本發(fā)明屬于醫(yī)藥，具體涉及一種測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、重組人凝血因子viia（recombinant?human?clotting?factor?viia,?rfviia）是一種用于血友病患者的止血藥物，是一種維生素k依賴性糖蛋白，由406個(gè)氨基酸殘基組成，在結(jié)構(gòu)上與人血漿中純化獲得的活化ⅶ因子相似，體內(nèi)半衰期為2.5?h。rfviia可在損傷部位與組織因子（tissue?factor,tf）形成tf-rfⅶa復(fù)合物，同時(shí)激活血小板和凝血因子ⅹ（clotting?factor,?fⅹ），最終引起凝血酶的激活和纖維蛋白的沉積；另外，rfⅶa以低親和力結(jié)合在活化血小板表面，直接激活fⅹ進(jìn)而產(chǎn)生凝血酶。

2、目前，fda已批準(zhǔn)兩款rfviia產(chǎn)品上市，分別為1999年獲批的諾其和2020年獲批的sevenfact，國內(nèi)暫無上市的rfviia產(chǎn)品。在rfviia非臨床研究中，研究人員需在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行有效性及安全性評價(jià)?，F(xiàn)階段，rfviia在動(dòng)物體內(nèi)的藥物濃度僅可采用凝固法進(jìn)行檢測，缺少一種直接檢測該藥物蛋白濃度的方法。此外，市場上存在一些檢測fviia的檢測試劑盒或檢測抗體等產(chǎn)品，但是，這些檢測產(chǎn)品的檢測對象是人的血清、血漿等樣本，在用于人以外的動(dòng)物的檢測樣本時(shí)，難以將動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性的凝血因子viia區(qū)分出來，其測定的結(jié)果并不能代表rfviia藥物在動(dòng)物體內(nèi)的真實(shí)濃度。在rfviia非臨床研究中，使用市售的fviia檢測試劑盒，影響非臨床動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)及毒代動(dòng)力學(xué)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對rfviia產(chǎn)品的研發(fā)造成障礙。

3、在rfviia非臨床研究中，常用的模型動(dòng)物包括小鼠、大鼠、兔子、犬類和猴。其中猴在生理、生化和免疫學(xué)方面與人類最為接近，是研究藥物安全性和藥效學(xué)的理想模型。在區(qū)分不同來源凝血因子viia時(shí)，猴內(nèi)源性凝血因子viia與人凝血因子viia的區(qū)分存在著較大的難度。

4、因此，建立一種準(zhǔn)確檢測猴樣本中rfviia濃度的方法，對于rfviia的非臨床研究和rfviia產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種測定動(dòng)物樣本中rfviia蛋白濃度的elisa試劑盒及其檢測方法，目的在于更準(zhǔn)確地測定猴樣本中rfviia的濃度。

2、本發(fā)明提供一種測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒，所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒中包括以下重量份的組分：

3、檢測抗體?0.025-0.1份/孔、

4、樣本稀釋劑?475-1900份/孔、

5、標(biāo)記抗體?0.025-1份/孔；

6、所述標(biāo)記抗體的組成及重量份選自：

7、1）酶標(biāo)抗體?0.025-1份/孔、顯色底物?5-20份/孔；

8、或，2）熒光標(biāo)記抗體0.025-1份/孔；

9、所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒中還包括捕獲抗體，所述捕獲抗體為江萊生物生產(chǎn)的貨號為jl17268的人活化凝血因子viia包被板；所述檢測抗體為anti-factor?ⅶ?antibody，克隆編號為epr22364-119。

10、本發(fā)明提供一種測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒，所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的檢測試劑盒中包括以下重量份的組分：

11、檢測抗體?0.025-0.1份/孔、

12、樣本稀釋劑?950-3800份/孔、

13、標(biāo)記抗體?0.025-1份/孔；

14、顯色底物?5-20份/孔；

15、所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒中還包括捕獲抗體，所述捕獲抗體為江萊生物生產(chǎn)的貨號為jl17268的人活化凝血因子viia包被板；所述檢測抗體為anti-factor?ⅶ?antibody，克隆編號為epr22364-119；

16、所述標(biāo)記抗體為將標(biāo)記抗體干粉用0.5ml水溶解得到，所述標(biāo)記抗體干粉為jackson?immunoresearch生產(chǎn)的貨號為170935的酶標(biāo)抗體；所述顯色底物為市售的即用型elisa顯色液。

17、優(yōu)選的，所述樣本稀釋劑選自半胱氨酸、封閉劑、非離子型表面活性劑中的至少一種；所述封閉劑選自脫脂奶粉、牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠中的至少一種；所述非離子型表面活性劑選自吐溫20、曲拉通x-100中的至少一種。

18、優(yōu)選的，所述酶標(biāo)抗體選自經(jīng)過酶標(biāo)記且用于與所述檢測抗體特異性結(jié)合的抗體中的至少一種；所述熒光標(biāo)記抗體選自經(jīng)過熒光基團(tuán)標(biāo)記且用于與所述檢測抗體特異性結(jié)合的抗體中的至少一種。

19、優(yōu)選的，所述酶標(biāo)記選自辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或生物素標(biāo)記中的至少一種；

20、和/或，所述顯色底物選自3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、鄰苯二胺、3,3'-二氨基聯(lián)苯胺、quantablu熒光底物、quantared?增強(qiáng)型化學(xué)熒光底物、對硝基苯磷酸酯、葡萄糖中的至少一種；

21、或，所述熒光基團(tuán)選自alexa?fluor熒光基團(tuán)、brilliant?violet熒光基團(tuán)、cyanine熒光基團(tuán)、異硫氰酸熒光素基團(tuán)、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、rhodamine?red-x、氨基甲基香豆素醋酸酯中的至少一種。

22、優(yōu)選的，所述檢測抗體和標(biāo)記抗體的工作溶液為含4.?5-5.?5g/ml封閉劑、0.045-0.055%體積分?jǐn)?shù)的非離子型表面活性劑的水溶液；所述封閉劑選自脫脂奶粉、牛血清白蛋白、酪蛋白、明膠中的至少一種；所述非離子型表面活性劑選自吐溫20、曲拉通x-100中的至少一種。

23、優(yōu)選的，所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的檢測試劑盒中還包括洗滌液、終止液；所述洗滌液為包含體積分?jǐn)?shù)為0.045-0.055%非離子型表面活性劑的水溶液；所述終止液為0.2-0.5m的硫酸或鹽酸溶液。

24、應(yīng)用上述任一項(xiàng)所述測定動(dòng)物樣本中rfviia濃度的elisa試劑盒進(jìn)行非診斷目的的檢測方法，

25、步驟1，將待測動(dòng)物樣本離心，取上清，然后將待測上清與樣本稀釋劑混合，配制為待測樣本；

26、步驟2，將待測樣本依次分別與捕獲抗體、檢測抗體、標(biāo)記抗體孵育；

27、步驟3，測定產(chǎn)物的紫外吸收信號或熒光信號。

28、優(yōu)選的，步驟1所述配制為待測樣本后，10-30?℃，270-500?rpm條件下平衡40min-60?min。

29、優(yōu)選的，步驟1中所述動(dòng)物樣本為動(dòng)物的血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞裂解液中的至少一種；

30、和/或，步驟1中待測上清與樣本稀釋劑按照體積比為22.5-27.5:1混合；

31、和/或，步驟2中所述孵育條件為10-30?℃、270-500?rpm，與捕獲抗體孵育的時(shí)間為2?h?±20?min，與檢測抗體孵育的時(shí)間為1.5?h±10?min；步驟2中所述標(biāo)記抗體為酶標(biāo)抗體、顯色底物時(shí)，與酶標(biāo)抗體孵育的時(shí)間為1?h?±5?min，與顯色底物孵育的時(shí)間為15-35min；步驟2中所述標(biāo)記抗體為熒光標(biāo)記抗體時(shí)，與熒光標(biāo)記抗體孵育的時(shí)間為1?h?±5min；

32、和/或，步驟3中所述紫外吸收信號為450nm、405nm或492nm處的紫外吸收信號。

33、本發(fā)明通過篩選捕獲抗體和檢測抗體的組合等檢測試劑，構(gòu)建elisa試劑盒，進(jìn)一步優(yōu)化檢測條件，本發(fā)明的elisa試劑盒用于檢測猴血漿中的rfviia的濃度。本發(fā)明提供的方法線性關(guān)系良好，且不存在內(nèi)源性凝血因子干擾，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性滿足要求，可用于動(dòng)物血漿中rfviia的檢測。本發(fā)明的elisa試劑盒及其檢測方法在檢測動(dòng)物樣本中rfviia的濃度方面具有前景，為rfviia的非臨床研究和rfviia產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持。

34、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

35、以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。