集目的蛋白；6)通過SDS-PAGE檢測收集液中目的蛋白的純度，電泳結(jié)果表明純度不低于95％(圖2)，將收集液中加入4％的玉米糊精，通過噴霧干燥技術(shù)制備干粉，噴霧干燥條件為進口溫度120℃，噴霧速度80ml/h。獲得的肌紅蛋白SDS-PAGE電泳后條帶分析獲得的譜圖如附圖1-2所示，顯示條帶清晰，純度高，豬心中肌紅蛋白的分子量大小約在16.7KDa左右。實施例4：TAS試劑盒的制備將實施案例1、2、3中提取獲得的肌紅蛋白配制TAS試劑盒。試劑1為：100mMTris緩沖液，pH7.4200μMABTS20g/L肌紅蛋白1g/L疊氮鈉試劑2為：30mMH2O2試劑盒檢測條件為：RateA法，R1:R2:S＝250:50:5，主波長600nm，副波長405nm，讀數(shù)點22-32，反應(yīng)向上。實施例5：TAS試劑盒的制備將實施案例1、2、3中提取獲得的肌紅蛋白配制TAS試劑盒。試劑1為：100mM磷酸緩沖液，pH6.8200μMABTS10g/L肌紅蛋白1g/L硫柳汞試劑2為：30mMH2O2試劑盒檢測條件為：兩點速率法，R1:R2:S＝210:80:10，主波長600nm，副波長405nm，讀數(shù)點25-35，反應(yīng)向上。實施例6：TAS試劑盒性能檢測對實施例4中配置的TAS試劑盒的性能指標進行檢測。1)線性范圍測定：以維生素E代表抗氧化物質(zhì)用于測定TAS試劑盒的線性范圍。將維生素E(VitaminE，VE)用生理鹽水稀釋一系列倍數(shù)，通過本發(fā)明制備的TAS試劑盒測定不同稀釋倍數(shù)下VE的濃度，每個點測3次，用其平均值計算線性系數(shù)。數(shù)據(jù)見表1：表1：不同稀釋倍數(shù)下，抗氧化物質(zhì)(VE)濃度的測定結(jié)果稀釋倍數(shù)10.90.80.70.60.50.40.30.20.10測定濃度1(mM)2.562.212.031.781.551.190.950.720.500.260.07測定濃度2(mM)2.532.262.051.761.511.260.960.710.510.260.08測定濃度3(mM)2.562.312.041.701.581.291.050.780.540.230.07平均濃度(mM)2.552.262.041.751.551.250.990.740.520.250.08將表1中的測定濃度與稀釋倍數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，獲得相關(guān)線性方程為：Y＝2.502X+0.0201，R2＝0.9987，由此獲得本發(fā)明試劑盒的檢測線性范圍為0～2.5mM，符合說明書要求的0～2.2mM。2)精密度測定：利用TAS試劑盒分別連續(xù)檢測高低兩個不同濃度下的Ve，檢測次數(shù)為20次，計算CV值，用以表示精密度。數(shù)據(jù)如表2、表3：表2：高濃度抗氧化物質(zhì)(VE)的連續(xù)檢測結(jié)果根據(jù)表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，高濃度VE平均測值為2.237mM，標準差為0.0615mM，CV為2.75％，變異系數(shù)符合說明書要求5％，檢測精密度高。表3：低濃度抗氧化物質(zhì)(VE)的連續(xù)檢測結(jié)果檢測次數(shù)12345678910濃度(mM)0.750.730.720.740.740.730.770.760.730.73檢測次數(shù)11121314151617181920濃度(mM)0.690.680.730.790.760.710.790.70.720.72根據(jù)表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，低濃度VE平均測值為0.7345mM，標準差為0.02947mM，CV為4.01％，變異系數(shù)符合說明書要求5％，檢測精密度高。實施例7：TAS試劑盒性能檢測對實施例5中配置的TAS試劑盒的性能指標進行檢測。1)線性范圍測定：用維生素E代表抗氧化物質(zhì)用于測定TAS試劑盒的線性范圍。將維生素E(VitaminE，VE)用生理鹽水稀釋一系列倍數(shù)，通過本發(fā)明制備的TAS試劑盒測定不同稀釋倍數(shù)下VE的濃度，每個點測3次，用其平均值計算線性系數(shù)。數(shù)據(jù)見表1：表1：不同稀釋倍數(shù)下，抗氧化物質(zhì)(VE)濃度的測定結(jié)果稀釋倍數(shù)10.90.80.70.60.50.40.30.20.10測定濃度1(mM)2.552.232.021.781.531.220.960.740.520.250.06測定濃度2(mM)2.562.242.011.791.551.230.970.760.500.260.07測定濃度3(mM)2.542.221.991.771.511.220.970.730.490.230.06平均濃度(mM)2.552.232.011.781.531.220.970.740.500.250.06將表1中的測定濃度與稀釋倍數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，獲得相關(guān)線性方程為：Y＝2.501X+0.008，R2＝0.9986，由此獲得本發(fā)明試劑盒的檢測線性范圍為0～2.5mM，符合說明書要求的0～2.2mM。2)精密度測定：利用TAS試劑盒分別連續(xù)檢測高低兩個不同濃度下的Ve，檢測次數(shù)為20次，計算CV值，用以表示精密度。數(shù)據(jù)如表2、表3：表2：高濃度抗氧化物質(zhì)(VE)的連續(xù)檢測結(jié)果根據(jù)表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，高濃度Ve平均測值為2.235mM，標準差為0.0476mM，CV為2.13％，變異系數(shù)符合說明書要求5％，檢測精密度高。表3：低濃度抗氧化物質(zhì)(VE)的連續(xù)檢測結(jié)果檢測次數(shù)12345678910濃度(mM)0.780.730.740.690.720.760.730.740.780.7檢測次數(shù)11121314151617181920濃度(mM)0.760.750.730.740.690.760.780.780.760.71根據(jù)表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，低濃度Ve平均測值為0.7415mM，標準差為0.02925mM，CV為3.94％，變異系數(shù)符合說明書要求5％，檢測精密度高。綜上，依據(jù)本發(fā)明方法制備的TAS試劑盒，對抗氧化物質(zhì)的檢測線性良好、范圍廣，變異系數(shù)低，精密度高，可滿足于機體抗氧化狀態(tài)的檢測。當前第1頁1 2 3