專利名稱：一種有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術中的基因表達、核糖核酸干擾和檢測技術領域，具體涉及一種有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子；本發(fā)明還涉及該種有效抑制小鼠 mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法。
背景技術：
白細胞分化抗原 14 (cluster of differentiation antigen，CD14)是一種存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的分化抗原，為體內(nèi)介導脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)生物效應的重要受體之一。白細胞分化抗原14(CD14)包括膜結(jié)合型白細胞分化抗原 14 (membrane bound CD14, mCD14)和可溶性白細胞分化抗原 14 (soluble CD14, sCD14) 兩種形式膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)是分子量為55千道爾頓(KD)的糖蛋白， 其C-末端借助糖基磷酯酰肌醇(glucose phosphatidylinositol, GPI)結(jié)構錨附于細胞膜表面；可溶性白細胞分化抗原14(sCD14)分子有49KD和55KD兩種形式，缺乏糖基磷酯酰肌醇(GPI)錨。膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)是由含有白細胞分化抗原 14(CD14)基因的單核細胞、巨噬細胞，自行轉(zhuǎn)錄、翻譯蛋白質(zhì)多肽鏈，在高爾基復合體內(nèi)糖化后，其羧基端再與磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)結(jié)合，并由磷酯酰肌醇的磷脂部分與細胞膜連接。生理條件下，膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)主要表達于成熟的單核巨噬細胞，微弱表達于中性粒細胞、腎小球膜細胞、乳房細胞和B細胞，介導脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)對這些細胞的激活作用。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞外膜的組成部分，其主要成分為脂多糖(LPQ，脂多糖一旦進入體內(nèi)，將誘導機體產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)的反應，導致機體的嚴重損傷。在革蘭氏陰性細菌引起的炎癥反應過程中，脂多糖受體起著關鍵作用，是脂多糖作用的重要門戶。白細胞分化抗原14(CD14)被認為是脂多糖信號轉(zhuǎn)導中最重要的脂多糖受體，白細胞分化抗原 14(CD14)在介導脂多糖激活靶細胞及炎癥反應中起關鍵作用；研究表明，通過抑制白細胞分化抗原14(CD14)破壞脂多糖所激活的靶細胞炎癥反應是一個可行的治療方法。核糖核酸干擾(RNA interference，RNAi)是指由特定雙鏈核糖核酸(double stranded RNA, dsRNA)引發(fā)同源信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)降解的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機制，這類特定雙鏈核糖核酸被裂解成小干擾核糖核酸分子(siRNAs)，并能導致同源信使核糖核酸(mRNA)在核糖核酸誘導的靜默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)作用下降解。核糖核酸干擾(RNAi,Ribonucleic acid interference)RNA是目前簡單而高效地阻斷哺乳動物細胞內(nèi)特異基因表達的最有效方法之一，可達到基因敲除效果，且安全性好。但對于核糖核酸干擾(RNAi)來說，并不是所有針對靶基因信使核糖核酸(mRNA) 序列隨機合成的小干擾核糖核酸分子(siRNAs)都能引起有效的基因沉默，干擾靶序列的選擇對干擾效率的影響是至關重要的。因此，對能有效抑制特異基因表達的小干擾核糖核酸分子(siRNAs)的篩選是應用核糖核酸干擾(RNAi)技術進行基因功能、基因治療等相關研究的重要基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子， 能夠有效、特異性的抑制小鼠mCD14基因表達，解決了現(xiàn)有靶基因mRNA序列隨機合成的 siRNA并不都能引起有效基因沉默的問題。本發(fā)明的另一目的是提供一種有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法。本發(fā)明所采用的技術方案是，一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子，其基因序列是正義，gggcaguucacugauauuatt ~3'),反義,uaauaucagugaacugccctt _3，) 本發(fā)明所采用的另一技術方案是，一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法，該篩選方法按照以下步驟實施步驟1、根據(jù)膜結(jié)合型白細胞分化抗原14基因的序列，按照小干擾核糖核酸分子合成的基本原則，合成多個不同的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子，選理論值最好的四對進行實驗；步驟2、按照高效轉(zhuǎn)染試劑操作說明書的方法，將四對小干擾核糖核酸分子轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞7，具體步驟是2. 1)用200微升完全培養(yǎng)基將5X IO5個細胞鋪于12孔板內(nèi)；2. 2)分別用100微升無血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋2微升濃度為20微摩爾濃度的小干擾核糖核酸分子，用100微升無血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋9微升高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑，將兩個稀釋物混合，充分攪拌均勻后形成轉(zhuǎn)染復合物，在室溫放置5-10分鐘；2. 3)將上步得到的轉(zhuǎn)染復合物滴入細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，與小鼠巨噬細胞7混合，十字形輕搖以混合均勻，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；2. 4)在培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)6小時后，添加700微升杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基；步驟3、實時熒光定量聚合酶鏈式反應，檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14信使核糖核酸的表達水平，具體的步驟是轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層1-2次，用0. 125%的胰酶進行常規(guī)消化，收集細胞，根據(jù)核糖核酸提取試劑盒說明書分離出高品質(zhì)的總核糖核酸; 并測定純化的核糖核酸濃度，采用溴化乙錠染色電泳鑒定其完整性；使用第一鏈試劑盒合成互補脫氧核糖核酸；采用ABI-7500系統(tǒng)，使用熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，利用比較CT法來測定膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的表達水平，所用引物為，針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14 上游引物為5'-AACTCGCTCAATCTGTCTTTCAC-3‘，下游引物為5'-GCTCATCTGGGCTAGGGTTC-3‘；針對甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物為5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3‘，下游引物為5,-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3‘，
按照能特異抑制小鼠膜結(jié)合型白細胞分化抗原14mRNA水平，抑制效率為最佳的標準，篩選小干擾核糖核酸分子；步驟4、進行蛋白質(zhì)印跡檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達水平以確定干擾效果，具體步驟是轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層1-2次，0. 125%的胰酶常規(guī)消化，收集細胞；根據(jù)細胞沉淀的多少，依次加入細胞裂解液50毫摩爾濃度的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、150納摩爾濃度氯化鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、0.2% 疊氮鈉、0.5%脫氧膽酸鈉、10微克/毫升抑肽酶aprotinin、1微克/毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將總蛋白等量上樣，在12%的分離膠的濃度下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后進行蛋白質(zhì)印跡，采用的抗體是，一抗為兔抗膜結(jié)合型白細胞分化抗原14多克隆抗體，1 300倍稀釋，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶單抗，1 1000倍稀釋；二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G，1 1000倍稀釋，按照小干擾核糖核酸分子能特異抑制小鼠膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達，抑制效率最佳的標準，篩選得到了下述的小干擾核糖核酸分子，能特異且高效阻斷膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達，該小干擾核糖核酸分子序列信息是正義，gggcaguucacugauauuatt ~3'),反義,uaauaucagugaacugccctt (5，_3，)。本發(fā)明的有益效果是，根據(jù)膜結(jié)合型白細胞分化抗原14基因的序列，合成四對不同的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子(siRNAs)，再應用高效轉(zhuǎn)染試劑將四對小干擾核糖核酸分子(siRNAs)轉(zhuǎn)染小鼠單核巨噬細胞(RA\^64. 7)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14信使核糖核酸(mRNA)表達水平、蛋白質(zhì)印跡檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達量，以確定干擾效果，從而篩選出一種能夠有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子(siRNA)，為開展靶向小鼠膜結(jié)合型白細胞分化抗原14基因表達的基因功能、基因治療等相關研究提供依據(jù)。


圖1是本發(fā)明篩選過程中的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time PCR)檢測轉(zhuǎn)染小干擾核糖核酸分子(siRNAs)后，膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)信使核糖核酸 (mRNA)的表達水平圖；圖2是本發(fā)明篩選過程中的蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測轉(zhuǎn)染小干擾核糖核酸分子(siRNAs)后膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)蛋白表達量的變化圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明的目的是提供一種有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子， 其序列信息表達為正義，GGGCAGUUCACUGAUAUUATT(5，-3，)，反義，UAAUAUCA⑶GAACUGCCCTT(5，-3，)。本發(fā)明的上述的小干擾核糖核酸分子(siRNAs)，能夠有效抑制膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)基因表達，該小干擾核糖核酸分子(siRNAs)按照生物學方法篩選的步驟是，步驟1、根據(jù)膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，按照以下基本原則合成小干擾核糖核酸分子(siRNAs)1) GC 含量 30 % -52% ；2) sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ；3)不含有反向重復序列；4) sense鏈的第19堿基為A ；5) sense鏈的第3堿基為A ；6) sense鏈的第10堿基為U ；7) sense鏈的第19堿基不是G/C ；8) sense鏈的第13堿基不是G，現(xiàn)有技術條件下，根據(jù)相關理論能夠合成許多個不同的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)的小干擾核糖核酸分子(siRNAs)，但是所合成制作出來的并不全有效，本發(fā)明實施例特別針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14(mCD14)合成的四對小干擾核糖核酸分子(siRNAs)序列，如表1所示，由上海吉瑪制藥技術有限公司進行了試驗性合成，合成出來后，保藏條件是，置于焦碳酸二乙酯(DEPC，diethypyrocarbonate)DEPC水中，_20°C保存， 以下選取理論值最好的該四對小干擾核糖核酸分子(siRNAs)進行篩選，并進行實驗證明；表1小干擾核糖核酸分子(siRNAs)序列
權利要求
1.一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子，其特征在于，其基因序列是ΧΕΙ，gggcaguucacugauauuatt (5' _3，)， JxSL, uaauaucagugaacugccctt (5' _3，)。
2.一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學用途，其特征在于，該小干擾核糖核酸分子的基因序列是正義，gggcaguucacugauauuatt ~3'), 反義，uaauaucagugaacugccctt _3，)， 該小干擾核糖核酸分子能夠有效抑制小鼠mCD14基因表達。
3.一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法，其特征在于，該篩選方法按照以下步驟實施步驟1、根據(jù)膜結(jié)合型白細胞分化抗原14基因的序列，按照小干擾核糖核酸分子合成的基本原則，合成多個不同的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子，選理論值最好的四對進行實驗；步驟2、按照高效轉(zhuǎn)染試劑操作說明書的方法，將四對小干擾核糖核酸分子轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞7，具體步驟是~2. 1)用200微升完全培養(yǎng)基將5X IO5個細胞鋪于12孔板內(nèi)； 2. 2)分別用100微升無血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋2微升濃度為20微摩爾濃度的小干擾核糖核酸分子，用100微升無血清的Opti-MEM I培養(yǎng)基稀釋9微升高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染試劑，將兩個稀釋物混合，充分攪拌均勻后形成轉(zhuǎn)染復合物，在室溫放置5-10分鐘； 2. 3)將上步得到的轉(zhuǎn)染復合物滴入細胞培養(yǎng)孔內(nèi)，與小鼠巨噬細胞RAW^H. 7混合，十字形輕搖以混合均勻，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；~2. 4)在培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)6小時后，添加700微升杜比克改良伊格氏完全培養(yǎng)基； 步驟3、實時熒光定量聚合酶鏈式反應，檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14信使核糖核酸的表達水平，具體的步驟是轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層1-2次，用0. 125%的胰酶進行常規(guī)消化，收集細胞，根據(jù)核糖核酸提取試劑盒說明書分離出高品質(zhì)的總核糖核酸；并測定純化的核糖核酸濃度，采用溴化乙錠染色電泳鑒定其完整性；使用第一鏈試劑盒合成互補脫氧核糖核酸；采用ABI-7500系統(tǒng)，使用熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，利用比較CT 法來測定膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的表達水平，所用引物為， 針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14 上游引物為5' -AACTCGCTCAATCTGTCTTTCAC-3‘， 下游引物為5' -GCTCATCTGGGCTAGGGTTC-3‘； 針對甘油醛-3-磷酸脫氫酶 上游引物為5' -TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3‘， 下游引物為5, -CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3‘，按照能特異抑制小鼠膜結(jié)合型白細胞分化抗原HmRNA水平，抑制效率為最佳的標準， 篩選小干擾核糖核酸分子；步驟4、進行蛋白質(zhì)印跡檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達水平以確定干擾效果，具體步驟是轉(zhuǎn)染48小時后，吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層1-2次，0. 125%的胰酶常規(guī)消化，收集細胞；根據(jù)細胞沉淀的多少，依次加入細胞裂解液50毫摩爾濃度的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、150納摩爾濃度氯化鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、 0. 2%疊氮鈉、 0.5%脫氧膽酸鈉、 10微克/毫升抑肽酶aprotinin、 1微克/毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將總蛋白等量上樣，在12%的分離膠的濃度下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后進行蛋白質(zhì)印跡，采用的抗體是，一抗為兔抗膜結(jié)合型白細胞分化抗原14多克隆抗體，1 300倍稀釋，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶單抗，1 1000倍稀釋；二抗為辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G，1 1000倍稀釋， 按照小干擾核糖核酸分子能特異抑制小鼠膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達，抑制效率最佳的標準，篩選得到了下述的小干擾核糖核酸分子，能特異且高效阻斷膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達，該小干擾核糖核酸分子序列信息是 正義，gggcaguucacugauauuatt ~3'), 反義，uaauaucagugaacugccctt (5，_3，) 0
4.根據(jù)權利要求3所述的能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法，其特征在于，所述的合成小干擾核糖核酸分子(siRNAs)基本原則包括以下幾種1)GC含量 30% -52% ；2)sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U ；3)不含有反向重復序列；4)sense鏈的第19堿基為A ；5)sense鏈的第3堿基為A ；6)sense鏈的第10堿基為U ；7)sense鏈的第19堿基不是G/C ；8)sense鏈的第13堿基不是G。
5.根據(jù)權利要求3所述的能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子的生物學篩選方法，其特征在于，步驟1中的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14合成的四對小干擾核糖核酸分子序列是，起始位點正義(5，-3，)反義(5，-3，)陰性對照UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT180號GCCUGGAAUACCUUCUAAATTUUUAGAAGGUAUUCCAGGCTT224號GGGCAGUUCACUGAUAUUATTUAAUAUCAGUGAACUGCCCTT341號CAGGAACUGACUCUUGAAATTUUUCAAGAGUCAGUUCCUGTT987號CCCACUCGGAGAAGUUUAATTUUAAACUUCUCCGAGUGGGTT
全文摘要
本發(fā)明的一種能有效抑制小鼠mCD14基因表達的小干擾核糖核酸分子，其核糖核酸分子序列信息是正義，gggcaguucacugauauuatt(5’-3’)，反義，uaauaucagugaacugccctt(5’-3’)，其通過生物學方法篩選得到的步驟是合成不同的針對膜結(jié)合型白細胞分化抗原14的小干擾核糖核酸分子；按照高效轉(zhuǎn)染試劑操作方法，將這些小干擾核糖核酸分子轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞；實時熒光定量聚合酶鏈式反應，檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14信使核糖核酸的表達水平；進行蛋白質(zhì)印跡檢測膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達水平以確定干擾效果；最后篩選得到了本發(fā)明的小干擾核糖核酸分子。本發(fā)明的小干擾核糖核酸分子，能特異且高效阻斷膜結(jié)合型白細胞分化抗原14蛋白表達。
文檔編號C12N15/10GK102363781SQ201110317490
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月19日 優(yōu)先權日2011年10月19日
發(fā)明者張冬琳, 成鷹, 杜麗, 焦寒偉, 王鳳陽, 郝永昌, 雷明 申請人:海南大學