一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法
【專利說(shuō)明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于環(huán)境毒理學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
環(huán)境毒理學(xué)是指利用毒理學(xué)方法從醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的角度研宄環(huán)境中有害物質(zhì)對(duì)人類及其他物種、生態(tài)環(huán)境造成的影響及潛在危害的學(xué)科。通過(guò)對(duì)環(huán)境污染物的生物效應(yīng)、作用機(jī)制及損傷類型進(jìn)行研宄，對(duì)該污染物的環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定，為該污染物的環(huán)境治理方法及過(guò)程提供科學(xué)依據(jù)。
[0003]該學(xué)科主要通過(guò)觀察和檢測(cè)環(huán)境污染物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒理學(xué)效應(yīng)來(lái)評(píng)估該污染物的損傷和作用機(jī)理，確定該污染物造成生物體不同損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系，制定環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并確定該污染物的清理方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相對(duì)復(fù)雜，個(gè)體水平的生物學(xué)變化更加難以檢測(cè)。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在污染物對(duì)機(jī)體損傷的研宄中更具有現(xiàn)實(shí)意義，能夠更好地評(píng)估環(huán)境污染物的劑量閾值，確定其作用的靶器官及作用機(jī)理；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還可評(píng)估自然水體環(huán)境中多種污染物共同作用條件下對(duì)生物體相互協(xié)同、拮抗作用的方式，完善人們對(duì)有毒物質(zhì)作用于生命體危害的程度及作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
[0004]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01310101778.7，申請(qǐng)日為2013年03月27日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:一種有機(jī)農(nóng)藥檢測(cè)用高通量微流控裝置及其水樣檢測(cè)方法，所述的模型結(jié)構(gòu)中設(shè)置有水樣取樣模塊、有機(jī)農(nóng)藥微流控模塊及拉曼光譜檢測(cè)模塊；該申請(qǐng)案采用的模型是使用拉曼光譜技術(shù)研宄水樣中有機(jī)農(nóng)藥的污染情況檢測(cè)，未曾考慮該農(nóng)藥的毒理學(xué)效應(yīng)、劑量效應(yīng)及其與水樣中其他污染物相互作用對(duì)毒理學(xué)產(chǎn)生的影響。中國(guó)專利號(hào)201310546068.5，申請(qǐng)日為2013年11月06日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:環(huán)境水樣中PFOS的熒光快速檢測(cè)方法，該專利利用PFOS與化學(xué)試劑相互作用，產(chǎn)生在280 nm處有發(fā)射光的熒光物質(zhì)，建立此熒光值與水樣中PFOS含量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而檢測(cè)環(huán)境水樣中PFOS的含量。該方法可快速檢測(cè)水樣中PFOS的含量，但只針對(duì)了這一種污染物且沒(méi)有相關(guān)毒理學(xué)效應(yīng)評(píng)估檢測(cè)。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01210346777.4，申請(qǐng)日為2012年09月19日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:一種檢測(cè)水樣雙酚A的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測(cè)方法，該申請(qǐng)是利用抗原抗體的特異性相互作用，將雙酚A抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、反應(yīng)終止液及底物等制成方便使用的試劑盒，通過(guò)簡(jiǎn)單的操作，高靈敏度地檢測(cè)雙酚A的環(huán)境濃度。該專利同樣是針對(duì)單一物質(zhì)的環(huán)境水平檢測(cè)，并未評(píng)價(jià)雙酚A環(huán)境毒理效應(yīng)，及其在環(huán)境中的迀移轉(zhuǎn)化過(guò)程和物理化學(xué)性質(zhì)的變化對(duì)其毒理效應(yīng)的影響。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01210235805.5，申請(qǐng)日為2012年07月09日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:毒理基因組學(xué)指數(shù)預(yù)警飲用水源水致癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，該申請(qǐng)是利用基因芯片技術(shù)，根據(jù)美國(guó)EPA對(duì)人體致癌風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)閾值，計(jì)算飲用水涉癌毒理基因組學(xué)指數(shù)值，評(píng)價(jià)水源水的致癌風(fēng)險(xiǎn)度。該專利是針對(duì)可導(dǎo)致人類癌癥的污染物環(huán)境水平檢測(cè)，且基因芯片技術(shù)及小鼠養(yǎng)殖成本高昂，水樣暴露后的小鼠處理復(fù)雜，RNA提取、cDNA合成及分子雜交過(guò)程操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。
[0005]由此可見(jiàn)，針對(duì)多種類、多價(jià)態(tài)混合物共存的環(huán)境水樣的毒理學(xué)效應(yīng)個(gè)體水平的評(píng)價(jià)，缺乏適當(dāng)?shù)难绣硨?duì)象和相應(yīng)的研宄方法，作為指導(dǎo)環(huán)境水樣污染物毒理學(xué)評(píng)估的重要參照。因此研制一種簡(jiǎn)單有效、快速地評(píng)價(jià)環(huán)境水樣毒理學(xué)效應(yīng)的方法，且可同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水樣的生殖毒理、氧化壓力和應(yīng)激及DNA損傷水平的變化，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。本發(fā)明正是針對(duì)上述問(wèn)題，著重圍繞環(huán)境水樣毒理學(xué)效應(yīng)檢測(cè)方面進(jìn)行了改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]
發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于環(huán)境水樣個(gè)體水平毒理學(xué)效應(yīng)評(píng)價(jià)的檢測(cè)方法及DNA損傷和氧化應(yīng)激相關(guān)評(píng)價(jià)方法的不足，提供了一種快速檢測(cè)環(huán)境水樣毒理學(xué)效應(yīng)的方法。通過(guò)使用不同品系的秀麗隱桿線蟲(chóng)作為研宄對(duì)象，采用不同的染色試劑可對(duì)環(huán)境水樣的生殖毒理、氧化壓力和應(yīng)激及DNA損傷進(jìn)行快速檢測(cè)，解決了以往環(huán)境水樣毒理學(xué)評(píng)價(jià)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高及檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜的問(wèn)題。
[0007]技術(shù)方案
為實(shí)現(xiàn)上述檢測(cè)目的，本發(fā)明的技術(shù)步驟具體為:
步驟一、環(huán)境水樣的滅菌處理
使用0.22 ym的微孔濾膜，放置在對(duì)應(yīng)尺寸的濾器中間，將組裝好的濾器進(jìn)行121攝氏度20分鐘的滅菌處理，再對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行過(guò)濾處理；其中，為保證水樣的滅菌效果，所使用的濾膜為兩片；為保證線蟲(chóng)的生長(zhǎng)狀態(tài)，水樣的過(guò)濾過(guò)程盡量在無(wú)菌的條件下操作；為驗(yàn)證水樣的滅菌步驟，在過(guò)濾后應(yīng)檢查濾膜的完整情況，如破損需重新過(guò)濾。
[0008]步驟二、秀麗隱桿線蟲(chóng)的培養(yǎng)過(guò)程
將秀麗隱桿線蟲(chóng)(似、/^7似?、使用同步化試劑處理(5 mo I/L NaOH,NaClO)的方法進(jìn)行同步化處理，在同步化處理24小時(shí)后，觀察線蟲(chóng)的卵，有95%以上的卵發(fā)育至LI期幼蟲(chóng)時(shí)，將其分別接入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的鋪有NGM及0P50的平皿中，以16-25攝氏度的恒溫培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行48-72小時(shí)的培養(yǎng)，線蟲(chóng)發(fā)育至L4幼蟲(chóng)期。
[0009]步驟三、環(huán)境水樣的生物樣品暴露過(guò)程
在線蟲(chóng)成長(zhǎng)至L4期且環(huán)境水樣已完成滅菌處理之后，將線蟲(chóng)通過(guò)4500-6000 rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心后轉(zhuǎn)移到環(huán)境水樣中，對(duì)照組轉(zhuǎn)入同樣體積的蒸餾水中，并分別加入1-2%體積的大腸桿菌0P50作為食物，再次進(jìn)行4500-6000 rpm的離心，通過(guò)虹吸作用將線蟲(chóng)和水樣吸到毛細(xì)玻璃管中，保持3.5-6.0 cm的毛細(xì)管水樣高度，通過(guò)使用0.5-2%的瓊脂糖進(jìn)行兩端的密封，進(jìn)行12-24小時(shí)的暴露處理。
[0010]步驟四、熒光顯微鏡和微分干涉相差顯微鏡的毒理學(xué)測(cè)定
在暴露過(guò)程結(jié)束后準(zhǔn)備兩個(gè)載玻片，分別在其中心滴一滴20-200 ymol/L的NaN3S液，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到該溶液中進(jìn)行麻醉，使用蓋玻片蓋上，等待3-5分鐘線蟲(chóng)進(jìn)入麻醉狀態(tài)。使用熒光顯微鏡對(duì)野生型線蟲(chóng)體內(nèi)生殖腺細(xì)胞的亮點(diǎn)聚集情況、野生型線蟲(chóng)CM-DCFDA染色后體內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度、系線蟲(chóng)的熒光物質(zhì)分布情況和￠7755??系的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，使用微分干涉相差功能對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)各器官的情況進(jìn)行觀察。通過(guò)兩種功能的共定位確定環(huán)境水樣作用于線蟲(chóng)的毒理學(xué)過(guò)程。
[0011]有益效果本發(fā)明所表述的實(shí)驗(yàn)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn):
本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)使用體積小、通體透明、遺傳背景清楚的秀麗隱桿線蟲(chóng)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，所需水樣量小，只需要2 μ L水樣即可完成毒理學(xué)檢測(cè)，解決了以往污染物毒理學(xué)研宄中廢液量多處理難及廢液可能造成的二次污染問(wèn)題。線蟲(chóng)培養(yǎng)簡(jiǎn)單，同時(shí)還降低了成本。解決了以往使用小鼠等個(gè)體水平檢測(cè)毒理學(xué)變化評(píng)價(jià)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜等問(wèn)題；
本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)選擇不同品系的線蟲(chóng)，可以完成不同檢測(cè)終點(diǎn)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)，使得該方法能夠在生殖毒理、氧化應(yīng)激水平及氧化壓力、DNA損傷及修復(fù)等多個(gè)毒理學(xué)檢測(cè)中得到應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)選擇內(nèi)徑在50-85 ym之間的玻璃毛細(xì)管，使得檢測(cè)所需的水樣量極小(2 yL)保證了 L4期線蟲(chóng)能夠正常進(jìn)入毛細(xì)管，而又不會(huì)重疊導(dǎo)致密度過(guò)大，同時(shí)，還可以直接在毛細(xì)管中觀察線蟲(chóng)的行為及各器官的形態(tài)，使得實(shí)驗(yàn)最后的檢測(cè)步驟可以進(jìn)一步優(yōu)化。
[0013]本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)在玻璃毛細(xì)管的兩端添加0.5-2%的瓊脂層，保證了水樣不會(huì)由于蒸發(fā)造成其所含物質(zhì)的濃度變化，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；同時(shí)線蟲(chóng)對(duì)乏氧環(huán)境的耐受極強(qiáng)，保證了線蟲(chóng)在水樣中的暴露狀態(tài)，確保實(shí)驗(yàn)的精確性。
[0014]本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，通過(guò)選擇顯微鏡的熒光功能和微分干涉相差功能，能夠?qū)崿F(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)熒光強(qiáng)度和分布的同時(shí)觀察，從而確定環(huán)境水樣在個(gè)體水平損傷中主要的靶器官，使實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果更加系統(tǒng)和精確。
[0015]本發(fā)明所表述的一種基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣毒理學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果系統(tǒng)清楚。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明檢測(cè)環(huán)境水樣毒理學(xué)效應(yīng)的示意圖；
圖2為實(shí)施例1中使用熒光顯微鏡檢測(cè)線蟲(chóng)生殖腺細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的熒光圖；
圖3為實(shí)施例2中使用熒光顯微鏡檢測(cè)線蟲(chóng)氧化壓力的熒光圖；
圖4為實(shí)施例3中使用熒光顯微鏡檢測(cè)線蟲(chóng)體內(nèi)SOD-3表達(dá)量的熒光圖；
圖5為實(shí)施例4中使用熒光顯微鏡檢測(cè)線蟲(chóng)DNA損傷情況的熒光圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為進(jìn)一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容，實(shí)施例以0.5 mM雙氧水為處理水樣，以下結(jié)合圖例對(duì)本發(fā)明的具體步驟做詳細(xì)描述。
[0018]實(shí)施例1:基于秀麗隱桿線蟲(chóng)的微量水樣生殖腺細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法