一種有效抑制小鼠pdk2表達(dá)的rna干擾序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種有效抑制小鼠PDK2表達(dá)的RNA干擾序 列，還設(shè)及該RNA干擾序列的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體中的丙酬酸脫氨酶復(fù)合體（pyruvatedehy化ogenaseComplex,PDC)能夠 催化丙酬酸氧化脫簇生成NADH和乙酷輔酶A,并把糖酵解與Ξ簇酸循環(huán)W及ATP的生成緊 密地聯(lián)系在一起。運(yùn)一重要反應(yīng)對于需要大量ATP的組織（如大腦、肌肉）來說至關(guān)重要。 通過PDC產(chǎn)生的乙酷輔酶A對于肝臟、脂肪運(yùn)樣能夠產(chǎn)生脂肪的組織來說也是非常重要的， 因為線粒體中的乙酷輔酶A可W通過形成巧樣酸（胞體乙酷輔酶A前體）進(jìn)入到脂肪酸的 合成過程。正是因為葡糖和脂肪酸之間存在運(yùn)種底物競爭，所W高活性的PDC能夠通過抑 制肉毒堿棟桐酷基轉(zhuǎn)移酶來限制線粒體脂肪酸的攝取。由于在哺乳動物中不存在由乙酷輔 酶A逆轉(zhuǎn)生成葡萄糖的通路，因此在葡萄糖缺乏的時候抑制PDC的活性對于葡萄糖的轉(zhuǎn)化 至關(guān)重要。在肝糖元耗竭時，PDC反應(yīng)的底物-丙酬酸作為葡萄糖合成的前體是肝臟和腎糖 異生所必須的。運(yùn)就使得血糖維持在一個穩(wěn)定的水平，W保證不能夠使用其他底物的組織 獲得ATP。除了脂肪酸氧化的產(chǎn)物（乙酷輔酶A和NADH)對PDC的異構(gòu)抑制外，丙酬酸脫氨 酶激酶（Pyruvatedehy化ogenasekinase,PDK)通過憐酸化PDC也可W抑制其活性。PDC 被PDK憐酸化失活后限制了丙酬酸被完全氧化或轉(zhuǎn)變成脂肪酸。同時，通過抑制PDK來增 加PDC的活性也是治療糖尿病、屯、臟病W及腫瘤的藥物祀點(diǎn)。
[0003] PDC是含有3個組分的復(fù)合體。運(yùn)3個組分能夠催化丙酬酸生成乙酷輔酶A:丙 酬酸脫氨酶（pyruvatedehy化ogenase，E1)、二氨硫辛酷胺乙酷基轉(zhuǎn)移酶（dihy化olipoyl transacetylase，E2)W及二氨硫辛酷胺脫氨酶（dihy化olipoamidedehy化ogenase， E3)。El催化生理可逆的步驟：PDKW及丙酬酸脫氨酶憐酸酶（pyruvatedehy化ogenase 地os地at巧hosphatases，PD巧調(diào)節(jié)的正是運(yùn)一活性。PDK和PDP催化可逆的憐酸化（失 活）和去憐酸化（激活）循環(huán)反應(yīng)。E1的憐酸化主要發(fā)生在3個特異的位點(diǎn)：264位絲氨 酸（位點(diǎn)1)、271位絲氨酸（位點(diǎn)2)、203位絲氨酸（位點(diǎn)3)。位點(diǎn)1的憐酸化速度最快， 而位點(diǎn)3的憐酸化速度最慢。因此，位點(diǎn)1的憐酸化是根據(jù)代謝需要快速調(diào)節(jié)活性PDC比 例的主要位點(diǎn)。
[0004] 在人類和曬齒類動物中目前鑒定出有4種PDK同工酶：PDK1、PDK2、PDK3W及 PDK4。其中PDK1在屯、臟、膜島和骨骼肌中被檢測到。而PDK2分布最廣，在屯、臟、肝臟和腎 臟中高水平表達(dá)。PDK3組織表達(dá)相對較局限（睪丸、腎臟和腦）。PDK4在屯、臟、氧化型肌 肉、肝臟和腎臟等組織中高豐度表達(dá)。E1憐酸化位點(diǎn)突變分析表明，4種PDK都可W憐酸化 位點(diǎn)1和位點(diǎn)2 ;而位點(diǎn)3只能被PDK1憐酸化。對于位點(diǎn)2，PDK4比PDKUPDK2和PDK3現(xiàn) 出更高的活性。PDK2可能通過憐酸化位點(diǎn)1來短期抑制PDC。如果PDK對于PDC的運(yùn)種憐 酸化調(diào)節(jié)異常，通常會引起一些人類疾病。 陽〇化]葡萄糖代謝產(chǎn)物能夠高度調(diào)節(jié)PDK的活性。乳酸（由糖酵解產(chǎn)生或是血液循環(huán) 中）代謝產(chǎn)生的El的底物丙酬酸、NAD+W及輔酶A都對PDK活性起到抑制作用。而線粒 體中PDC反應(yīng)和脂肪酸氧化的產(chǎn)物乙酷輔酶A及NADH能夠激活PDK。故而，增加線粒體中 NADH/NAD+W及乙酷輔酶A/輔酶A的濃度比例可W增加PDK的活性。營養(yǎng)條件和激素能夠 改變PDK的表達(dá)而影響葡萄糖-脂肪平衡。低血糖能夠促使膜島素的濃度降低從而使得脂 肪分解增加，并最終導(dǎo)致脂肪酸氧化水平增高、葡萄糖的利用降低W維持血糖平衡。膜島素 在調(diào)節(jié)血糖中具有重要作用，它能促進(jìn)葡萄糖氧化利用、抑制脂肪分解的作用。因此，饑餓 誘導(dǎo)的膜島素水平降低可W加劇脂肪組織中來源于Ξ酷甘油的脂肪酸氧化代謝。給饑餓過 夜的大鼠注入膜島素化后，骨骼肌中的PDK4在mRNA水平減少了 72%，同時在蛋白質(zhì)水平 減少了 20%，而膜島素憐酸化Akt和F0X01則在其中發(fā)揮了重要作用。
[0006] 由于PDK2表達(dá)組織廣泛，同時其參與了腫瘤、I型糖尿病及肝炎等的病理進(jìn)程。因 此，特異抑制PDK2已經(jīng)成為了運(yùn)些疾病的新治療祀標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種有效抑制小鼠PDK2表達(dá)的RNA干擾序 列；本發(fā)明的目的之二在于提供含有所述RNA干擾序列的慢病毒表達(dá)載體；本發(fā)明的目的 之Ξ在于提供所述RNA干擾序列的制備方法；本發(fā)明的目的之四在于提供所述RNA干擾序 列或所述慢病毒載體在抑制小鼠PDK2表達(dá)中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供所述RNA 干擾序列或所述慢病毒載體在促進(jìn)表達(dá)PDK2細(xì)胞的線粒體活性氧分泌中的應(yīng)用。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)過大量實驗，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] WPCR法擴(kuò)增小鼠PDK2分子全長的核巧酸序列（Genebank:NM_133667. 2;GI: 226958642)，使用生物信息學(xué)及研究計算軟件化ttp://si;rna.wi.mit.edu/home.地p)結(jié) 合DNAstar對PDK2的RNAi干擾序列進(jìn)行預(yù)測。獲得兩個針對PDK2的特異性RNAi序列 (命名：PDK2RNAi-l和PDK2RNAi-2)，具體如沈QIDNO. 3的第5~52位所示或如沈QID NO. 5的第5~52位所示。
[0010] 然后使用全基因合成方法合成RNAi序列，將SEQIDNO. 3與SEQIDNO. 4,或SEQ IDNO. 5與沈QIDNO. 6退火形成雙鏈，然后經(jīng)EcoRI和化cl酶切位點(diǎn)連入GVl15慢病毒 表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建GV115慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。
[0011] 對所獲得慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行測序，正確無誤后與包裝質(zhì)粒化Iper1. 0共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，收集上清并濃縮，獲得病毒顆粒。然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞如RAW264. 7細(xì)胞，結(jié)果顯示 轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDK2的表達(dá)受到顯著抑制，其中PDK2RNAi-2效果最佳。此外，抑制PDK2表達(dá)可 促進(jìn)RAW264. 7細(xì)胞線粒體活性氧（mtRO巧的分泌。
[0012] 因此，所述RNA干擾序列或慢病毒載體可W用于抑制小鼠PDK2表達(dá)的應(yīng)用。也可 W將RNA干擾序列或所述慢病毒載體在促進(jìn)表達(dá)PDK2細(xì)胞的線粒體活性氧分泌中的應(yīng)用。 其中表達(dá)PDK2細(xì)胞優(yōu)選為巨隧細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明獲得了有效抑制小鼠PDK2表達(dá)的RNA干擾序列， 能夠顯著干擾小鼠PDK2的表達(dá)，并且抑制PDK2表達(dá)可促進(jìn)RAW264. 7細(xì)胞線粒體活性氧 (mtRO巧的分泌，能夠提高細(xì)胞活性，增強(qiáng)免疫，能夠用于腫瘤、I型糖尿病及肝炎等疾病的 治療。
【附圖說明】
[0014] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0015] 圖1為慢病毒表達(dá)載體GV115載體圖譜。
[0016]圖2為第1條RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析，提示在M0I= 0. 1的條件下，其能 與有效感染Raw264. 7細(xì)胞（其中綠色為載體表達(dá)的GFP蛋白）。
[0017]圖3為第2條RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析。提示在M0I= 0. 1的條件下，其能 與有效感染Raw264. 7細(xì)胞（其中綠色為載體表達(dá)的GFP蛋白）。
[0018] 圖4經(jīng)RNAi干擾后RAW264.7細(xì)胞表達(dá)PDK2的Western-blot分析。
[0019] 圖5經(jīng)RNAi干擾后RAW264. 7細(xì)胞表達(dá)PDK2的qPCR分析。 W20] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)（FACs)分析表明，經(jīng)RNAi干擾PDK2表達(dá)后，LPS可促進(jìn)RAW264. 7細(xì)胞mtROS的分泌。
【具體實施方式】
[0021] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第Ξ版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022] 實施例1、小鼠PDK2特異性RNAi預(yù)測
[0023]根據(jù)小鼠PDK2 基因全長的核巧酸序列（Genebank:NM_133667. 2 ;GI:226958642)， 獲得其編碼框序列，具體如SEQIDNO. 1所示，氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0024] 然后根據(jù)生物信息學(xué)及計算軟件化ttp://si;rna. wi. mit. edu/home.地p)結(jié)合 DNAstar軟件對PDK2的RNAi干擾序列進(jìn)行預(yù)測。獲得兩個針對PDK2的特異性RNAi序列。
[0025] 獲得的針對小鼠PDK2的特異性RNAi其序列分別是：
[0026] PDK2RNAi-l：
[0027] siPdk2-F:aatt邑a邑aa邑ac邑tcattcactttcctc邑a邑邑aaa邑t邑aat邑ac邑tcttctcttttttta t佛Q ID NO.3);
[0028]siPdk2-R:曰曰曰曰曰曰曰邑曰邑曰曰邑曰c邑tc曰ttc曰ctttcctc邑曰邑邑曰曰曰邑t邑曰曰t邑曰c邑tcttctc(SEQ IDNO. 4)ο
[0029]PDK2RNAi-2 ：
[0030]siPdk2-5F:aattaaacacattggcagcatcgatctcgagatcgatgctgccaatgtgtttttttttt at佛QIDNO. 5);
[0031] siPdk2-5R:曰曰曰曰曰曰曰曰曰曰c曰c曰ttggc曰gc曰teg曰tctcg曰g曰teg曰tgctgcc曰曰tgtgttt(SEQ IDNO. 6) 〇
[0032] 各部分功能如表1所示。
[0033]表1、PDK2的特異性RNAi序列各部分結(jié)構(gòu)
[0034]
[0035] 使用全基因合成萬法合成SEQIDNO. 3~SEQIDNO. 6所示序列，并在兩端分別 加入EcoRI及化cl酶切位點(diǎn)，分別將沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4,SEQIDNO. 5和沈QID NO. 6退火后連接入GV115慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（圖1)，獲得重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為 GV115 :PDK2RNAi-l和GV115 :PDK2RNAi-2,然后對重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測序確認(rèn)無誤后 與包裝質(zhì)?；疘per1. 0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清并濃縮，獲得慢病毒顆粒。
[0036] 實施例2、小鼠PDK2特異性RNAi對RAW264. 7細(xì)胞PDK2分子表達(dá)沉默的分析及驗 證
[0037] 小鼠巨隧細(xì)胞^胖264.7細(xì)胞病毒感染：在6孔板中生長的^胖264.7細(xì)胞，70% 鋪滿細(xì)胞底后，加入實