本公開(kāi)提供了與煙草植物相關(guān)的組合物和方法。具體而言，本公開(kāi)提供了用于生產(chǎn)具有低煙堿類生物堿含量的煙草植物和任何相關(guān)煙草產(chǎn)品的新方法。與天然存在的和轉(zhuǎn)基因的煙草植物相比，根據(jù)本公開(kāi)的方法生產(chǎn)的煙草植物表現(xiàn)出減少的煙堿類生物堿(例如，煙堿)的水平，并因此代表了目前可獲得的煙草品種的具有商業(yè)價(jià)值的替代品。

背景技術(shù)：

1、煙堿通常是煙草(nicotiana?tabacum?l)產(chǎn)生的最豐富的吡啶生物堿，盡管由于編碼煙堿去甲基化酶的基因活性增加，降煙堿可在一些植物中占主導(dǎo)地位(sisson和saunders，1982；lewis等人，2010)。由于煙堿有助于香煙的成癮性，一些公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)建議可能強(qiáng)制降低這些產(chǎn)品中的煙堿水平的研究，以減少人暴露于煙草煙霧相關(guān)毒物(美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局，201?8)。世界衛(wèi)生組織(who)建議將香煙煙草的煙堿水平減少至0.4mgg-1或以下的據(jù)報(bào)告為非成癮性的水平(who，201?5)。這代表與目前香煙煙草中存在的水平相比減少大約95％。不存在常規(guī)表現(xiàn)出此類超低的葉片煙堿積累水平的可商購(gòu)獲得的煙草栽培品種(lewis，2018)。因此，煙草界的一些人對(duì)開(kāi)發(fā)具有低于提議的耐受閾值水平的煙堿水平的新栽培品種感興趣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開(kāi)的實(shí)施方案包括煙草栽培品種或其任何部分，所述煙草栽培品種或其任何部分包含與對(duì)應(yīng)的天然存在的煙草植物或其部分相比減少的至少一種煙堿類生物堿的水平。

2、在一些實(shí)施方案中，栽培品種是非轉(zhuǎn)基因的。

3、在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿選自由煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿組成的組。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.35％的煙堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是降煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.04％的降煙堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是新煙草堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.06％的新煙草堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是假木賊堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.008％的假木賊堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是煙堿和降煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.35％的煙堿和不超過(guò)0.04％的降煙堿。

4、在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含與野生型nic1相比具有減少的表達(dá)和/或功能的nic1等位基因。在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含與野生型nic2相比具有減少的表達(dá)和/或功能的nic2等位基因。在一些實(shí)施方案中，nic1等位基因和/或nic2等位基因衍生自以下品系中的至少一種：lafc53、mafc5、lmafc34、la?burley?21、li?burley21和hi?burley?21。

5、在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含功能性cyp82e2等位基因。在一些實(shí)施方案中，cyp82e2等位基因衍生自林煙草(n.sylvestris)。在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含功能性cyp82e3等位基因。在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因衍生自絨毛狀煙草(n.tomentosiformis)(或相關(guān)物種，例如來(lái)自煙草屬絨毛煙草組(nicotiana?sectiontomentosae))。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的煙草植物相比，由cyp82e2等位基因和/或cyp82e3等位基因編碼的蛋白質(zhì)的煙堿n-去甲基化活性增加。

6、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括從本文所述的任何煙草栽培品種產(chǎn)生的后代植物、種子或細(xì)胞。

7、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括衍生自本文所述的任何煙草栽培品種或其部分的煙草產(chǎn)品。

8、在一些實(shí)施方案中，煙草產(chǎn)品選自由煙葉、煙絲(shredded?tobacco)、生切煙絲(cut?tobacco)、煙草末、煙草粉、煙草提取物、無(wú)煙煙草、濕鼻煙或干鼻煙、煙斗煙草、雪茄煙草、小雪茄煙草、香煙煙草和嚼用煙草組成的組。

9、在一些實(shí)施方案中，煙草產(chǎn)品選自由小雪茄、丁香香煙、不通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、雪茄、鼻煙、含煙草口香糖、含煙草含片和嚼用煙草組成的組。

10、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括生產(chǎn)煙草栽培品種的方法，所述煙草栽培品種包含與對(duì)應(yīng)的天然存在的煙草植物或其部分相比減少的水平的至少一種煙堿類生物堿。根據(jù)這些實(shí)施方案，所述方法包括將包含第一低煙堿性狀的第一煙草品種與包含第二低煙堿性狀的第二煙草品種雜交以產(chǎn)生后代植物。在一些實(shí)施方案中，后代植物包含減少的濃度的至少一種煙堿類生物堿。

11、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括回交。

12、在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿選自由煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿組成的組。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.35％的煙堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是降煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.04％的降煙堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是新煙草堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.06％的新煙草堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是假木賊堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.008％的假木賊堿。在一些實(shí)施方案中，至少一種煙堿類生物堿是煙堿和降煙堿，并且其中所述栽培品種包含不超過(guò)0.35％的煙堿和不超過(guò)0.04％的降煙堿。

13、在一些實(shí)施方案中，第一低煙堿性狀和/或第二低煙堿性狀包含與野生型nic1相比具有減少的表達(dá)和/或功能的nic1等位基因。在一些實(shí)施方案中，第一低煙堿性狀和/或第二低煙堿性狀包含與野生型nic2相比具有減少的表達(dá)和/或功能的nic2等位基因。在一些實(shí)施方案中，第一煙草品種和/或第二煙草品種包含衍生自至少一種以下品系的nic1等位基因和/或nic2等位基因：mafc5、lmafc34、la?burley?21、li?burley?21和hi?burley21。在一些實(shí)施方案中，第一煙草品種和/或第二煙草品種包含nic1和/或nic2無(wú)效等位基因(缺失)。在一些實(shí)施方案中，nic1和/或nic2無(wú)效等位基因衍生自天然存在的煙草(ntabacum)種質(zhì)。

14、在一些實(shí)施方案中，第一煙草品種和/或第二煙草品種包含功能性cyp82e2等位基因。在一些實(shí)施方案中，cyp82e2等位基因衍生自林煙草。在一些實(shí)施方案中，第一煙草品種和/或第二煙草品種包含功能性cyp82e3等位基因。在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因衍生自絨毛狀煙草(或相關(guān)物種，例如煙草屬絨毛煙草組)。在一些實(shí)施方案中，與天然存在的煙草植物相比，由cyp82e2等位基因和/或cyp82e3等位基因編碼的蛋白質(zhì)的煙堿n-去甲基化活性增加。

15、在一些實(shí)施方案中，第一低煙堿性狀包含與野生型nic1和/或nic2相比具有減少的表達(dá)和/或功能的nic1等位基因和/或nic2等位基因，并且其中第二低煙堿性狀包含功能性cyp82e2等位基因和/或功能性cyp82e3等位基因。

16、在一些實(shí)施方案中，第一煙草品種、所述第二煙草品種和所述后代植物是非轉(zhuǎn)基因的。

17、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括從根據(jù)本文所述的任何方法產(chǎn)生的后代植物獲得的種子或細(xì)胞。

18、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括衍生自根據(jù)本文所述的任何方法產(chǎn)生的后代植物的煙草產(chǎn)品。

19、在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)品選自由煙葉、煙絲、生切煙絲、煙草末、煙草粉、煙草提取物、無(wú)煙煙草、濕鼻煙或干鼻煙、煙斗煙草、雪茄煙草、小雪茄煙草、香煙煙草和嚼用煙草組成的組。

20、在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)品選自由小雪茄、丁香香煙、不通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、雪茄、鼻煙、含煙草口香糖、含煙草含片和嚼用煙草組成的組。

21、在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含cyp82e2等位基因，所述等位基因包含編碼相對(duì)于seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的k375e點(diǎn)突變和/或l422w點(diǎn)突變的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，(a)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?id?no：2中所示的氨基酸序列；(b)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?id?no：3中所示的氨基酸序列；或(c)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?idno：4中所示的氨基酸序列。

22、在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因包含編碼相對(duì)于seq?id?no：5中所示的野生型cyp82e3氨基酸序列的c330w點(diǎn)突變的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因包含編碼cyp82e3蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e3蛋白包含如seq?id?no：6中所示的氨基酸序列。

23、在一些實(shí)施方案中，栽培品種包含cyp82e2等位基因，所述等位基因包含編碼相對(duì)于seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的k375e點(diǎn)突變和/或l422w點(diǎn)突變的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，(a)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?id?no：2中所示的氨基酸序列；(b)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?id?no：3中所示的氨基酸序列：或(c)cyp82e2等位基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e2蛋白包含如seq?idno：4中所示的氨基酸序列。

24、在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因包含編碼相對(duì)于seq?id?no：5中所示的野生型cyp82e3氨基酸序列的c330w點(diǎn)突變的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，cyp82e3等位基因包含編碼cyp82e3蛋白的核苷酸序列，所述cyp82e3蛋白包含如seq?id?no：6中所示的氨基酸序列。

25、在一些實(shí)施方案中，栽培品種進(jìn)一步包括栽培品種內(nèi)以下至少一種的表達(dá)的抑制：nbb1、a622、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(qpt)、腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶(pmt)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(odc)、天冬氨酸氧化酶(ao)、喹啉酸合酶(qs)、n-甲基腐胺氧化酶(mpo)、nterf221、ntmyc1a、ntmyc1b、ntmyc2a或ntmyc2b。

26、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括一種用于在煙草植物細(xì)胞中的靶基因中產(chǎn)生點(diǎn)突變的方法。根據(jù)這些實(shí)施方案，所述方法包括向細(xì)胞中引入成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(crispr-cas)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)至少一種指導(dǎo)rna(grna)，其中所述至少一種grna包含能夠與靶基因中的靶序列或其部分雜交的核苷酸序列，其中所述靶基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列；(b)包含供體dna序列的核酸，所述供體dna序列包含：(i)dna片段，其中所述dna片段替代靶基因中的靶序列或插入靶基因中的靶位點(diǎn)；和(ii)兩個(gè)同源臂，每個(gè)臂位于dna片段的相對(duì)側(cè)側(cè)翼；和(c)效應(yīng)蛋白，或編碼效應(yīng)蛋白的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種grna與效應(yīng)蛋白形成復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)蛋白是包含核酸酶的cas蛋白。

27、在一些實(shí)施方案中，(a)點(diǎn)突變是相對(duì)于如seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的k375e點(diǎn)突變；或(b)點(diǎn)突變是相對(duì)于如seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的l422w點(diǎn)突變。

28、在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生了至少兩個(gè)點(diǎn)突變。在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)點(diǎn)突變包括相對(duì)于seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的k375e點(diǎn)突變和相對(duì)于seqid?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的l422w點(diǎn)突變。

29、在一些實(shí)施方案中，煙草植物進(jìn)一步包含nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。

30、在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括抑制栽培品種內(nèi)以下至少一種的表達(dá)：nbb1、a622、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(qpt)、腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶(pmt)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(odc)、天冬氨酸氧化酶(ao)、喹啉酸合酶(qs)、n-甲基腐胺氧化酶(mpo)、nterf221、ntmyc1a、ntmyc1b、ntmyc2a或ntmyc2b。

31、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括一種用于在煙草植物細(xì)胞中的靶基因中產(chǎn)生點(diǎn)突變的方法。根據(jù)這些實(shí)施方案，所述方法包括向細(xì)胞中引入成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(crispr-cas)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)至少一種指導(dǎo)rna(grna)，其中所述至少一種grna包含能夠與靶基因中的靶序列或其部分雜交的核苷酸序列，其中所述靶基因包含編碼cyp82e3蛋白的核苷酸序列；(b)包含供體dna序列的核酸，所述供體dna序列包含：(i)dna片段，其中所述dna片段替代靶基因中的靶序列或插入靶基因中的靶位點(diǎn)；和(ii)兩個(gè)同源臂，每個(gè)臂位于dna片段的相對(duì)側(cè)側(cè)翼；和(c)效應(yīng)蛋白，或編碼效應(yīng)蛋白的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種grna與效應(yīng)蛋白形成復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)蛋白是包含核酸酶的cas蛋白。

32、在一些實(shí)施方案中，點(diǎn)突變是相對(duì)于如seq?id?no：5中所示的野生型cyp82e3氨基酸序列的c330w點(diǎn)突變。

33、在一些實(shí)施方案中，煙草植物進(jìn)一步包含nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。

34、在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括抑制煙草植物內(nèi)以下至少一種的表達(dá)：nbb1、a622、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(qpt)、腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶(pmt)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(odc)、天冬氨酸氧化酶(ao)、喹啉酸合酶(qs)、n-甲基腐胺氧化酶(mpo)、nterf221、ntmyc1a、ntmyc1b、ntmyc2a或ntmyc2b。

35、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括生產(chǎn)具有減少的煙堿類生物堿含量的煙草植物的方法。根據(jù)這些實(shí)施方案，所述方法包括在煙草植物中組合：(a)增加cyp82e2和/或cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾；和(b)nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。在一些實(shí)施方案中，與對(duì)應(yīng)的天然存在的或非轉(zhuǎn)化的對(duì)照煙草植物相比，所述煙草植物具有減少的煙堿類生物堿含量。

36、在一些實(shí)施方案中，煙草植物包含nic1的純合隱性等位基因和/或nic2的純合隱性等位基因。

37、在一些實(shí)施方案中，增加cyp82e2和/或cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾是通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(talen)、大范圍核酸酶、鋅指核酸酶、crispr/cas9系統(tǒng)、crispr/cpf1系統(tǒng)、crispr/csm1系統(tǒng)、基因敲入技術(shù)(technique)或技術(shù)(technology)及其任何組合引入的。

38、在一些實(shí)施方案中，增加cyp82e2活性的一種或多種遺傳修飾包括煙草植物細(xì)胞中的靶基因的點(diǎn)突變，其中所述點(diǎn)突變選自相對(duì)于如seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的k375e點(diǎn)突變和相對(duì)于如seq?id?no：1中所示的野生型cyp82e2氨基酸序列的l422w點(diǎn)突變中的一種或多種。

39、在一些實(shí)施方案中,增加cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾包括煙草植物細(xì)胞中的靶基因中的點(diǎn)突變，其中所述點(diǎn)突變是相對(duì)于如seq?id?no：5中所示的野生型cyp82e3氨基酸序列的c330w點(diǎn)突變。

40、在一些實(shí)施方案中，通過(guò)成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(crispr-cas)系統(tǒng)將點(diǎn)突變引入植物中，所述系統(tǒng)包括：(a)至少一種指導(dǎo)rna(grna)，其中所述至少一種grna包含能夠與靶基因中的靶序列或其部分雜交的核苷酸序列，其中所述靶基因包含編碼cyp82e2蛋白的核苷酸序列；(b)包含供體dna序列的核酸，所述供體dna序列包含：(i)dna片段，其中所述dna片段替代靶基因中的靶序列或插入靶基因中的靶位點(diǎn)；和(ii)兩個(gè)同源臂，每個(gè)臂位于dna片段的相對(duì)側(cè)側(cè)翼；和(c)效應(yīng)蛋白，或編碼效應(yīng)蛋白的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種grna與效應(yīng)蛋白形成復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)蛋白是包含核酸酶的cas蛋白。

41、本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括通過(guò)本文所述的任何方法生產(chǎn)的煙草植物，其中所述植物包含：(a)增加cyp82e2和/或cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾；和(b)nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括由所述植物產(chǎn)生的后代植物或種子，其中所述后代植物或種子包含：(a)增加cyp82e2和/或cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾；和(b)nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。本公開(kāi)的實(shí)施方案還包括包含來(lái)自煙草植物的煙草的煙草產(chǎn)品，其中所述植物包含：(a)增加cyp82e2和/或cyp82e3活性的一種或多種遺傳修飾；和(b)nic1的隱性等位基因和/或nic2的隱性等位基因。

42、根據(jù)這些實(shí)施方案，(a)煙草選自由煙葉、煙絲、生切煙絲、煙草末、煙草粉、煙草提取物、無(wú)煙煙草、濕鼻煙或干鼻煙、煙斗煙草、雪茄煙草、小雪茄煙草、香煙煙草和嚼用煙草組成的組；或(b)產(chǎn)品是煙堿減少的煙草產(chǎn)品，其選自由小雪茄、丁香香煙、不通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、通風(fēng)的凹陷過(guò)濾嘴香煙、雪茄、鼻煙、口含煙、含煙草口香糖、含煙草含片和嚼用煙草組成的組。