本公開內(nèi)容的實施方案總體上涉及例如在核酸測序操作中用于樣品的流體操作和光學檢測的裝置和方法。

背景技術(shù)：

我們的基因組提供了用于預測許多我們的固有傾向諸如我們的偏好、才能、對疾病的易感性和對治療藥物的反應(yīng)性的藍圖。單獨的人基因組包含超過30億個核苷酸的序列。那些核苷酸中的僅一小部分的差異賦予我們許多獨特的性質(zhì)。研究團體在揭開組成藍圖的特征方面取得了令人印象深刻的進展，并且隨之而來的，對每個藍圖中的信息與人類健康如何相關(guān)有了更完整的了解。但是，我們的了解還遠遠沒有完成，這阻礙了信息從研究實驗室向臨床的移動，希望有一天我們每個人都將擁有我們個人基因組的拷貝，這樣我們就可以和醫(yī)生一起確定健康生活方式或恰當?shù)闹委熯^程的合適選擇。

目前的瓶頸是通量和規(guī)模的問題。揭開任一個給定個體的藍圖的基本組成部分是確定他們的基因組中30億個核苷酸的確切序列。存在可用的技術(shù)，但那些技術(shù)通常需要數(shù)天和成千上萬美元來執(zhí)行。另外，任何個體的基因組序列的臨床相關(guān)性是比較他們的基因組序列的獨特性質(zhì)(即他們的基因型)和與已知性質(zhì)(即表型)相關(guān)的參考基因組。當人們考慮到，參考基因組是基于來自于通常使用上千名個體以統(tǒng)計學上有效的調(diào)查研究的基因型和表型的對應(yīng)關(guān)系產(chǎn)生的時，規(guī)模和通量的問題變得明顯。因此，最終可以為上千名個體進行數(shù)以十億計的核苷酸測序以鑒定任何臨床上相關(guān)的基因型與表型的對應(yīng)。再乘以疾病的數(shù)量、藥物反應(yīng)性和其他臨床上相關(guān)的性質(zhì)，對非常廉價和快速的測序技術(shù)的需求變得更明顯。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

需要降低測序的成本，這推動研究科學家進行大規(guī)模遺傳相關(guān)性研究并使得測序可以在臨床環(huán)境下獲得，用于做出改變?nèi)松臎Q定的單個患者的治療。本文列出的本實用新型的實施方案滿足此需求并且還提供其他優(yōu)點。

本公開內(nèi)容的實施方案涉及以下方面：

1)本文提供了一種檢測裝置，所述裝置包括具有物鏡、激發(fā)輻射源和檢測器的顯微熒光計。顯微熒光計被配置用于寬場圖像檢測。檢測裝置還包括流體系統(tǒng)，用于從試劑倉匣(cartridge receptacle)向流動池(flow cell) 遞送試劑。流體系統(tǒng)包括具有多個流體通道的歧管主體，所述流體通道被配置用于試劑倉匣和流動池的入口之間的流體連通。流體系統(tǒng)還包括多個試劑吸取器(reagent sipper)，所述試劑吸取器從歧管主體端口向下延伸。每個試劑吸取器被配置為被置于試劑倉匣的試劑庫(reagent reservoir)中，這樣液體試劑可以從試劑庫被吸入到試劑吸取器中。流體系統(tǒng)還包括閥，所述閥被配置為調(diào)節(jié)試劑庫和流動池的入口之間的流體連通。流體通道將試劑吸取器流體連接至閥。檢測裝置還包括具有用于容納流動池的夾持蓋的流動池閂鎖夾持模塊(flow cell latch clamp module)。物鏡被配置為將來自輻射源的激發(fā)輻射導向流動池和將來自流動池的發(fā)射導向檢測器。顯微熒光計是可移動的以獲得流動池內(nèi)表面的不同區(qū)域的寬場圖像。

2)如1)所述的檢測裝置，其中所述檢測裝置包括不超過一個顯微熒光計。

3)如1)或2)所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計包括分光鏡，所述分光鏡被定位為將來自所述激發(fā)輻射源的激發(fā)輻射導向所述物鏡和將來自所述物鏡的發(fā)射輻射導向所述檢測器。

4)如1)-3)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計是具有緊湊的落射熒光檢測配置的集成的顯微熒光計。

5)如1)-4)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計是可移動的以允許將比所述顯微熒光計的視場更大的流動池成像。

6)如1)-5)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括外罩和在所述外罩的正面展示的屏幕，所述屏幕充當圖形用戶界面。

7)如1)-5)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括具有用于接收所述試劑倉匣的倉匣容器的外罩。

8)如1)-7)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括流體自動化模塊，所述流體自動化模塊包括用于使所述試劑倉匣升高和降低的升降組件。

9)如1)-7)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括流體自動化模塊，所述流體自動化模塊包括在裝載期間移動所述試劑倉匣的傳送帶組件。

10)如1)-7)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括流體自動化模塊，所述流體自動化模塊包括用于使所述試劑倉匣升高和降低的升降組件和在裝載期間移動所述試劑倉匣的傳送帶組件。

11)如1)-10)中任一項所述的檢測裝置，其中所述歧管主體由粘合在一起的多層固體材料形成。

12)如11)所述的檢測裝置，其中所述流體通道在將所述多層粘合在一起之前在所述固體材料中形成。

13)如1)-12)中任一項所述的檢測裝置，其中所述流體通道被完整地容納在所述歧管主體中。

14)如1)-13)中任一項所述的檢測裝置，其中所述歧管主體具有連接至相應(yīng)試劑吸取器的至少十六個端口。

15)如1)-14)中任一項所述的檢測裝置，其中所述閥被配置為具有對應(yīng)于所述流體通道的所述端口的每一個的入口端口，并且被配置為具有流體連接至所述流動池的單個公用出口端口。

16)如1)-15)中任一項所述的檢測裝置，其中所述流體系統(tǒng)具有不多于一個閥，所述閥調(diào)節(jié)所述試劑庫和所述流動池之間的流體連通。

17)如16)所述的檢測裝置，其中所述流體通道的每一個源自單個端口并連接至所述閥的對應(yīng)端口。

18)如1)-17)中任一項所述的檢測裝置，其中所述歧管主體具有單層流體通道。

19)如1)-18)中任一項所述的檢測裝置，其中所述試劑吸取器具有被配置為穿透所述試劑倉匣的膜或箔層的遠端。

20)如1)-19)中任一項所述的檢測裝置，其中所述激發(fā)輻射源產(chǎn)生不同波長的輻射。

21)如1)-20)中任一項所述的檢測裝置，其中所述檢測器是互補金屬氧化物半導體(CMOS)圖像傳感器。

22)如1)-21)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計是成像模塊的部件，所述成像模塊還包括所述流動池閂鎖夾持模塊。

23)如22)所述的檢測裝置，其中所述成像模塊還包括XY臺，其中 X-電機和Y-電機分別提供所述X-臺和所述Y-臺的運動。

24)如23)所述的檢測裝置，其中所述X-電機沿X軸移動相機組件，所述相機組件具有所述顯微熒光計，其中所述Y-電機沿著Y軸移動所述流動池閂鎖夾持模塊。

25)如1)-24)中任一項所述的檢測裝置，所述檢測裝置還包括流體設(shè)備，所述流體設(shè)備包括流動池倉匣和所述流動池，所述流動池倉匣被配置為容納所述流動池并協(xié)助定向所述流動池用于成像對話。

26)如25)所述的檢測裝置，其中所述流體設(shè)備和所述流動池倉匣是可移除的，使得所述流動池倉匣是由個體或機器從所述流動池閂鎖夾持模塊可移除的，而不破壞所述流體設(shè)備或所述流動池倉匣。

27)如25)所述的檢測裝置，其中所述流動池倉匣被配置為重復插入到所述流動池閂鎖夾持模塊和從所述流動池閂鎖夾持模塊移出，而不破壞所述流動池倉匣或使所述流動池倉匣不適用于其預期目的。

28)如1)-27)中任一項所述的檢測裝置，其中所述流動池倉匣包括外罩和偶聯(lián)至所述流動池倉匣的所述外罩的蓋構(gòu)件，所述蓋構(gòu)件包括具有彼此靠近的入口通路和出口通路的襯墊，其中所述夾持蓋包括具有入口端口和出口端口的蓋歧管，所述入口端口和出口端口被配置為分別與所述襯墊的入口通路和出口通路配合。

29)如1)-28)中任一項所述的檢測裝置，其中所述流動池閂鎖夾持模塊包括使所述流動池偏倚定位銷的彈簧加載桿。

30)如1)-29)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的場直徑為至少0.5mm。

31)如1)-30)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的場直徑為至少2mm。

32)如1)-31)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的場直徑為不大于5mm。

33)如1)-32)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的數(shù)值孔徑為至少0.2。

34)如1)-33)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的數(shù)值孔徑為不大于0.8。

35)如1)-34)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計的數(shù)值孔徑為不大于0.5。

36)如1)-35)中任一項所述的檢測裝置，其中所述顯微熒光計具有足以分辨間隔最多100μm的特征的分辨率。

37)一種測序系統(tǒng)，所述測序系統(tǒng)包括如1)-36)中任一項所述的檢測裝置和具有試劑庫的試劑倉匣，其中所述試劑庫包括測序試劑。

38)如37)所述的測序系統(tǒng)，其中所述試劑庫中的至少一個包括核酸樣品。

39)如37)或38)所述的測序系統(tǒng)，其中所述試劑倉匣是從所述檢測裝置可移除的。

40.如37)或38)或39)所述的測序系統(tǒng)，其中所述測序系統(tǒng)被配置為執(zhí)行合成測序方案。

本文提供了一種檢測裝置，所述檢測裝置包括(a)箱體，所述箱體包括一個或更多個顯微熒光計，其中所述一個或更多個顯微熒光計的每個包括物鏡，所述物鏡被配置用于寬場圖像檢測，其中所述一個或更多個顯微熒光計被定位以從公用平面(common plane)的不同區(qū)域獲得多個寬場；(b)移位臺，所述移位臺被配置為在與公用平面平行的至少一個方向上移動箱體；和(c)流體系統(tǒng)，所述流體系統(tǒng)用于將試劑從試劑倉匣遞送至流動池，所述流體系統(tǒng)包括：試劑歧管，所述試劑歧管包括被配制用于試劑倉匣和流動池的入口之間的流體連通的多個通道；多個試劑吸取器，所述試劑吸取器從歧管的端口向下延伸，每個試劑吸取器被配置為置于試劑倉匣的試劑庫中，使得液體試劑可以從試劑庫被吸入至吸取器中；至少一個閥，所述閥被配置為調(diào)節(jié)庫和流動池的入口之間的流體連通。在某些實施方案中，裝置包括不超過一個顯微熒光計。

此公開內(nèi)容還提供了用于將試劑從試劑倉匣遞送至流動池的流體系統(tǒng)，所述流體系統(tǒng)包括：試劑歧管，所述試劑歧管包括被配置為試劑倉匣和流動池的入口之間的流體連通的多個通道；多個試劑吸取器，所述試劑吸取器從歧管的端口向下延伸，每個試劑吸取器被配置為置于試劑倉匣的試劑庫中，從而液體試劑可以從試劑庫被吸入至吸取器中；至少一個閥，所述閥被配置為調(diào)節(jié)庫和流動池的入口之間的流體連通。

此公開內(nèi)容還提供了測序系統(tǒng)，所述測序系統(tǒng)包括：如上所述的檢測裝置；和用試劑倉匣分配的核酸樣品，其中試劑倉匣可從檢測裝置移除。

此公開內(nèi)容還提供了測序系統(tǒng)，所述測序系統(tǒng)包括：如上所述的檢測裝置；和用流動池分配的核酸樣品，其中流動池可從檢測裝置移除。

此公開內(nèi)容還提供了測序方法，所述測序方法包括以下步驟：(a)提供測序系統(tǒng)，所述測序系統(tǒng)包括(i)包括光學透明表面的流動池，(ii)核酸樣品，(iii)用于測序反應(yīng)的多個試劑，和(iv)用于將試劑遞送至流動池的流體系統(tǒng)；(b)提供檢測裝置，所述檢測裝置包括(i)單個顯微熒光計，其中顯微熒光計包括物鏡，所述物鏡被配置用于在圖像平面在X維和Y維進行寬場圖像檢測，和(ii)樣品臺；以及(c)在倉匣中進行核酸測序過程的流體操作和在檢測裝置中進行核酸測序過程的檢測操作，其中(i)試劑由流體系統(tǒng)遞送至流動池，(ii)核酸特征的寬場圖像由顯微熒光計檢測。

一個或更多個實施方案的細節(jié)在附圖和以下的說明中被描述。其他的特征、目標、和優(yōu)勢將由說明書和附圖，以及由權(quán)利要求而明顯。

附圖說明

圖1A示出了可用于核酸測序的集成的光電和流體檢測設(shè)備。

圖1B示出了組成圖1A中示出的集成的光電和流體檢測設(shè)備的幾個模塊和系統(tǒng)的分解圖。

圖2A示出了具有試劑吸取器、閥和對準銷(alignment pin)的歧管組件的透視圖。還示出了試劑倉匣。

圖2B示出了具有試劑吸取器、閥和對準銷的歧管組件的透視圖。

圖2C示出了具有不同長度的試劑吸取器、閥和對準銷的歧管組件的側(cè)視圖。還示出了試劑倉匣。

圖2D示出了流體系統(tǒng)的流體圖。

圖3A示出了試劑倉匣的頂部透視圖。

圖3B示出了流體自動化模塊的透視圖。

圖4A示出了具有正交激發(fā)和發(fā)射光路的單個顯微熒光計的光學布置。

圖4B示出了顯微熒光計的光學布置。

圖4C示出了示例性單個顯微熒光計的透視圖。

圖5A示出了具有單個顯微熒光計的成像模塊的正向透視圖。

圖5B示出了具有單個顯微熒光計的成像模塊的側(cè)向透視圖。

圖6顯示了流動池。

圖7A示出了流動池閂鎖夾持模塊的透視圖。

圖7B示出了不具有流動池或蓋的流動池閂鎖夾持模塊。

圖7C示出了以未閂鎖位置加載在具有蓋的閂鎖夾持模塊中的流動池。

具體實施方式

此公開內(nèi)容提供了用于平面區(qū)域諸如存在于基底表面上的那些的高分辨率檢測的方法和裝置。特別有用的應(yīng)用是存在于表面上的生物樣品的基于光學的成像。例如，本文列出的方法和裝置可以被用于獲得存在于核酸陣列，諸如核酸測序應(yīng)用中使用的那些中的核酸特征的圖像?？梢允褂美每晒鈱W檢測的樣品和/或試劑的多種核酸測序技術(shù)。這些技術(shù)特別適用于本公開內(nèi)容的方法和裝置，并且因此突出本實用新型的特定實施方案的多個優(yōu)點。出于說明的目的，那些優(yōu)點的一些在以下列出，并且盡管舉例說明了核酸測序應(yīng)用，優(yōu)點還可以延伸至其他應(yīng)用。

關(guān)于本文列出的一些實例，許多核酸測序技術(shù)的顯著特征是：(1)使用多色檢測(例如，通常使用4個不同的熒光團，每個熒光團用于存在于核酸中的不同核苷酸類型A、C、G和T(或U)的每一個)，(2)來自核酸樣品(例如來自基因組樣品、RNA樣品或其衍生物的片段)的大量不同片段在陣列表面上的分布和(3)流體過程的重復循環(huán)和陣列的成像。本文公開的方法和裝置的實施方案對于核酸測序特別有用，因為它們可以提供多個顏色和多個重復的陣列表面的高分辨率成像的能力。例如，本文列出的實施方案允許以在數(shù)百、數(shù)十或甚至幾個微米范圍內(nèi)的分辨率獲得表面的圖像。這樣，可以分辨具有最接近的鄰居、平均中心間隔低于100微米、50 微米、10微米、5微米或更小的核酸特征。在特定實施方案中，可以獲得表面的寬場圖像，包括例如覆蓋陣列的1mm²或更大的面積的圖像。可以同時或依序獲得多色圖像，例如以鑒別與不同核苷酸類型唯一關(guān)聯(lián)的熒光標簽。另外，可以對于測序技術(shù)的多個循環(huán)依序獲得圖像?？梢詮拿總€循環(huán)可靠地比較來自陣列的給定區(qū)域的圖像以確定對于陣列上的每個核酸特征檢測的顏色變化的序列。顏色變化的序列可以反過來被用于指示每個特征的核酸片段的序列。

在特定實施方案中，本公開內(nèi)容的裝置包括一個或更多個顯微熒光計。每個顯微熒光計可以包括激發(fā)輻射源、檢測器和物鏡以形成讀取頭 (read head)的集成的子單元。其他光學部件可以存在于每個顯微熒光計中。例如，可以存在分光鏡以提供緊湊的落射熒光(epifluorescent)檢測配置，由此分光鏡被定位為將激發(fā)輻射從激發(fā)輻射源導向物鏡并將發(fā)射輻射從物鏡導向檢測器。

使用集成的顯微熒光計設(shè)計的優(yōu)點是，顯微熒光計可以被方便地移動，例如在掃描操作中，以允許對大于該顯微熒光計的視場的基底成像。在特定實施方案中，單個顯微熒光計可以形成讀取頭。在特定實施方案中，多個顯微熒光計可以被組合以形成讀取頭。一個或更多個讀取頭的多個配置在以下列出，并且可以被選擇以適合待被成像的基底的特定格式，同時保持整個讀取頭的相對緊湊的尺寸。在本公開內(nèi)容的多個實施方案中，讀取頭的相對小的尺寸和低質(zhì)量導致相對低的慣性，使得讀取頭在被移動后快速靜止，從而有助于快速掃描核酸陣列或其他基底。在一些情況中，顯微熒光計可以被固定于箱體，這樣它們在分析應(yīng)用諸如核酸測序運行期間至少在一些維度上不可獨立移動。但是，顯微熒光計可以在z維上獨立地致動以提供獨立的聚焦控制。減小本公開內(nèi)容的裝置的幾個不同的顯微熒光計之間的自由度提供了運輸、安裝和使用該裝置期間對于對準(alignment) 丟失的保護。

在一些實施方案中，存在于讀取頭或箱體中的多個顯微熒光計可以各自具有專用的自動聚焦模塊。因此，每個顯微熒光計可以獨立地聚焦。在一些實施方案中，盡管讀取頭中的特定自動聚焦模塊專用于特定顯微熒光計的致動，該特定自動聚焦模塊還可以接收來自讀取頭中的至少一個其他自動聚焦模塊的信息，并且來自該特定自動聚焦模塊和來自至少一個其他自動聚焦模塊的信息可以被用于確定適當?shù)闹聞右垣@得該特定顯微熒光計的期望的焦點。這樣，對于任何給定的顯微熒光計，聚焦可以由存在于相同讀取頭或箱體中的兩個或更多個顯微熒光計之間的一致性確定。

在特定實施方案中，可以使用本文提供的流體系統(tǒng)向檢測室提供待被檢測的樣品。以核酸測序應(yīng)用為更具體的實例，流體系統(tǒng)可以包括歧管組件、和/或泵、閥和能夠移動流體通過流動池的其他部件，所述歧管組件可以被置于與一個或更多個用于容納測序試劑的庫、用于容納樣品制備試劑的庫、用于容納測序期間產(chǎn)生的廢棄物的庫流體連通。

在特定實施方案中，流體系統(tǒng)可以被配置為允許一種或更多種試劑的再利用。例如，流體系統(tǒng)可以被配置為向流動池遞送試劑、然后從流動池移出試劑和然后將該試劑再引入至流動池。再利用試劑的優(yōu)點是減小廢棄物體積和降低使用昂貴的試劑和/或以高濃度(或大量)遞送的試劑的過程的成本。試劑再利用利用以下理解：試劑耗盡僅在或主要在流動池表面發(fā)生，并且因此大部分試劑未被利用并可以被再利用。

圖1A示出了示例性檢測設(shè)備1，所述檢測設(shè)備1利用本文列出的幾個實施方案提供的集成的光電和流體系統(tǒng)的優(yōu)點。示例性檢測設(shè)備1包括外罩2，所述外罩2包括多個固定的部件，包括例如光學部件、計算部件、電源、風扇等。存在于例如外罩2正面的屏幕3充當圖形用戶界面，其可以提供多個類型的信息諸如操作狀態(tài)、正在進行的分析過程(例如測序運行) 的狀態(tài)、轉(zhuǎn)移到或轉(zhuǎn)移自檢測設(shè)備1的數(shù)據(jù)狀態(tài)、使用說明、警告等。倉匣容器(cartridge receptacle)4A也存在于外罩2的正面。廢棄物庫容器4B 也存在于外罩2的正面。如示出的，倉匣容器4A和廢棄物庫容器4B可以被配置為具有保護門5的槽。存在狀態(tài)指示器6，在此實例中以倉匣容器的框上的指示燈的形式，并且狀態(tài)指示器6可以被配置為指示檢測設(shè)備1 中試劑倉匣的存在或不存在。例如，指示燈6可以從亮變到暗，或可以從一個顏色變成另一個顏色來指示倉匣的存在或不存在。在此實例中，電源按鈕7存在于外罩2的正面，標志標記8諸如生產(chǎn)商或儀器的名稱也一樣。

圖1A還示出了可以被用于向檢測設(shè)備1提供樣品和試劑的示例性試劑倉匣10。試劑倉匣10包括倉匣外罩11，所述倉匣外罩11保護多種流體部件諸如庫、流體連接等。在倉匣外罩11上任選地存在條碼或其他可機讀的標記，例如以提供樣品追蹤和管理。其他標記也可以存在于外罩上，以便于由人類用戶識別，例如以鑒別生產(chǎn)商、由流體倉匣支持的解析分析 (analytical analysis)、批號、有效期、安全警告等。

圖1A還示出了可以被插入到廢棄物庫容器4B的廢棄物庫12。廢棄物庫12被配置為經(jīng)庫頂部的開口接收廢棄物流體。

圖1A中示出的設(shè)備是示例性的?？梢源娴鼗虺龍D1A的實例以外使用的本公開內(nèi)容的方法和裝置的其他示例性實施方案在以下進一步詳細列出。

圖1B示出了示例性檢測設(shè)備1的部件，包括與流體自動化模塊(FAM) 1002流體連通的流體泵1001。FAM 1002被配置為被置于與試劑倉匣1003、流動池1004和廢棄物庫1005流體連通以將液體試劑從試劑倉匣1003移動到流動池1004和廢棄物庫1005。圖1B還示出了XY臺1006，包括流動池夾持模塊1007。圖1B還示出了供電單元1008和主印刷電路板(PCB) 1009。

圖2A示出了示例性的流體系統(tǒng)100，所述流體系統(tǒng)100具有試劑吸取器103和104和閥102，所述流體系統(tǒng)100利用由本文列出的多個實施方案提供的流體系統(tǒng)的優(yōu)點。流體系統(tǒng)100包括歧管組件101，所述歧管組件101包含多個固定的部件，包括例如試劑吸取器、閥、通道、庫等。存在試劑倉匣400，其具有試劑庫401和402(以下被稱為“孔”)，其被配置為同時接合(engage)沿著維度z的一組試劑吸取器103和104，使得液體試劑可以從試劑庫被吸入到吸取器中。

圖2B示出了可以被用于從試劑庫向流動池提供液體試劑的示例性歧管組件101。歧管組件101包括從歧管的端口106沿著維度z向下延伸的試劑吸取器103和104。試劑吸取器103和104可以被置于試劑倉匣的一個或更多個試劑庫(未示出)中。歧管主體108還包括將試劑吸取器103流體連接至閥102的流體通道107。試劑吸取器103和104、流體通道107 和閥102調(diào)節(jié)試劑庫和流動池(未示出)之間的流體連通。閥102和109可以單獨地或聯(lián)合地選擇試劑吸取器103或104，并且通過流體通道諸如107 調(diào)節(jié)試劑庫和流動池(未示出)之間的流體連通。

圖2C示出了具有試劑吸取器和閥的示例性流體系統(tǒng)100的側(cè)視圖。歧管具有以平行于試劑吸取器的軸從歧管向下伸出的對準銷105。與試劑吸取器相比，對準銷105沿z維更長，盡管在可代替的實施方案中，它們可以具有相同的長度或?qū)输N105更短。對準銷105被配置為與試劑倉匣 (未示出)上的一個或更多個相應(yīng)接口槽(interface slot)接合。試劑吸取器103 和104經(jīng)由端口106被偶聯(lián)至歧管，所述端口106被容納于歧管組件101 的歧管主體108中。試劑吸取器104比試劑吸取器103更長，以從對應(yīng)于試劑吸取器103或104的深度的不同深度的試劑庫吸取液體。在可代替的實施方案中，試劑吸取器103和104可以具有相等的長度，或可以切換主要長度。

圖2B示出了歧管組件101的視圖，展示歧管主體108內(nèi)的流體通道107的一個可能的布置。流體通道107的每個源自單個端口106并連接相應(yīng)端口106至閥102。在一些實施方案中，某些通道可以包括存儲庫(cache reservoir)，其具有足以允許一定量的液體試劑從流動池(未示出)流向存儲庫的體積，使得來自流動池的液體試劑在接觸流動池后不被導回至試劑庫 (未示出)。圖2B還示出了一個或更多個對準銷105的示例性位置。圖2B 中示出的歧管組件還包括用于共享緩沖液的入口端口111。閥102被配置為帶有對應(yīng)于每個端口106的入口端口、和流體連接至流動池的公用出口端口110、和流體連接至廢棄物容器的廢棄物端口。

如以上示例性實施方案說明的，用于將試劑從試劑倉匣遞送至流動池的流體系統(tǒng)可以包括試劑歧管，所述試劑歧管包括具有被配置用于試劑倉匣和流動池的入口之間的流體連通的多個通道的歧管主體。在流體系統(tǒng)中使用歧管主體相對于僅使用管道(tubing)提供了多個優(yōu)勢。例如，具有固定的流體通道的歧管主體減小了組裝期間失誤的可能性，諸如管道連接的錯位以及連接過緊或過松。另外，歧管主體提供了容易維護，例如允許快速置換整個單元而不是費時地檢測和置換單個管線(line)。

歧管的一個或更多個通道可以包括經(jīng)由固體材料的流體軌道(fluidic track)。軌道可以為允許期望的流體水平轉(zhuǎn)移通過該軌道的任何直徑。軌道可以具有例如少于0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、 0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、 7mm、8mm、9mm或少于10mm直徑的內(nèi)徑。軌道配置可以為例如直線的或曲線的。可選地或另外地，軌道可以具有曲折部分和直線部分的組合。軌道的橫截面可以為，例如方形、圓形、“D”形或使得期望的流體水平轉(zhuǎn)移通過該軌道的任何其他形狀。

吸取器和閥之間的通道可以被整個容納在歧管主體108中?？蛇x地或另外地，通道可以包括歧管外部的一個或更多的部分。例如，諸如例如柔性管道的管道可以連接歧管上的流體軌道的一部分和軌道的另一部分?？蛇x地或另外地，柔性管道可以將流動池連接至系統(tǒng)的固定的流體部件，包括例如泵、閥、傳感器和儀表。作為實例，柔性管道可以適于將本系統(tǒng)的流動池或通道連接至泵諸如注射泵或蠕動泵。

歧管主體108可以，例如由能夠在其中支持一個或更多個通道的任何合適的固體材料制成。因此，歧管主體108可以是樹脂，諸如聚碳酸酯、聚氯乙烯、(聚甲醛)；PCTFE(聚氯三氟乙烯)；PEEK^TM (聚醚醚酮)；PK(聚酮)；聚乙烯；PPS(聚苯硫醚)；聚丙烯；聚砜；FEP；PFA；高純度PFA；R；316不銹鋼；ETFE (乙烯-四氟乙烯共聚物)；(聚甲基戊烯)；鈦；UHMWPE(超高分子量聚乙烯)；(聚醚酰亞胺)；或與運輸通過本文示出的實施方案的歧管的通道的溶劑和流體相容的任何其他合適的固體材料。歧管主體可以由單獨一塊材料形成?？蛇x地或另外的，歧管主體可以由粘合到一起的多層形成。粘合方法包括例如使用粘合劑、襯墊(gasket)和擴散粘合 (diffusion bonding)。通道可以由任何合適的方法在固體材料中形成。例如，通道可以被鉆、蝕刻或碾磨在固體材料中。可以在將多層粘合到一起之前在固體材料中形成通道?？蛇x地或另外地，可以在將多層粘合在一起之后形成通道。

此處示出的歧管組件被配置用于從試劑倉匣向流動池遞送液體試劑。因此，歧管可以具有偶聯(lián)至試劑吸取器的任何數(shù)量的端口。更具體地，端口的數(shù)量可以對應(yīng)于試劑倉匣中的試劑庫的數(shù)量和配置。在一些實施方案中，歧管包括至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10 個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20 個或至少30個端口，每個端口被配置為偶聯(lián)試劑吸取器和與至少一個閥流體連通的通道。

本文示出的流體系統(tǒng)還可以包括吸取管(sipper tube)的陣列，所述吸取管從歧管主體的端口沿z維度向下延伸，試劑吸取器的每一個被配置為被插入到試劑倉匣中的試劑庫中，從而液體試劑可以從所述試劑庫被吸入到所述吸取器中。試劑吸取器可以包括例如具有近端和遠端的管狀體。遠端可以逐漸變細成尖端，所述尖端被配置為刺穿用作試劑倉匣中的試劑庫上的密封的薄膜或箔層。試劑吸取器可以被設(shè)有例如從遠端向近端穿過管體的單個空腔?？涨豢梢员慌渲脼樘峁┪∑饕欢说脑噭﹤}匣和吸取器另一端的試劑歧管之間的流體連通。如在示例性的圖2B中示出的，試劑吸取器103和104經(jīng)由容納在歧管主體108中的端口106被偶聯(lián)至歧管主體 108。

在一些實施方案中，如在圖2C中示例的，試劑吸取器的一個子集具有比其他試劑吸取器短的長度。例如，子集的長度可以比其他試劑吸取器短至少1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8 mm、1.9mm或至少2.0mm。歧管和試劑吸取器可以在具有升降機構(gòu)的設(shè)備中使用，所述升降機構(gòu)被配置為沿z維雙向移動試劑倉匣，使得試劑吸取器插入到試劑倉匣的相應(yīng)孔或庫中。在某些實施方案中，試劑孔可以被保護性箔覆蓋。因此，提供不同長度的吸取器的優(yōu)點是減小了當試劑倉匣與刺穿性吸取器接觸時升降機構(gòu)適應(yīng)箔刺穿力所需的力。吸取器長度的差異可以有利地對應(yīng)于試劑倉匣中的試劑孔的深度，使得當吸取器和倉匣處于完全接合位置時，每個吸取器在其對應(yīng)的試劑孔中達到期望的深度。

吸取器可由任何合適的材料形成，所述材料允許流體通過空腔轉(zhuǎn)移，并且與通過在本文示出的實施方案中的歧管的通道運輸?shù)娜軇┖土黧w相容。吸取器可以由單個管形成?？蛇x地或另外地，一個或更多個吸取器可由多個節(jié)段制成，這些節(jié)段一起形成所需長度和直徑的吸取器。

在一些實施方案中，至少一個試劑吸取器包括順應(yīng)式尖端(compliant tip)，其被配置為當末端尖端碰撞試劑倉匣中的試劑孔的底部時彎曲。通過彎曲或形變，順應(yīng)式尖端允許吸取器的空腔更完全接近或甚至接觸試劑孔的底部，從而減少或甚至消除試劑孔中的抽空體積。順應(yīng)式尖端可以特別有利于在使用小體積時攝取樣品或試劑，或者在期望攝取試劑庫中的大部分或全部液體的情況下。具有順應(yīng)式尖端的吸取器的主體可以完全由與尖端相同的柔性材料制成?？蛇x地或另外地，吸取器的主體可由與尖端不同的材料制成。順應(yīng)式尖端可以由任何合適的材料制成，使得當被推動與試劑庫的底部接觸時，順應(yīng)式尖端可以變形或彎曲。一些合適的材料包括聚合物和/或合成泡沫、橡膠、硅酮和/或彈性體，包括熱塑性聚合物諸如聚氨酯。

本文示出的流體系統(tǒng)還可以包括例如泵和閥，所述泵和閥是可選擇性地操作的，以控制庫與流動池的入口之間的流體連通。如由圖2D示出的歧管組件101所示例，歧管主體108上的通道出口可以被配置為與閥102 上的相應(yīng)入口端口連接，使得每個流體通道107與閥102上的入口端口流體連通。因此，通過歧管主體108的流體通道107，一個或更多個或每個入口端口可以與試劑吸取器流體連通。閥102可以配置有公用出口端口 110，其流體連接至流動池上的一個或更多個通道的入口?？蛇x地或另外地，閥102可以配置有廢棄物端口112，其流體連接至一個或更多個廢棄物庫 1005。

圖2A、2B、2C和2D中示出的裝置是示例性的?？梢源娴鼗虺龍D 2A、2B、2C和2D的實例以外使用的本公開內(nèi)容的方法和裝置的其他示例性實施方案在以下進一步詳細列出。

示例性的試劑倉匣在圖3A中示出。圖3A中示出的試劑倉匣400可以包括沿z維具有與孔402的深度相比不同深度的孔401。更具體地，圖3A 示例的試劑倉匣具有設(shè)計成容納相應(yīng)的試劑吸取器(未示出)的長度的孔，使得當吸取器和倉匣處于完全接合位置時，每個吸取器在其對應(yīng)的試劑孔中達到期望的深度。在圖3A示例的試劑倉匣中，孔沿y維排列成行或列，其中行或列的外側(cè)的那些孔401沿著z維比行或列的內(nèi)側(cè)的那些孔402更向下延伸。一些或全部孔可以具有不同的深度?？蛇x地或另外地，一些或全部孔可以具有相同深度。當吸取器和倉匣處于完全接合位置時，任何吸取器尖端的穿透深度(即，從孔的底表面到吸取器尖端末端的距離)可以等同于試劑倉匣中的任何其它給定孔中的任何其他吸頭尖端的穿透深度。任何吸取器尖端的穿透深度不需要與試劑倉匣中任何其它給定孔的穿透深度相同。在至少一些試劑孔具有不同的孔深度的情況下，孔深度可以比其他試劑吸取器短例如至少0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、 0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、 1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或至少2.0mm。類似的，當吸取器和倉匣處于完全接合位置時，任何吸取器尖端的穿透深度可以與試劑倉匣中的任何其它吸取器尖端的穿透深度相差至少0.2mm、0.3mm、0.4 mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2 mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或至少2.0mm。

如圖3A的示例性試劑倉匣400中示出的，倉匣包括多個試劑庫401A、 401B、402A和402B。圖3A中的試劑庫以x和y維排列成行。圖3A還示出了，倉匣包括對準槽403和404，對準槽403和404被配置為與歧管組件(未示出)的相應(yīng)對準銷接合。倉匣還可以包括覆蓋任何數(shù)量的試劑孔或庫的保護箔，當倉匣與刺穿性吸取器接觸時，保護箔可以被刺穿性吸取器刺穿。

本文示出的試劑倉匣可以包括任何數(shù)量的試劑庫或孔。試劑庫或孔可以沿著x和y維以任何形式布置，以便于試劑在倉匣中的運輸和存儲?？蛇x地或另外地，試劑庫或孔可以沿著x和y維以適于與從岐管中的端口沿 z維向下延伸的吸取器管陣列相互作用的任何形式布置。更具體地，試劑庫或孔可以以適于同時接合試劑吸取器的矩陣的任何形式布置，使得液體試劑可從試劑庫被抽取到吸取器中。

并非所有試劑孔都需要與歧管組件的所有吸取管同時相互作用。例如，試劑倉匣可以包括一個或更多個試劑庫或孔的子集，所述試劑庫或孔被配置為保持在非相互作用狀態(tài)，而其它庫或孔由吸取管陣列接合。作為一個實例，本文示出的倉匣可以包括以對應(yīng)于多個試劑庫的構(gòu)造布置的多個清洗庫，由此清洗庫被配置為當試劑吸取器未與試劑庫接合時同時接合試劑吸取器，這樣清洗緩沖液可以從清洗庫被吸入到吸取器中。圖3A中示出了示例性實施方案，其示出了一行試劑孔401A。倉匣還包括一行對應(yīng)的孔401B，其在x維上相對于彼此保持相同的取向，但是在y維度上與孔 401A偏移。偏移孔401B可以包括清洗緩沖液，例如用于在使用一個倉匣后和在使用另一個倉匣前漂洗吸取管和流體管線。

可選地或另外地，空的或容納緩沖液、樣品或其他試劑的其他庫可以存在于倉匣上。另外的庫可以但不需要與吸取管相互作用。例如，庫可以被配置為在倉匣使用過程中充入廢棄物或溢出試劑或緩沖液。例如，這樣的庫可以經(jīng)過不與吸取管交接(interface)的端口到達。

為了便于倉匣庫與相應(yīng)的吸取管正確對準，對準槽可以定位在倉匣中。例如，在從一組庫中移出吸取管的陣列并且將其移位到另一組試劑或清洗庫的特定實施方案中，對準槽可以位于倉匣中以確保試劑吸取器陣列與一組或兩組庫正確對準。如圖3A示出的，示例性的倉匣包括對準槽404，其在x維上保持相同的取向，但是在y維上相對于對應(yīng)的對準槽403偏移。本文示出的實施方案的倉匣可以具有任何數(shù)量的對準槽，所述對準槽提供與流體組件的特征的合適的對準。例如，倉匣可以包括0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多個對準槽，其被配置為與流體系統(tǒng)的相應(yīng)對準銷接合，使得流體系統(tǒng)的試劑吸取器被定位成與試劑和/或清洗庫對準。

在圖3B中示出了示例性流體自動化模塊(FAM)。FAM 470可以包括用于使試劑倉匣升高和降低以刺穿和產(chǎn)生氣泡的升降組件471。傳送帶組件473在裝載倉匣期間移動試劑倉匣容器474，并且在卸載期間將試劑倉匣移動到設(shè)備外。廢棄物庫容器475也存在于FAM 470的正面，并且被配置為接受廢棄物庫476。FAM 470還包括歧管組件472，其在圖2B中更詳細地闡述。

本文提供了一種檢測裝置，其具有(a)包括一個或更多個顯微熒光計的箱體，其中每個顯微熒光計包括被配置用于寬場圖像檢測的物鏡，其中所述一個或更多個顯微光計被定位成在公用平面上獲取一個或更多個寬場圖像，并且其中每個寬場圖像來自所述公用平面的不同區(qū)域；(b)移位臺，其被配置為在平行于所述公用平面的至少一個方向上移動所述箱體；和(c)樣品臺，其被配置為在所述公用平面上容納基底。

本公開內(nèi)容的檢測裝置(或單個顯微熒光計)可以被用于以足以在微米級別上區(qū)分特征的分辨率獲得一個或更多個圖像。例如，在檢測裝置中使用的顯微熒光計可以具有足以區(qū)分間隔至多500μm、100μm、50μm、10 μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm的特征的分辨率。更低的分辨率也是可能的，例如區(qū)分間隔超過500μm的特征的分辨率。

本公開內(nèi)容的檢測裝置(或單個顯微熒光計)非常適合于表面的高分辨率檢測。因此，具有在微米范圍內(nèi)的平均間隔的特征的陣列是特別有用的基底。在特定實施方案中，檢測裝置或顯微熒光計可以被用于獲得陣列的一個或更多個圖像，所述陣列具有對于最近鄰居的中心距平均為或低于 500μm、100μm、50μm、10μm、5μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm 的特征。在許多實施方案中，陣列的特征是非連續(xù)的，例如間隔小于100 μm、50μm、10μm、5μm、1μm或0.5μm。然而，特征不需要被間隔。而是，陣列的一些或所有特征可以彼此連續(xù)。

可以使用本領(lǐng)域已知的多種陣列(也被稱為“微陣列”)中的任一種。典型的陣列包含特征，每個特征具有單個探針或探針群體。在后一種情況下，每個位點處的探針群體通常是同質(zhì)的，具有單一種類的探針。例如在核酸陣列的情況下，每個特征可以具有多個核酸種類，每個核酸種類具有共同的序列。然而，在一些實施方案中，陣列的每個特征處的群體可以是異質(zhì)的。類似地，蛋白質(zhì)陣列可以具有包括單個蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群體的特征，蛋白質(zhì)群體通常但不總是具有相同的氨基酸序列。探針可以例如通過探針與表面的共價連接或通過探針與表面的非共價相互作用連接到陣列表面。在一些實施方案中，探針諸如核酸分子，可以經(jīng)由例如US 2011/0059865 A1 中所述的凝膠層附接到表面，所述文獻通過引用并入本文。

示例性的陣列包括但不限于，可從Inc.(San Diego,CA)獲得的BeadChip陣列或其他陣列，諸如探針附接至存在于表面上的珠的那些 (例如，于表面上的孔中的珠)，諸如美國專利第6,266,459；6,355,431； 6,770,441；6,859,570或7,622,294號；或PCT公布第WO 00/63437號中描述的那些，其各自通過引用并入本文?？梢员皇褂玫氖惺劭傻玫奈㈥嚵械牧硗獾膶嵗ɡ?，微陣列或根據(jù)有時被稱為 VLSIPS^TM(超大規(guī)模固定化聚合物合成(Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis))技術(shù)的技術(shù)合成的其他微陣列。點陣微陣列(spotted microarray)也可以在根據(jù)本實用新型的一些實施方案的裝置或系統(tǒng)中使用。示例性的點陣微陣列是可從Amersham Biosciences獲得的CodeLink^TM陣列。另一個有用的微陣列是使用噴墨印刷方法制造的微陣列，所述噴墨印刷技術(shù)諸如可從Agilent Technologies獲得的SurePrint^TM技術(shù)。

其他有用的陣列包括在核酸測序應(yīng)用中使用的那些。例如，具有基因組片段的擴增子(通常稱為簇)的陣列尤其有用，諸如在Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和 US 2008/0108082中描述的那些，其每一個通過引用并入本文?？捎糜诤怂釡y序的另一個陣列類型是由乳液PCR技術(shù)產(chǎn)生的顆粒陣列。實例在 Dressman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145、US 2005/0130173或US 2005/0064460中描述，其每一個通過引用整體并入本文。盡管已經(jīng)在測序應(yīng)用的上下文中描述了以上陣列，將理解的是，可將這些陣列用于其他實施方案，包括例如不包括測序技術(shù)的實施方案。

無論是否被配置用于陣列或其他樣品的檢測，存在于檢測裝置中的一個或更多個顯微熒光計可以被配置用于寬場檢測。單個顯微熒光計的場直徑可以是例如至少0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm或更大。通過選擇適當?shù)墓鈱W部件，場直徑也可以被限制到最大面積，并且因此場直徑可以為例如不大于5mm、4mm、3mm、2mm或1mm。因此，在一些實施方案中，由單個顯微熒光計獲得的圖像可具有在0.25mm²至25mm²的范圍內(nèi)的面積。

除了被配置用于寬場檢測，顯微熒光計可以被配置為具有大于0.2的數(shù)值孔徑(NA)。例如，在本公開內(nèi)容的顯微熒光計中使用的物鏡的NA可以為至少0.2、0.3、0.4或0.5?？蛇x地或另外地，可能需要將物鏡的NA 限制為不大于0.8、0.7、0.6或0.5。當檢測經(jīng)由具有0.2和0.5之間的NA 的物鏡發(fā)生時，本文列出的方法和裝置特別有用。

在陣列檢測實施方案中，檢測裝置(或單個顯微熒光計)可以被配置為獲得陣列的數(shù)字圖像。通常，數(shù)字檢測裝置(或單個顯微熒光計)的每個像素將收集來自任何給定圖像采集中的不多于一個特征的信號。此配置使圖像的特征之間的不想要的“串流”最小化。檢測來自每個特征的信號的像素的數(shù)量可以基于被成像的特征的尺寸和形狀以及基于數(shù)字檢測裝置(或單個顯微熒光計)的配置調(diào)整。例如，可以用不超過約16像素、9像素、4像素或1像素檢測給定圖像中的每個特征。在特定實施方案中，每個圖像可以利用每個特征平均6.5像素、每個特征4.7像素或每個特征1像素。可以減少每個特征使用的像素的數(shù)量，例如通過減小陣列的樣式中特征的位置的可變性和收緊檢測裝置對陣列的對準的耐量。以被配置為每個特征使用少于4像素的數(shù)字檢測器為例，可以通過使用有序的核酸特征的陣列代替隨機分配的核酸簇的陣列改進圖像質(zhì)量。

將會理解，具有一個或更多個顯微熒光計的檢測裝置可以檢測大約相當于顯微熒光計的數(shù)量乘以每個顯微熒光計檢測的寬場面積的公用平面的面積。面積不需要是連續(xù)的。例如，2個或更多個顯微熒光計可以被定位以檢測被不檢測的面積間隔的公用平面的分散的區(qū)域。但是，如果需要，多個顯微熒光計可以被定位以檢測連續(xù)但不重疊的面積。在可選的實施方案中，具有一個或更多個顯微熒光計的檢測裝置可以檢測基本上小于顯微熒光計的數(shù)量乘以每個顯微熒光計檢測的寬場面積的公用平面的面積。這可以發(fā)生在，例如，當多個顯微熒光計被定位以檢測具有至少部分重疊的區(qū)域時。如本文中其他地方進一步詳細列出的，多個圖像不需要以被用于或甚至支持陣列或已被檢測的其他公用平面的完整圖像的重建的樣式采集。

檢測裝置可以使用于2013年2月13日遞交的并且題為“INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING”的美國專利申請序列號13/766,413 列出的任何檢測裝置配置和測序方法，其內(nèi)容通過引用整體并入。

本文提出的示例性檢測裝置示出為具有單個顯微熒光計。在其他實施方案中，檢測裝置可以以多種配置中的任何一種具有兩個或更多個顯微熒光計。將會理解，單個顯微熒光計從各種觀點來看可以是有利的。首先，單個顯微熒光計從生產(chǎn)和維護成本的角度提供了優(yōu)點，特別是當其他配置需要校準每個單獨的顯微熒光計時。在本文提出的單個顯微熒光計配置中，光學讀取頭可以呈現(xiàn)為完整單元，其可以以模塊化方式被并入到檢測裝置中，進一步簡化制造并降低成本。這些成本節(jié)省可以傳遞給最終用戶，允許用戶訪問大量的核酸陣列檢測應(yīng)用。本文提出的單個顯微熒光計配置的另一個優(yōu)點來自與系統(tǒng)的流體部件的相互作用的相對簡單性。例如，在系統(tǒng)中使用的流動池可以配置有單個流動通道，從而減少了對在現(xiàn)有系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的多個閥和泵的需求。雖然具有2個或更多個流動通道的流動池可能需要在不同流動通道之間切換流體流，但單個流動通道可以具有與單個閥流體連通的專用供應(yīng)管線。另外，可以使用具有單層通道的流體歧管主體，再次簡化了流體系統(tǒng)的設(shè)計和制造并降低了系統(tǒng)的制造和維護成本。

圖4A中示出了用于顯微熒光計500的示例性光學布局。顯微熒光計 500指向具有被流體填充通道675間隔的上層671和下層673的流動池 600。在所示出的配置中，上層671是光學透明的，并且顯微熒光計500 聚焦到上層671的內(nèi)表面672上的區(qū)域676。在可選配置中，顯微熒光計 500可以聚焦在下層673的內(nèi)表面674上。表面的一個或兩個可以包括待被顯微熒光計500檢測的陣列特征。

顯微熒光計500包括物鏡501，其被配置為將來自輻射源502的激發(fā)輻射導向流動池600并將來自流動池600的發(fā)射導向檢測器508。在示例性布局中，來自輻射源502的激發(fā)輻射穿過透鏡505，然后通過分光鏡506，然后通過物鏡到達流動池600。在示出的實施方案中，輻射源包括兩個發(fā)光二極管(LED)503和504，其產(chǎn)生彼此不同的波長的輻射。來自流動池 600的發(fā)射輻射被物鏡501捕獲，并且被分光鏡通過調(diào)節(jié)光學器件507反射到檢測器508(例如CMOS傳感器)。分光鏡506用于在與激發(fā)輻射的路徑正交的方向上引導發(fā)射輻射。物鏡的位置可以在z維上移動以改變顯微熒光計的焦點。顯微熒光計500可以在y方向上來回移動以捕獲流動池600 的上層671的內(nèi)表面672的幾個區(qū)域的圖像。

圖4B示出了用于展示各種光學部件的功能布置的目的的示例性顯微熒光計的分解圖。示出了兩個激發(fā)源，包括綠色LED(LEDG)和紅色LED (LEDR)。來自每個的激發(fā)光分別穿過綠色LED收集透鏡(L6)和紅色LED 收集透鏡(L7)。綠色激發(fā)輻射從綠色LED收集透鏡(L6)傳遞到組合器二向色性(combiner dichroic)(F5)，其通過激發(fā)濾光器(F2)反射綠色激發(fā)輻射，然后通過LED場透鏡(L8)和激光二極管分光鏡(F3)，然后通過激發(fā)場光闌 (FS)，然后通過激發(fā)投影透鏡組L2到激發(fā)/發(fā)射二向色性(F4)，其將綠色激發(fā)輻射通過物鏡組(L4)反射到流動池(FC)的表面。LED折疊鏡(M1)將紅色激發(fā)輻射反射到組合器二向色性(F5)，之后紅色激發(fā)輻射沿著與綠色激發(fā)輻射相同的路徑到達流動池(FC)的表面。如圖所示，通過上下(即沿著z維) 移動平移物鏡組(L4)來致動聚焦。來自流動池(FC)表面的發(fā)射通過平移物鏡組(L4)返回到激發(fā)/發(fā)射二向色性(F4)，所述激發(fā)/發(fā)射二向色性(F4)使發(fā)射輻射通過發(fā)射投影透鏡組(L1)通過發(fā)射濾光器然后到CMOS圖像傳感器 (S1)。激光二極管(LD)還通過激光二極管耦合的透鏡組(L5)導向激光二極管分光鏡(F3)，激光二極管分光鏡(F3)將激光二極管輻射反射通過激發(fā)場光闌(FS)、激發(fā)投影透鏡組(L2)、激發(fā)/發(fā)射二向色性(F4)、物鏡組(L4)到流動池(FC)。LED散熱器(HS)設(shè)置在綠色LED(LEDG)和紅色LED(LEDR)上方。

圖4C示出了單個相機模塊的示例性實施方案，包括用于自動聚焦系統(tǒng)的激光二極管(LD)、CMOS圖像傳感器(S1)和用于調(diào)節(jié)物鏡(L4)的Z級音圈馬達。LEDG和LEDR在此視圖中未顯示。

如圖4A、4B和4C的示例性實施方案所示，每個顯微熒光計可以包括分光鏡和檢測器，其中分光鏡被定位成將來自激發(fā)輻射源的激發(fā)輻射導向物鏡，并將發(fā)射輻射從物鏡導向檢測器。如圖中示出的，每個顯微熒光計可以任選地包括激發(fā)輻射源諸如LED。在這種情況下，每個顯微熒光計可以包括專用輻射源，使得讀取頭包括多個輻射源，每個輻射源被分離在單獨的顯微熒光計中。在一些實施方案中，兩個或更多個顯微熒光計可以從公用輻射源接收激發(fā)輻射。這樣，兩個或更多個顯微熒光計可以共享輻射源。在示例性配置中，單個輻射源可以將輻射導向分光鏡，該分光鏡被定位成將激發(fā)輻射分離成兩個或更多個束，并將束導向兩個或更多個相應(yīng)的顯微熒光計。另外地或可選地，激發(fā)輻射可以經(jīng)由一個或更多個光纖從輻射源導向一個、兩個或更多個顯微熒光計。

將理解，在圖中示出的特定部件是示例性的并且可以用類似功能的部件代替。例如，可以使用多個輻射源的任一個代替LED。特別有用的輻射源是弧光燈、激光、半導體光源(SLS)或激光二極管。LED可以從例如 Luminus(Billerica,Mass)購買。類似地，有用的多種檢測器包括但不限于電荷耦合設(shè)備(CCD)傳感器；光電倍增管(PMT’)；或互補金屬氧化物半導體(CMOS)傳感器。特別有用的檢測器是可從Aptina Imaging(San Jose,Ca) 獲得的5百萬像素CMOS傳感器(MT9P031)。

圖4A、4B和4C提供了包括兩個激發(fā)源的顯微熒光計的示例性實施方案。這種構(gòu)造可用于檢測分別在不同波長被激發(fā)的至少兩種熒光團。如果需要，顯微熒光計可以被配置為包括多于兩個的激發(fā)源。例如，顯微熒光計可以包括至少2個、3個、4個或更多個不同的激發(fā)源(即，產(chǎn)生彼此不同波長的源)?？蛇x地或另外地，分光鏡和光學過濾器可以被用于擴展可從單個輻射源獲得的激發(fā)波長的范圍。多個輻射源和/或分離激發(fā)束的光學過濾的類似使用可以被用于其中數(shù)個顯微熒光計共享來自一個或更多個輻射源的激發(fā)的實施方案。如本文別處進一步詳細說明的，多個激發(fā)波長的可用性對于利用幾種不同熒光團標記的測序應(yīng)用特別有用。

示例性實施方案的顯微熒光計是成像模塊的部件。圖5A示出了一個示例性實施方案的前視圖。示出了成像模塊700，其由安裝到固定基座704 的相機組件701、XY臺702和流動池閂鎖夾持模塊900組成。相機組件包括在相機外罩705上方的散熱器711，相機外罩705又安裝到固定基座704 并且提供圖4A、4B和4C中所示的顯微熒光計的下半部的外殼。兩個電機單獨提供X臺和Y臺的運動。X電機706驅(qū)動X導螺桿707，其如所示沿著X軸移動相機組件701。Y電機(712，未示出)驅(qū)動Y導螺桿708的運動，Y導螺桿708如所示地在導軌709上沿著Y軸移動流動池閂鎖夾持模塊900。流動池閂鎖夾持模塊900還可以包括用于檢測RFID編碼的流動池的RFID模塊710。

圖5B示出了成像模塊700的側(cè)視圖。示出了Y電機712、Y導螺桿 708、導軌709和X導螺桿707。

根據(jù)一個實施方案，提供了用于分析樣品的流體設(shè)備。流體設(shè)備包括具有入口端口和出口端口以及在它們之間延伸的流動通道的流動池。流動池被配置為容納感興趣樣品。流體設(shè)備還包括具有被構(gòu)造成接收流動池的接收空間的外罩。接收空間的尺寸和形狀適于允許流動池相對于外罩浮動。流體設(shè)備還包括偶聯(lián)至外罩的襯墊。襯墊具有入口通路和出口通路并且包括可壓縮材料。襯墊相對于接收空間定位，使得流動池的入口端口和出口端口分別與襯墊的入口通路和出口通路大致對準。

在另一個實施方案中，提供了一種可移除的倉匣，其被配置為保持并幫助用于成像的流動池的定位。所述倉匣包括可移除的外罩，所述可移除的外罩具有被配置為將流動池大致保持在目標平面(object plane)內(nèi)的接收空間。外罩包括面向相反方向的一對外罩側(cè)部。接收空間沿著至少一個外罩側(cè)部延伸，使得流動池通過所述至少一個外罩側(cè)部暴露于外罩的外部。倉匣還包括偶聯(lián)到外罩的蓋構(gòu)件并且包括襯墊。襯墊具有入口通路和出口通路并且包括可壓縮材料。襯墊被配置為當流動池由外罩容納時安裝在流動池的暴露部分上。

包括適用于本文所述設(shè)備的流動池的示例性流體設(shè)備在2013年2月 13日提交的并且題為“INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING”的美國專利申請序列號13/766,413中更詳細地闡述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

圖6示出了根據(jù)一個實施方案形成的流體設(shè)備800。如圖6所示，流體設(shè)備800包括倉匣(或流動池載體)802和流動池850。倉匣802被配置為容納流動池850并且協(xié)助定向流動池850用于成像對話。

在一些實施方案中，流體設(shè)備800和倉匣802可以是可移除的，使得倉匣802可以由個體或機器從成像系統(tǒng)(未示出)移出，而不損壞流體設(shè)備 800或倉匣802。例如，倉匣802可以被配置為重復插入到成像系統(tǒng)和從成像系統(tǒng)移出，而不損壞倉匣802或使倉匣802不適合于其預期目的。在一些實施方案中，流體設(shè)備800和倉匣802的尺寸和形狀可以被個人手持。此外，流體設(shè)備800和倉匣802的尺寸和形狀可以被調(diào)整以由自動化系統(tǒng)承載。

如圖6所示，倉匣802可包括外罩或載體框架804和耦合到外罩804 的蓋構(gòu)件806。圖6還示出了，流體設(shè)備800可以具有沿Z軸完全穿過倉匣802的設(shè)備窗。關(guān)于圖6，蓋構(gòu)件806可以包括彼此聯(lián)接的蓋主體840 和襯墊842。襯墊842包括彼此靠近定位的入口通路和出口通路846和844。在所示的實施方案中，蓋主體840和襯墊842共同模制成單一結(jié)構(gòu)。當形成時，蓋主體840和襯墊842可以具有不同的可壓縮性質(zhì)。例如，在特定實施方案中，襯墊842可以包括比蓋主體840的材料更可壓縮的材料。然而，在可選的實施方案中，蓋主體840和襯墊842可以是偶聯(lián)在一起(例如，機械地或使用粘合劑)的單獨部件。在其他實施方案中，蓋主體840和襯墊 842可以是單個連續(xù)結(jié)構(gòu)的不同部分或區(qū)域。

蓋構(gòu)件806可以可移動地偶聯(lián)到外罩804。例如，蓋構(gòu)件806可以可旋轉(zhuǎn)地偶聯(lián)到外罩804的基部構(gòu)件826。當蓋構(gòu)件806處于脫離位置時，外罩804可以限定可接近的倉匣腔。在一些實施方案中，識別發(fā)射器可以定位在倉匣腔內(nèi)。識別發(fā)射器被配置為向讀取器傳送關(guān)于流動池850的信息。例如，識別發(fā)射器可以是RFID標簽。由識別發(fā)射器提供的信息可以例如識別流動池850中的樣品、流動池或樣品的批號、制造日期和/或當流動池850插入到成像系統(tǒng)中時待被執(zhí)行的測定方案。識別發(fā)射器也可以傳送其他信息。

圖7A中示出了流動池閂鎖夾持模塊(FCLM)900(以下稱為閂鎖夾持模塊)，其直接安裝在XY臺702的Y平面上。流動池閂鎖夾持蓋901固定流動池800并使其與顯微熒光計中的相機對準。在夾持蓋901內(nèi)的是具有入口端口和出口端口944、946的歧管902，其被配置為與流動池外罩的襯墊中的入口通路846和出口通路844位置配合。加熱塊903被安裝到Y(jié) 平面并向流動池提供加熱以實現(xiàn)化學反應(yīng)?？梢园磯洪V鎖按鈕904以打開夾持蓋901。

圖7B示出了閂鎖夾持模塊900的剖視圖，示出了直接安裝到成像模塊Y平面702上的加熱塊903。圖7C示出了具有安裝在適當位置中的流動池850的閂鎖夾持模塊900。流動池基準邊807和808被偏置抵靠安裝到加熱塊的另一組定位銷(dowel pin)907和908。彈簧加載桿(spring-loaded lever)909使流動池850偏置抵靠加熱塊定位銷907和908。如示出的，流動池850在X和Y位置中相對于參考銷以及在Z位置中相對于加熱塊表面配準。流動池夾持模塊900提供流體密封，支持FAM和流動池襯墊之間的流體連接中的負壓和正壓。

圖7A、7B和7C中所示的實施方案是示例性的。在2013年2月13 日提交的并且題為“INTEGRATED OPTOELECTRONIC READ HEAD AND FLUIDIC CARTRIDGE USEFUL FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING”的美國專利申請序列號13/766,413中進一步詳細闡述了可選地或另外地用于圖7A、7B和7C的本公開內(nèi)容的方法和裝置的其它示例性實施方案，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。

在特定實施方案中，流體系統(tǒng)可以被配置為允許一種或更多種試劑的再利用。例如，流體系統(tǒng)可以被配置為向流動池遞送試劑、然后從流動池移出試劑和然后將該試劑再引入至流動池。一個配置在2014年8月7日遞交的并且題為“FLUIDIC SYSTEM FOR REAGENT DELIVERY TO A FLOW CELL”的美國專利申請序列號14/453,868中列出的裝置和方法中示例，其內(nèi)容通過引用整體并入。

本實用新型的流體系統(tǒng)和方法的實施方案對核酸測序技術(shù)特別有用。例如，可特別應(yīng)用的是合成測序(SBS)方案。在SBS中，監(jiān)測核酸引物沿著核酸模板的延伸以確定模板中核苷酸的序列。潛在的化學過程可以是聚合作用(例如，如被聚合酶催化)或連接(例如被連接酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS實施方案中，熒光標記的核苷酸以模板依賴模式被添加至引物(從而延伸引物)，以使得檢測添加至引物的核苷酸的順序和類型可被用來確定模板的序列。在可以區(qū)分針對不同模板發(fā)生的事件的條件下，可以在表面上對多個不同模板進行SBS技術(shù)。例如，模板可以存在于陣列的表面上，使得不同的模板在空間上彼此可區(qū)分。通常，模板出現(xiàn)在特征，每個特征具有相同模板的多個拷貝(有時稱為“簇(cluster)”或“聚落(colony)”)。然而，也可以在陣列上進行SBS，其中每個特征呈現(xiàn)單個模板分子，使得單個模板分子可以彼此分辨(有時稱為“單分子陣列”)。

流動池提供用于容納核酸陣列的方便的基底。流動池對于測序技術(shù)是方便的，因為所述技術(shù)通常包括在循環(huán)中重復遞送試劑。例如，為了啟動第一SBS循環(huán)，一個或更多個標記的核苷酸、DNA聚合酶等可流入/流經(jīng)容納核酸模板的陣列的流動池。使用例如本文列出的方法或裝置可以檢測引物延伸引起標記的核苷酸被摻入的那些特征。任選地，核苷酸還可以包括可逆終止特性，在核苷酸已被添加至引物后，其終止進一步的引物延伸。例如，具有可逆終止子部分的核苷酸類似物可被添加至引物，以使得隨后的延伸不能發(fā)生，除非遞送解封劑以移除該部分。因此，對于使用可逆終止的實施方案，可使解封劑遞送至流動池(在檢測發(fā)生之前或之后)。在多個遞送步驟之間可進行清洗。然后可以將該循環(huán)重復n次以將引物延伸n 個核苷酸，從而檢測長度為n的序列。示例性測序技術(shù)在例如Bentley等人，Nature 456：53-59(2008)、WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678； WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281 和US 2008/0108082中描述，其各自通過引用并入本文。

對于SBS循環(huán)的核苷酸遞送步驟，可以一次遞送單一類型的核苷酸，或可遞送多種不同的核苷酸類型(例如A、C、T和G一起)。對于其中每次僅存在單一類型的核苷酸的核苷酸遞送配置，不同的核苷酸不需要具有不同的標記，因為它們可以基于個體化遞送中固有的時間分離來區(qū)分。因此，測序方法或裝置可以使用單色檢測。例如，顯微熒光計或讀取頭僅需要在單個波長或單個波長范圍內(nèi)提供激發(fā)。因此，顯微熒光計或讀取頭僅需要具有單個激發(fā)源，并且激發(fā)的多頻帶過濾不需要是必需的。對于其中遞送導致多個不同核苷酸同時存在于流動池中的核苷酸遞送配置，可以基于連接到混合物中相應(yīng)核苷酸類型的不同熒光標記來區(qū)分摻入不同核苷酸類型的特征。例如，可以使用四種不同的核苷酸，每種具有四種不同熒光團中的一種。在一個實施方案中，可以使用在光譜的四個不同區(qū)域激發(fā)來區(qū)別四個不同的熒光團。例如，顯微熒光計或讀取頭可以包括四個不同的激發(fā)輻射源?？蛇x地，讀取頭可以包括少于四個不同的激發(fā)輻射源，但可以利用來自單個來源的激發(fā)輻射的光學過濾來在流動池形成不同范圍的激發(fā)輻射。

在一些實施方案中，可以使用少于四個不同顏色在樣品(例如核酸特征陣列)中檢測四個不同的核苷酸。作為第一個實例，可以在相同波長檢測一對核苷酸類型，但是基于該對的一個成員與另一個成員的強度差異區(qū)分或基于該對的一個成員的變化(例如，通過化學修飾、光化學修飾或物理修飾) 區(qū)分，其使得與對所述對的另一個成員檢測的信號相比，明顯的信號出現(xiàn)或消失。作為第二個實例，可以在特定條件下檢測四種不同核苷酸類型中的三種，而第四種核苷酸類型缺乏在那些條件下可檢測的標記。在第二個實例的SBS實施方案中，可以基于它們各自的信號的存在來確定前三種核苷酸類型向核酸的摻入，并且可以基于不存在任何信號確定第四種核苷酸類型向核酸的摻入。作為第三個實例，可以在兩個不同的圖像中或在兩個不同的通道中檢測一種核苷酸類型(例如，可以使用具有相同堿基但是不同標記的兩種物質(zhì)的混合物，或者可以使用具有兩個標記物的單個物質(zhì)，或者可以使用具有在兩個通道中檢測的標記的單一物質(zhì))，而在不超過一個圖像或通道中檢測其它核苷酸類型。在該第三個實例中，兩個圖像或兩個通道的比較用于區(qū)分不同的核苷酸類型。

上述段落中的三個示例性配置不是相互排斥的，并且可以以各種組合使用。示例性實施方案是使用具有熒光標記的可逆阻斷核苷酸(rbNTP)的 SBS方法。在這種形式中，四種不同的核苷酸類型可以被遞送到待被測序的核酸特征陣列，并且由于可逆阻斷基團，在每個特征處僅發(fā)生一個摻入事件。在該實例中遞送到陣列的核苷酸可以包括第一核苷酸類型、第二核苷酸類型、第三核苷酸類型和第四核苷酸類型，所述第一核苷酸類型在第一通道中檢測(例如具有在被第一激發(fā)波長激發(fā)時在第一通道中檢測的標記的rbATP)，所述第二核苷酸類型在第二通道中檢測(例如具有在由第二激發(fā)波長激發(fā)時在第二通道中檢測的標記的rbCTP)，所述第三核苷酸類型在第一和第二通道中檢測(例如具有在被第一和/或第二激發(fā)波長激發(fā)時在兩個通道中檢測的至少一個標記的rbTTP)，所述第四核苷酸類型缺乏在任一通道中檢測到的標記(例如沒有外源標記的rbGTP)。

在上述實例中，一旦四種核苷酸類型已經(jīng)與陣列接觸，就可以進行檢測程序，例如，以捕獲陣列的兩個圖像。圖像可以在單獨的通道中獲得，并且可以同時或依序獲得。使用第一激發(fā)波長和第一通道中的發(fā)射獲得的第一圖像將顯示摻入第一和/或第三核苷酸類型(例如A和/或T)的特征。使用第二激發(fā)波長和第二通道中的發(fā)射獲得的第二圖像將顯示摻入第二和/ 或第三核苷酸類型(例如C和/或T)的特征?？梢酝ㄟ^比較兩個圖像來確定在每個特征處摻入的核苷酸類型的明確鑒定，以得到以下：僅在第一通道中出現(xiàn)的特征摻入第一核苷酸類型(例如A)、僅在第二通道中出現(xiàn)的特征摻入第二核苷酸類型(例如C)、在兩個通道中出現(xiàn)的特征摻入第三核苷酸類型(例如T)和在任一通道中不出現(xiàn)的特征摻入第四核苷酸類型(例如G)。注意，在該實例中摻入G的特征的位置可以從其它循環(huán)(其中摻入其他三種核苷酸類型中的至少一種)確定。用于使用少于四種顏色的檢測來區(qū)分四種不同核苷酸的示例性裝置和方法在例如美國專利申請序列號第 61/538,294中描述，其通過引用并入本文。

在一些實施方案中，核酸可以在測序之前或測序期間被附接至表面并擴增。例如，擴增可以使用在表面上形成核酸簇的橋式擴增進行。有用的橋式擴增方法在例如，US 5,641,658；US 2002/0055100；US 7,115,400； US 2004/0096853；US 2004/0002090；US 2007/0128624或US 2008/0009420 中描述，其每個通過引用并入本文。用于擴增表面上的核酸的另一個有用的方法是滾環(huán)擴增(RCA)，例如在Lizardi等人,Nat.Genet.19:225-232(1998) 和US 2007/0099208A1中描述，其每個通過引用并入本文。還可以使用珠上的乳液PCR，例如如Dressman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145、US 2005/0130173或US 2005/0064460中描述的，其各自通過引用并入本文。

如以上列出的，測序?qū)嵤┓桨甘侵貜瓦^程的實例。本公開內(nèi)容的方法非常適用于重復過程。一些實施方案在以下和本文其他地方列出。

因此，本文提供了測序方法，所述測序方法包括：(a)提供流體系統(tǒng)，所述流體系統(tǒng)包括(i)包括光學透明表面的流動池，(ii)核酸樣品，(iii)用于測序反應(yīng)的多個試劑，和(iv)用于將試劑遞送至流動池的流體系統(tǒng)；(b) 提供檢測裝置，所述檢測裝置包括(i)多個顯微熒光計，其中每個顯微熒光計包括物鏡，所述物鏡被配置用于在圖像平面在X維和Y維進行寬場圖像檢測，和(ii)樣品臺；以及(c)在倉匣中進行核酸測序過程的流體操作和在檢測裝置中進行核酸測序過程的檢測操作，其中(i)試劑由流體系統(tǒng)遞送至流動池，(ii)核酸特征的寬場圖像由多個顯微熒光計檢測，以及(iii)至少一些試劑從流動池被移出到存儲庫。

貫穿本申請已參考多個出版物、專利和/或?qū)＠暾?。通過引用以其全文將這些出版物的公開內(nèi)容在此并入本申請。

在本文中術(shù)語包括意圖是開放式的，不僅包括提及的要素，另外還包括任何另外的要素。

已描述了很多實施方案。但是，將理解可進行多種改變。相應(yīng)地，其他的實施方案在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。