一種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞成像領(lǐng)域，尤其涉及一種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 與早期的成像系統(tǒng)相比，活細(xì)胞的3D成像呈現(xiàn)了細(xì)胞及其組分的更詳細(xì)、也更準(zhǔn) 確的空間視圖。技術(shù)進(jìn)步讓3D成像成為許多應(yīng)用的重要工具，如細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、 神經(jīng)科學(xué)以及癌癥研究。當(dāng)前的技術(shù)比以往更加準(zhǔn)確，能實(shí)時(shí)給出數(shù)據(jù)，幾乎不需要細(xì)胞制 備?，F(xiàn)有技術(shù)的單細(xì)胞三維方法主要有以下幾種：
[0003] 1、激光掃描共聚焦顯微鏡：利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)細(xì)胞內(nèi)焦平面的 每一點(diǎn)掃描，細(xì)胞上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管（PMT)或 冷電耦器件（cCCD)逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔 與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共輒的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔， 焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是細(xì)胞的光學(xué)橫斷面。激 光掃描共聚焦顯微鏡通過對(duì)同一細(xì)胞不同層面的實(shí)時(shí)掃描成像，進(jìn)行圖像疊加可構(gòu)成細(xì)胞 的三維結(jié)構(gòu)圖像。
[0004] 2、白色光衍射斷層掃描成像技術(shù)：該技術(shù)能夠?yàn)橥该鳂颖救缁罴?xì)胞和未標(biāo)記的細(xì) 胞成像，基于傳統(tǒng)顯微鏡和白光，在細(xì)胞的自然狀態(tài)下提供高分辨率的3D渲染圖像。物鏡 鏡頭掃描細(xì)胞的整個(gè)軸向焦面，產(chǎn)生一疊相位分辨圖像，然后通過sparse反卷積算法重建 物體的三維結(jié)構(gòu)。能得到350nm的側(cè)向分辨率以及900nm的軸向分辨率。
[0005] 3、晶格光片顯微鏡：晶格光片顯微鏡有兩個(gè)正交的鏡頭；一個(gè)鏡頭將光聚焦產(chǎn)生 一條非常細(xì)的筆狀光源，照射在有螢光分子的生物樣品，產(chǎn)生熒光；另一個(gè)采用寬場(chǎng)成像收 集熒光，由面掃描以快速取得3D高清晰度生物影像。依靠空間光調(diào)制器同時(shí)形成100多 條筆狀的光束，來增加掃描速度，降低對(duì)生物樣品的傷害；而且能控制每條光束的距離及形 狀。
[0006] 但上述方法均存在不足：
[0007] 第一種方式需要專用的設(shè)備，成本太高；且會(huì)產(chǎn)生光毒作用：在激光照射下，許多 熒光染料分子會(huì)產(chǎn)生單態(tài)氧或自由基等細(xì)胞毒素，限制掃描時(shí)間、激發(fā)光強(qiáng)度，以保持樣品 的活性；標(biāo)記染料的光漂白：為了獲得足夠的信噪比必須提高激光的強(qiáng)度；而高強(qiáng)度的激 光會(huì)使染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色。
[0008] 第二種方式不適用于非半透明樣本，對(duì)于樣本的要求比較高；需要專用設(shè)備，成本 過高；成像靈活度低。
[0009] 第三種方式設(shè)備成本過高；需要對(duì)樣本進(jìn)行熒光處理，降低了可操作性；光毒作 用依然存在。
[0010] 因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于光流分析的單細(xì)胞三 維圖像生成方法，旨在解決現(xiàn)有的細(xì)胞三維圖像生成方法成本高、有光毒作用、條件苛刻等 問題。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0013] -種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，包括步驟：
[0014] A、制作光誘導(dǎo)介電泳芯片，所述光誘導(dǎo)介電泳芯片有三層結(jié)構(gòu)組成：有三層結(jié)構(gòu) 組成：下層為涂有氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層的ITO玻璃，在上下兩層 ITO玻璃之間封裝有一個(gè)微流體通道，用于注射所需操作的溶液；
[0015] B、將細(xì)胞和溶液注射到微流體通道，并向上下兩層ITO玻璃的電極輸入可變頻率 的交流信號(hào)，同時(shí)利用入射光照射所述光誘導(dǎo)介電泳芯片，從而在被照射的區(qū)域產(chǎn)生非均 勻電場(chǎng)；
[0016] C、改變交流信號(hào)的頻率及大小，以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向，同時(shí)采集細(xì)胞的圖像；
[0017] D、對(duì)采集的圖像進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行特征提取以及速度計(jì)算，最后重構(gòu)3D細(xì)胞 圖像。
[0018] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，所述步驟A中，制作光誘 導(dǎo)介電泳芯片的步驟具體包括：
[0019] AU清理ITO玻璃基質(zhì)；
[0020] A2、在ITO玻璃基質(zhì)上沉積氫化非晶硅涂層；
[0021] A3、在氫化非晶硅涂層上涂光刻膠；
[0022] A4、在光刻膠上進(jìn)行板??；
[0023] A5、接觸腐蝕至ITO玻璃基質(zhì)；
[0024] A6、去除光刻膠；
[0025] A7、在ITO玻璃基質(zhì)上未覆蓋氫化非晶硅涂層的區(qū)域涂導(dǎo)電粘合劑。
[0026] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，所述細(xì)胞在非均勻電場(chǎng) 中的所受到的平均介電泳力用如下公式描述：
[0028] 其中Fdep是作用到細(xì)胞上的平均介電泳力，R是細(xì)胞的半徑，ε |〇是細(xì)胞所在溶液 的介電常數(shù)，Ems為所施加交流信號(hào)的均方根值，f eM為Clausius-Mossotti因子，在計(jì)算平 均介電泳力時(shí)取該因子的實(shí)部Re [fCM]。
[0029] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，f?因子定義如下：
[0031] ￡療和en*分別是細(xì)胞和溶液的復(fù)介電常數(shù)。
[0032] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，所述復(fù)介電常數(shù)可表示 為：
[0034] 其中，ε是溶液的介電常數(shù)，σ是導(dǎo)電率，ω是所施加交流信號(hào)的頻率。
[0035] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，細(xì)胞旋轉(zhuǎn)速度為：
[0037] 其中E是電場(chǎng)強(qiáng)度，η是溶液的黏稠度，頂[fCM]是Clausius-Mossotti因子的虛 部，K為系數(shù)。
[0038] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，所述預(yù)處理包括：高斯濾 波處理、亮度調(diào)整及模板匹配。
[0039] 所述的基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，其中，所述步驟D中，使用機(jī)器 學(xué)習(xí)算法對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行最大似然估計(jì)，按下式最小化的參數(shù)取值：
[0041] 其中Ii+1是細(xì)胞旋轉(zhuǎn)圖像序列I = {I i, i = 1，…，η}中的一幀，M代表細(xì)胞上所有 點(diǎn)的集合，民和T 別是旋轉(zhuǎn)矩陣和平移向量，R 是細(xì)胞上一點(diǎn)m從i時(shí)刻到i+Ι時(shí) 刻的三維旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)模型，即m1+1，映射/ = {/(#)，# e 丨是將細(xì)胞在i時(shí)刻的三維信息投 影到細(xì)胞旋轉(zhuǎn)圖像的某一幀L。
[0042] 有益效果：本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)通過顯微視覺算法實(shí)現(xiàn)的增強(qiáng)光誘導(dǎo) 介電泳可操控平臺(tái)的反饋控制功能；2)采用基于光流場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞三維 運(yùn)動(dòng)的跟蹤，從而完成細(xì)胞動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù)估計(jì)；3)通過控制單個(gè)細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)，獲取細(xì) 胞二維圖像序列，利用最大似然估計(jì)方法實(shí)現(xiàn)基于可控單細(xì)胞的二維圖像序列的細(xì)胞的三 維圖像生成技術(shù)。本發(fā)明的方法，其所用設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低，不會(huì)產(chǎn)生光毒作用，對(duì)樣本的要 求也較低，提高了可操作性。
【附圖說明】
[0043]圖1為本發(fā)明一種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法較佳實(shí)施例的流程 圖。
[0044] 圖2為本發(fā)明中光誘導(dǎo)介電泳平臺(tái)的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 本發(fā)明提供一種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法，為使本發(fā)明的目的、 技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的 具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0046] 請(qǐng)參閱圖1，圖1為本發(fā)明一種基于光流分析的單細(xì)胞三維圖像生成方法較佳實(shí) 施例的流程圖，如圖所示，其包括步驟：
[0047] S100、制作光誘導(dǎo)介電泳芯片（0DEP芯片），所述光誘導(dǎo)介電泳芯片有三層結(jié)構(gòu)組 成：下層為涂有氫化非晶硅涂層的ITO玻璃，上層是不含涂層（即不含氫化非晶硅涂層）的 ITO玻璃，在上下兩層ITO玻璃之間封裝有一個(gè)微流體