專利名稱：密度細胞分離裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種生物醫(yī)學實驗室裝置，尤其涉及一種用于細胞分離的生物醫(yī)學實驗室裝置，具體的說，這種用于細胞分離的密度細胞分離裝置利用非連續(xù)密度分離細胞原理，采用Ficoll或Percoll密度分離液，按照不同的密度等級分離各種不同密度的細胞。其特征在于利用先進的微電腦控制系統(tǒng)及其不同的壓力傳感器，設(shè)計全封閉、無污染、自動操作程序的細胞分離系統(tǒng)，適合臨床大劑量、無菌的特殊需要。
背景技術(shù)：
應(yīng)用非持續(xù)密度分離細胞的技術(shù)，是生物醫(yī)學實驗室經(jīng)常應(yīng)用的技術(shù)，但是，常規(guī)的密度分離技術(shù)采用手工操作，容易造成標本污染，分離效率較低，分離工作量較大，不適合應(yīng)用于臨床生物細胞治療需要。
臨床生物細胞治療是現(xiàn)代生物治療的重要組成部分，多種臨床生物細胞治療已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，例如，骨髓移植，外周血造血干細胞移植已經(jīng)成為各種血液腫瘤的首選治療方法。樹突狀細胞治療也已經(jīng)被證實為腫瘤生物治療的最有發(fā)展前途的治療方法。臨床生物細胞治療的重要步驟之一是生物細胞凈化。目前細胞凈化多采用手工方式在開放性環(huán)境下進行，極易引發(fā)標本污染而導致細胞凈化程序失敗。由于臨床生物細胞治療所需細胞數(shù)量較多，因此，手工操作方式工作量較多，較易出現(xiàn)多種誤差。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實用新型的目的是提供一種密度細胞分離裝置，在全封閉、無污染環(huán)境下，實現(xiàn)血細胞自動分離，不僅大幅度減少細胞分離和凈化過程中標本污染發(fā)生的比率，也明顯提高細胞分離的效率。
為解決其技術(shù)問題，本實用新型采用的技術(shù)解決方案，其特征是，本實用新型裝置由掛鉤、分離臺、清洗濃縮臺三部份組成。
a)掛鉤固定在分離臺頂部，由金屬材料制作(如不銹鋼)，用來懸吊液體容器，有三個掛鉤，自右向左依次為1’掛鉤->密度梯度液1’袋，2’掛鉤->待分離細胞袋，3’掛鉤->密度梯度液3’袋。
b)分離臺i.上1/3為三個電磁擠壓閥，自左向右依次為①-②-③號閥，分別控制1′-2′-3′號袋中液體流向，受微電腦系統(tǒng)控制。
ii.中1/3為三個分離管支架，自左向右分別為A-B-C分離管支架，分別用來固定及支撐A-B-C分離管，支架用硬質(zhì)塑料制作，用螺絲固定在分離臺中1/3，每個支架內(nèi)部，都裝置一個數(shù)字化重量計，可以自動監(jiān)測計算每個分離管內(nèi)重量的變化，分離管支架作為重量計的外延部份已被調(diào)零，校正精度時，支架包括在內(nèi)調(diào)零，因此可以準確地計算分離管的重量。每個支架上安放一個分離管，分離管用無毒塑料材料制作，呈園錐形，頂部有可以分離的分離管蓋，帶外螺紋接口，與分離管入口的外螺紋接口相互連接，分離管錐形出口借其上部的內(nèi)螺紋結(jié)構(gòu)與分離管出口的內(nèi)螺紋結(jié)構(gòu)相互連接，分離管入口及出口各有連接管借螺絲連接(見圖3，分離管結(jié)構(gòu)示意圖)。
分離管為標準結(jié)構(gòu)統(tǒng)一制作，因此，數(shù)字化重量計，在實際運行中，可以統(tǒng)一計算分離管重量，再度設(shè)置為零基準，任何加入分離管內(nèi)的液體重量可以予以計算，通過計算及監(jiān)測分離管中重量的改變，而控制實際流量。
分離管體帶有標準的度量單位，容易一目了然地觀察及容量改變，分離管用透明硬塑料(對人體組織無毒性的，生物相容性良好材料)制造，分離管上方入口和下方出口分別用手動閥門或封夾(輸血或輸液時常用的封夾)封閉其上、下端，形成一個封閉的內(nèi)環(huán)境。
iii.下1/3的近中央部份是三個電磁擠壓閥，自左向右依次為④-⑤-⑥號閥分別控制從A-B-C分離管出口液體流出。下1/3的近右側(cè)部份為控制面板及其相連接的微電腦控制系統(tǒng)，由微電腦芯片、貯存芯片、附屬電路及其液晶顯示器所組成，接受各個傳感器的信號，即時處理信號，并發(fā)出指令控制各個電磁閥及其蠕動泵的活動，并貯存其活動的相關(guān)參數(shù)，液晶顯示屏顯示各種相關(guān)參數(shù)及其各種裝置的工作狀態(tài)，并可以控制微電腦系統(tǒng)活動。
c)清洗濃縮臺由TFF過濾裝置構(gòu)成，由電磁擠壓閥，TFF容器，TFF過濾盒(采用4μm的多孔過濾膜)，蠕動泵、廢棄液收集袋及細胞收獲袋等部份組成，為標準的TFF裝置(詳細設(shè)計見TFF系統(tǒng)設(shè)計)。
清洗濃縮臺構(gòu)成儀器的底部，與分離臺連接，支撐分離臺，起到基底座的作用，在TFF容器支架內(nèi)裝置有重量計5’，可以監(jiān)測和計算TFF容器內(nèi)重量。
本實用新型工作原理及其應(yīng)用方法這個系統(tǒng)主要用來分離和凈化外周血、骨髓或臍血中的單個核細胞(MononuclearCells)，和單核細胞(或稱樹突狀細胞前細胞，Monocyte)。工作原理為利用非連續(xù)密度分離的原理，采用不同密度的分離液，通過離心，隔離不同密度的血細胞，從而使不同密度的血細胞處于分離管不同的層面，通過觀察不同離心管所處的不同層面，從而設(shè)置不同的參數(shù)，讓不同的容器接受不同密度的細胞，再用緩沖液沖冼、濃縮細胞，而起到分離不同血細胞的目的。
a)單個核細胞分離(淋巴細胞分離，Mononuclear Cell Selection)(用Ficoll-Pagneplus分離外周血中單個核細胞(淋巴細胞)，Density(密度)1.077g/ml，加Ficoll-PaguePlus∶血標本＝15∶35。如分離70ml外周血采集的單個核細胞采用30ml Ficoll-Pague Plus首先放置30ml Ficoll-Pague Plus在分離管，然后仔細放置70ml外周血單個核細胞分離液在表面。離心400xgx30-40分鐘在18℃-20℃，離心后的分離管置于分離管架，觀察分離管內(nèi)單個核細胞的層面，輸入數(shù)據(jù)，開放電磁閥，將廢棄液體流入廢棄袋，當分離管內(nèi)的層面將到達淋巴細胞層面時，電磁閥(連接廢棄液袋)關(guān)閉，而連接細胞收集液的電磁閥開放，收集單個核細胞，當單個核細胞收集完成后，電磁閥關(guān)閉。
b)單核細胞分離(Monocyte Selection)準備兩種不同比重的密度分離液A.Ficoll Density 1.070g/ml(密度梯度液1)，B.Percoll Density 1.064g/ml(密度梯度液2)。首先在分離管內(nèi)底部置入Ficoll(1.070g/ml)30ml，然后在上面鋪上70ml外周血淋巴細胞采集液，然后，在上面置放Percoll(1.064g/ml)，離心400gx35分鐘(25℃-35℃)，將分離管放置在分離管支架，觀察最上層的單核細胞層，輸入數(shù)據(jù)至微電腦系統(tǒng)，其余廢棄液流入廢棄液袋，而單核細胞層流入細胞收集袋，經(jīng)過清洗濃縮后備用。
本實用新型的有益效果是，提出一種新型、全封閉式的自動細胞分析裝置，大幅度減少標本污染率，提高細胞分離的效率。


圖1是本實用新型裝置示意圖圖2是本實用新型裝置連接示意圖圖3是分離管結(jié)構(gòu)示意圖圖4是單分離管配置示意圖圖5是內(nèi)部連接圖圖1中，101-密度梯度液(1)；102-待分離細胞；103.-密度梯度液(2)；104-數(shù)字式重量計；105-分離管支架；106-控制面板；107-廢棄液掛鉤；108-蠕動泵；109-電磁攪拌器；110-TFF容器支架；111-重量計。
圖2中，201-密度梯度液(1)；202-待分離細胞；203-密度梯度液(2)；204-分離管；205-電磁擠壓閥；206-緩沖液袋；207-TFF容器；208-控制面板；209-廢棄液袋；210-TFF過濾盒；211-蠕動泵。
圖3中，301-入口連接管；302-分離管蓋；303.-(帶外螺旋)接口；304-(帶內(nèi)螺旋)接口；305-分離管入口；306-分離管體；307-分離管錐形出口；308-出口連接管；309-分離管入口；310-分離管體；311-分離管刻度；312-分離管出口。
圖4中，401-密度液(1)；402-待分離細胞；403密度液(2)；404-數(shù)字式重量計；405-控制面板；406-廢棄液掛鉤；407-蠕動泵；408-數(shù)字式重量計；409-TFF容器支架；410-緩沖液掛鉤；411-分離管支架。
圖5中，501-密度液(1)；502-待分離細胞；503-密度液(2)；504-控制面板；505-廢棄液袋；506-蠕動泵；507-細胞收獲袋；508-TFF容器；509-緩沖液袋；510-分離管。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明實施例-本實用新型裝置運行程序a)淋巴細分離凈化i.程序(1)安裝1’密度液袋和2’待分離細胞密度袋，連接1’袋和2’袋出口與A-B-C三個分離管入口，并檢查是否安裝妥當(無菌操作)。
ii.程序(2)啟動電源，電源指示燈亮iii.程序(3)選擇“測試”選項。微電腦控制系統(tǒng)自行檢查各個連接部份及其各個單元是否出現(xiàn)異常，如果各部位功能正常，液晶屏顯示“功能正常，待機使用“字樣。
iv.程序(4)選擇“淋巴細胞分離凈化“選項。
v.程序(5)選擇“灌注密度分離液“選項。
1.這時液晶顯示屏上跳出三行欄目“A-分離管灌注***ml密度液”“B-分離管灌注***ml密度液”“C-分離管灌注***ml密度液”填寫上述空格，例如“A-分離管灌注30ml密度液”“B-分離管灌注30ml密度液”“C-分離管灌注30ml密度液”2.填寫完畢，選擇“開始灌注”選項，這時系統(tǒng)自行運轉(zhuǎn)，自動控制，開始灌注過程。
3.首先，A分離管重量計啟動，準備監(jiān)測并計算A分離管內(nèi)的重量，例如指令A(yù)分離管接受30ml，比重為1.070g/ml液體，則重量為30×1.070g/ml＝32.1g，因為密度液比重作為固定參數(shù)，已經(jīng)輸入微電腦，這時只要微電腦接受“灌注30ml密度液”指令就會自動計算出接受32.1g重量的指令。與此同時微電腦按預(yù)設(shè)的指令，開放①號閥門，1’袋中的密度液緩慢通過①號閥流入A分離管，A-重量計接受A-分離管的重量，并傳入微電腦，當微電腦接受輸入信息達到32.1g時，微電腦指令①號閥門自動關(guān)閉。
4.B分離管、B重量計、②號閥門重復上述過程。B分離管內(nèi)置于30ml密度液。
5.C分離管、C重量計、③號閥門重復同樣過程。C分離管內(nèi)置于30ml密度液vi.程序(6)選擇“灌注待分離細胞”選項1.液晶顯示屏顯示“A-分離管灌注***ml待分離細胞”“B-分離管灌注***ml待分離細胞”“C-分離管灌注***ml待分離細胞”填寫上述空格。
“A-分離管灌注70ml待分離細胞”“A-分離管灌注70ml待分離細胞”“A-分離管灌注70ml待分離細胞”2.填寫完畢，選擇“開始灌注”選項。
3.灌注過程與程序(5)一樣。待分離細胞的比重已經(jīng)預(yù)先存入微電腦，微電腦根據(jù)填寫的輸入容量自動計算重量，并預(yù)設(shè)仃止灌注的重量標準，在選擇“灌注待分離細胞”選項時，A、B、C重量計已經(jīng)重新調(diào)零，準備測量和計算新灌注的待分離細液。
4.程序自動執(zhí)行，A、B、C分離管灌注各70ml待分離細胞，灌注時流速很慢，緩慢的覆蓋在密度分離液表面，液體總量達100ml。
5.拆除A-B-C分離管入口與管道連接，用管夾封閉分離管。
vii.程序(7)離心將三個已經(jīng)灌注完畢的分離管，小心的從分離管支架取出，緩慢仔細地放置于專用離心機支架上，離心400g×25分鐘~35分鐘，18℃-20℃viii.程序(8)重新安裝A-B-C分離管。仔細、小心將A-B-C分離管從離心機中取出，并平穩(wěn)地放置在分離管支架，移動過程中不能搖晃，以免破壞分層的界面，連接A-B-C分離管出口與相應(yīng)管道。
ix.程序(9)選擇“淋巴細胞層分離”選項。
1.液晶顯示屏跳出三個欄目“A-分離管淋巴細胞分離層從***ml->***ml”“B-分離管淋巴細胞分離層從***ml->***ml”“C-分離管淋巴細胞分離層從***ml->***ml”2.仔細觀察各個不同的分離管中淋巴細胞分離層的刻度，并填寫“A-分離管淋巴細胞分離層從60ml->80ml”“B-分離管淋巴細胞分離層從60ml->80ml”“C-分離管淋巴細胞分離層從60ml->80ml”微電腦控制系統(tǒng)內(nèi)分別置A、B、C重量計在重量減少60ml×1.050(例如平均比重為1.050g/ml)＝63g時，觸發(fā)警報，微電腦系統(tǒng)開啟/關(guān)閉相應(yīng)電磁擠壓閥，以開放/阻止相應(yīng)的液體流動。然后在A、B、C重量計在分別到達80ml×1.050＝84g時，微電腦系統(tǒng)重新開放相應(yīng)閥門。
3.“A”分離管細胞分離，選擇“A分離管細胞分離”選項，開放④-⑧電磁擠壓閥，A分離管內(nèi)的分離液通過④-⑧號電磁閥上方的管道內(nèi)有一個特別設(shè)計的，上、下兩端膨大，中間細小的玻璃管，限制了流速，液體以很緩慢速度20ml/分流過。當A分離管內(nèi)的液體流出，60ml時，亦即A分離管內(nèi)液體生量減少至63g時，微電腦系統(tǒng)觸發(fā)警報，關(guān)閉④號電磁閥，30秒后關(guān)閉⑧號電磁閥(以便讓管道中液體流凈)30秒后，開放④-⑦號閥，已分離的淋巴細胞流入TFF容器，當A分離管液體減少超過80mi時(重量減少84g時)，微電腦預(yù)設(shè)的警報動作，關(guān)閉④號閥，30秒后，關(guān)閉⑦號閥。
4.“B”分離管細胞分離。選擇“B分離管細胞分離”選項(程序相同)，開放⑤-⑧閥，當液體流出近60ml時關(guān)閉⑤號閥，30秒后關(guān)閉⑧號閥。30秒后，開放⑤-⑦號閥，當B分離管液體減少80ml時，關(guān)閉⑤閥及⑦閥。
5.“C”分離管細胞分離。選擇“C分離管細胞”選項，區(qū)別在于置換④或⑤號閥為⑥閥。
x.程序(10)選擇“收集廢棄液”選項。開放④-⑤-⑥-⑧號電磁閥，收集全部廢棄液至4’袋，當A、B、C重量計重量減少到零時，關(guān)閉④-⑤-⑥-⑧號閥。
xi.程序(11)選擇“灌注緩沖液(1)”選項。
1.液晶顯示屏跳出欄目“灌注緩沖液***ml”，通常選擇三倍于分離細胞的容量，例如已分離細胞為180ml，則為540ml。
2.填寫“灌注緩沖液540ml”3.選擇“開始灌注”選項。開放_號閥門，6’重量計減少540g時，微電腦系統(tǒng)自動關(guān)閉_號閥門。
xii.程序(12)選擇“清洗濃縮細胞(1)”選項。
1.液晶顯示屏跳出欄目“細胞濃縮容量***ml”，通常選擇已分離容量的初始容量或更少容量，臺選擇150ml。
2.填寫“細胞濃縮容量150ml”3.選擇“開始清洗濃縮”選項。開放⑩閥-⑨閥，蠕動泵逆時針方向轉(zhuǎn)動速度600ml/分，當TFF容器內(nèi)液體到達150g時，蠕動泵仃止轉(zhuǎn)動，⑩-⑨閥關(guān)閉。
xiii.程序(13)選擇“灌注緩沖液(2)”選項。重復程序(11)。
xiv.程序(14)選擇“清洗濃縮細胞(2)”選項。重復程序(12)。
xv.程序(15)選擇“灌注緩沖液(3)”選項。重復程序(11)。
xvi.程序(16)選擇“清洗濃縮細胞(3)”選項。重復程序(12)。
xvii.程序(17)選擇“收獲細胞”選項。開放_號閥，收獲細胞進入5’袋-細胞收獲袋。
整個程序結(jié)束。
b)單核細胞分離凈化i.程序(1)安裝1’袋-密度液(1)1.070g/ml，2’袋-待分離細胞，3’袋-密度液(2)(1.060G/ML)，連接1’-2’-3’袋，出口與A-B-C分離管入口。
ii.程序(2)-(3)與前程序相同。
iii.程序(4)選擇“單核細胞分離凈化”選項。
iv.程序(5)選擇“灌注密度分離液”選項。
1.選擇“灌注密度分離液(1)”選項，液晶屏上出現(xiàn)三行欄目“A-分離管灌注***ml密度液(1)”“B-分離管灌注***ml密度液(1)”“C-分離管灌注***ml密度液(1)”填寫上述空格，例如
“A-分離管灌注30ml密度液(1)”“A-分離管灌注30ml密度液(1)”“A-分離管灌注30ml密度液(1)”2.3.4.5.與前程序相同。
6.選擇“灌注密度分離液(2)”選項。其余程序同1項。
7.8.9.10.程序同2.3.4.5.
v.程序(6)-程序(7)同前程序。區(qū)別在于觀察分離細胞時，為最上層，密度最低的單核細胞。
密度細胞分離儀(單分離管型)(見圖4，圖5)。原理、構(gòu)置與前述結(jié)構(gòu)一致，僅僅是由原來A-B-C三個分離管改為單分離管，在程序設(shè)計上僅需采用A分離管程序即可，其余不變。
權(quán)利要求1.本實用新型涉及一種生物醫(yī)學實驗室裝置，尤其涉及一種用于細胞分離的生物醫(yī)學實驗室裝置，其特征是由掛鉤、分離臺、清洗濃縮臺三部份組成的密度細胞分離裝置，應(yīng)用密度分離液，按照不同密度等級分離各類細胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的密度細胞分離裝置，其特征是其結(jié)構(gòu)由掛鉤、分離臺、清洗濃縮臺三部份組成，掛鉤固定在分離臺頂部，由金屬材料制作，用來懸吊液體容器，分離臺上1/3為三個電磁擠壓閥，分別控制液體容器中液體流向，受微電腦系統(tǒng)控制，中1/3為三個分離管支架，分別用來固定及支撐分離管，支架用硬質(zhì)塑料制作，用螺絲固定在分離臺中1/3，每個支架內(nèi)部都裝置一個數(shù)字化重量計，下1/3的近中央部份是三個電磁擠壓閥，分別控制從分離管出口液體流出，下1/3的近右側(cè)部份為控制面板及其相連接的微電腦控制系統(tǒng)，由微電腦芯片、貯存芯片、附屬電路及其液晶顯示器所組成，清洗濃縮臺由TFF過濾裝置構(gòu)成，由電磁擠壓閥、TFF容器、TFF過濾盒、蠕動泵、廢棄液收集袋及細胞收獲袋等部份組成，清洗濃縮臺構(gòu)成儀器的底部，與分離臺連接，支撐分離臺。
專利摘要本實用新型涉及一種生物醫(yī)學實驗室裝置，尤其涉及一種用于細胞分離的生物醫(yī)學實驗室裝置，具體的說，這種用于細胞分離的密度細胞分離裝置利用非連續(xù)密度分離細胞原理，采用Ficoll或Percoll密度分離液，按照不同的密度等級分離各種不同密度的細胞。其特征在于利用先進的微電腦控制系統(tǒng)及其不同的壓力傳感器，設(shè)計全封閉、無污染、自動操作程序的細胞分離系統(tǒng)，適合臨床大劑量、無菌的特殊需要。
文檔編號C12N5/06GK2892874SQ200520043618

公開日2007年4月25日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平