專利名稱：包括d-松醇作為活性成分的用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的組合物的制作方法
包括D-松醇作為活性成分的用于預(yù)防或治療骨代謝病癥
的組合物發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包括D-松醇作為活性成分的用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的組合物。
背景技術(shù)：
骨支持人體的肌肉或器官并通過包圍內(nèi)臟保護(hù)它們免受外來的沖擊。骨是人體 的重要部分，其不僅儲(chǔ)存體內(nèi)的鈣，而且還儲(chǔ)存必要的無機(jī)物質(zhì)諸如磷或鎂。成年人的老 的骨基質(zhì)被去除并替換為新的骨基質(zhì)。通過重復(fù)的再吸收和破壞過程來保持骨產(chǎn)生的 平衡。這個(gè)過程稱為骨重新塑造(Yamaguchi A.等人，Tanpakushitsu Kakusan Koso, 50(6Suppl) =664-669 (2005)) 骨基質(zhì)的更新對(duì)于由應(yīng)力和骨生長所產(chǎn)生的骨的細(xì)微損 傷的恢復(fù)以及骨功能的適當(dāng)維持來說都是必不可少的(Cohen-Solal M.等人，Therapie, 58(5) :391-393(2003))。眾所周知，有兩種類型的細(xì)胞與骨重新塑造有關(guān)。一種是負(fù)責(zé)構(gòu)建骨的成骨細(xì)胞， 另一種是負(fù)責(zé)破壞骨的破骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞產(chǎn)生RANKL(核因子-k B配體的受體活化劑) 及其誘鉺受體0PG (骨保護(hù)素)。其中RANKL結(jié)合于破骨細(xì)胞祖細(xì)胞上的RANK (核因子-k B 的受體活化劑)，破骨細(xì)胞祖細(xì)胞成熟，變?yōu)槠乒羌?xì)胞，允許發(fā)生骨吸收。然而，在0PG結(jié)合 于RANKL時(shí)，RANKL對(duì)RANK的結(jié)合被阻斷，并導(dǎo)致阻止破骨細(xì)胞形成和抑制骨吸收(Theill LE.等人，Annu Rev Immunol, 20 795-823 (2002) ；Wagner EF.等人，Curr Op in Genet Dev, 11:527-532(2001))。老的骨的再吸收或破壞由衍生自血細(xì)胞(造血干細(xì)胞)的破骨細(xì)胞 進(jìn)行，所述破骨細(xì)胞在骨上侵蝕一個(gè)孔并釋放少量鈣到血流中。所釋放的鈣可用于保持身 體功能(William J.等人，Nature，423 :337_342 (2003))。成骨細(xì)胞可以通過如下的過程產(chǎn)生剛性的新骨來重建骨架用膠原蛋白填充骨上 的孔并用鈣和磷的羥磷灰石將其覆蓋(Stains JP.等人，Birth Defects Res C Embryo Today, 75(1) =72-80 (2005)) 0為了保持恒定的骨密度，破壞骨的破壞速率必須與骨的成骨 速率相同。在骨重新塑造的平衡被破壞時(shí)，可能出現(xiàn)各種疾病，例如骨質(zhì)疏松癥(

圖1)。骨質(zhì)疏松癥是其中由于各種原因?qū)е鹿琴|(zhì)量減少并且由于骨組織上的顯微結(jié)構(gòu) 的退化使骨折的風(fēng)險(xiǎn)不斷升高的病癥。骨質(zhì)疏松癥是其中骨的礦物質(zhì)(例如，鈣)和基質(zhì)的 含量已經(jīng)降低的狀態(tài)。在由于骨重新塑造的失調(diào)而使破骨作用(骨關(guān)節(jié)炎，osteoclasis) 的活性變得優(yōu)于成骨作用的活性時(shí)，可能出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥(Iqbal匪.，South Med J, 93(1) :2-18(2000))。骨質(zhì)疏松癥患者的特征在于在更年期開始時(shí)發(fā)生的快速的骨損失(每年損失 2-3% )0骨質(zhì)疏松癥根據(jù)其起因而被分為兩種類型的疾病經(jīng)絕期后骨質(zhì)疏松，其中脊髓 壓力和腕骨的骨折風(fēng)險(xiǎn)升高；以及繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，其是由各種與年齡無關(guān)原因產(chǎn)生的， 所述與年齡無關(guān)原因諸如疾病(內(nèi)分泌病、胃腸機(jī)能紊亂、惡性腫瘤)、藥物(腎上腺皮質(zhì)激素、抗癌用化療、甲狀腺激素、抗驚厥劑、抗凝血?jiǎng)?、甲氨蝶?methotexate)、環(huán)孢素、GnRH 等)、酒精、吸煙和意外(Rosep CJ.，NEnngl J Med, 353 (6) 595-603 (2005) ；Davidson M.， ClinicainReviews,12(4) :75_82(2o02))。目前以兩個(gè)方向開發(fā)通過抑制破骨細(xì)胞功能起作用的骨質(zhì)疏松癥治療劑。第 一個(gè)是開發(fā)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收過程的藥物?？梢詫⒖梢宰柚狗只钠乒羌?xì)胞的骨 吸收過程的物質(zhì)直接用作骨質(zhì)疏松癥治療劑。第二個(gè)是要研究可以抑制破骨細(xì)胞形成 (osteoclastogenesis)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。與免疫細(xì)胞的分化一樣，破骨細(xì)胞由存在于骨髓中的造血干細(xì)胞分化而來。破骨 細(xì)胞最初通過巨噬細(xì)胞分化因子、M-CSF(巨噬細(xì)胞-集落刺激因子)和TRANCE(TNF-相 關(guān)的活化誘導(dǎo)的細(xì)胞因子)分化為單核細(xì)胞，并最后通過TRANCE分化為破骨細(xì)胞(圖2) (1-6)。由骨重新塑造平衡的破壞引起的另一個(gè)重要的疾病是由于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨而 引起的骨損傷。癌轉(zhuǎn)移到骨通常發(fā)生在患有乳腺癌、前列腺癌或多發(fā)性骨髓瘤的患者中 (Kozlow ff.等人，J Mammary Gland BiolNeoplasia, 10(2) : 169-180 (2005))。已知的是， 這些癌患者的存活時(shí)間取決于癌癥轉(zhuǎn)移到骨的發(fā)生。在乳腺癌患者中觀察到的癌轉(zhuǎn)移到骨是溶骨性轉(zhuǎn)移，其中大部分骨被破壞并且 已知是通過刺激破骨細(xì)胞而非通過乳腺癌細(xì)胞的直接作用發(fā)生的(Boyde A.等人，Scan Electron Microsc，4 1537-1554 (1986))。另一方面，在前列腺癌中觀察到的癌轉(zhuǎn)移到骨是 成骨性轉(zhuǎn)移。還已知的是，成骨性轉(zhuǎn)移與骨質(zhì)溶解具有密切關(guān)系。已知D-松醇包含在松木和豆科植物中。發(fā)現(xiàn)從葉子花(Bougainvi 1 lea spectabilis)提取的未公開結(jié)構(gòu)的松醇樣物質(zhì)以0. 01g/kg的最低劑量會(huì)降低正常小鼠和 四氧嘧啶處理的胰島素缺乏的小鼠的血糖水平(Narayanan，C. R.，Joshi，D. D.，Mujumdar, A. M. , Dhekne, V. V. 1987.Pinitol-A new antidiabet ic compound from theleaves of Bougainvillea spectabilis. Current Science 56 :139141)。美國專利 5，827，896 提出了 D_松醇及其衍生物在治療代謝病癥糖尿病中的應(yīng)用。然而，尚未知D-松醇具有治療與骨有 關(guān)的疾病的功效。在本申請(qǐng)中，涉及了多種出版物和專利，并在括號(hào)中提供引證。這些出版物和專利 的公開內(nèi)容被全部并入本申請(qǐng)作為參考，以便充分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的 現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明詳述本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以便開發(fā)能夠用于有效地阻止或治療骨代謝病 癥并能夠安全地長期用于人體的物質(zhì)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，D-松醇具有抑制破骨細(xì)胞形成和分 化的不平常的活性，并能夠用作藥物用于通過改善骨代謝失調(diào)來治療或預(yù)防骨代謝病癥。因此，本發(fā)明的目的是提供用于抑制破骨細(xì)胞形成的組合物，所述組合物包括 D-松醇作為活性成分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供功能性食物組合物或藥物組合物，用于改善、預(yù)防或 治療骨代謝病癥，所述功能性食物組合物或藥物組合物包括D-松醇作為活性成分。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供預(yù)防或治療骨代謝病癥的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供D-松醇用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防或
4治療骨代謝病癥。通過以下發(fā)明詳述以及權(quán)利要求和附圖，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)會(huì)變得顯而易 見。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了用于抑制破骨細(xì)胞形成的組合物，所述組合物包 括D-松醇作為活性成分。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以便開發(fā)能夠用于有效地阻止或治療骨代謝病 癥并能夠安全地長期用于人體的物質(zhì)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，D-松醇具有抑制破骨細(xì)胞形成和分 化的不平常的活性，并能夠用作藥物用于通過改善骨代謝失調(diào)來治療或預(yù)防骨代謝病癥。本發(fā)明的發(fā)明人證明，D-松醇具有抑制從破骨細(xì)胞祖細(xì)胞到破骨細(xì)胞的分化過程 的活性。因此，包括D-松醇作為活性成分的本發(fā)明的組合物可以有效地用作抑制破骨細(xì)胞 形成的藥物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的藥物組合物，其 包括(a)治療有效量分D-松醇；和(b)藥學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了用于預(yù)防或改善骨代謝病癥的功能性食物組合 物，所述功能性食物組合物包括D-松醇作為活性成分。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的方法，其包括對(duì) 患有骨代謝病癥的受治療者給予包括(a)治療有效量的D-松醇；和(b)藥學(xué)可接受的載體 的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供D-松醇用于制備用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的藥物 的用途。作為本發(fā)明的活性化合物的“D-松醇”具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
<formula>formula see original document page 5</formula>如本文中使用的術(shù)語“D-松醇”包括具有與D-松醇相等的對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制 活性的“D-松醇樣化合物”。如本文中使用的，術(shù)語“D-松醇樣化合物”包括D-松醇的適合的衍生物或代謝產(chǎn) 物、包含D-松醇的化合物或D-松醇的前體藥物。如本文中使用的適合的D-松醇“衍生物”或“代謝產(chǎn)物”包括但不限于D-松醇糖 苷、D-松醇磷脂、酯化的D-松醇、脂質(zhì)結(jié)合的D-松醇、D-松醇磷酸酯、D-松醇肌醇六磷酸 酯及其組合物。如本文中使用的，術(shù)語“包含D-松醇的化合物”是指包含D-松醇部分作為較大結(jié) 構(gòu)組成的一部分的任何化合物。“包含D-松醇的化合物”包括但不限于包括D-松醇和一種 或多種另外的糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺、和甘露醇)的多糖以及D-松 醇與一種或多種金屬離子的絡(luò)合物或螯合物。如本文中使用的，術(shù)語“前體藥物”表示在體內(nèi)通過酶促或化學(xué)過程轉(zhuǎn)化為D-松醇但是表現(xiàn)出增強(qiáng)的遞送特征和/或治療價(jià)值的D_松醇衍生物。糖的前體藥物(例如，羥 基基團(tuán)被甲基化或乙?；男问?的制備和給藥是本領(lǐng)域中公知的(Baker等人，J.Med. Chem,27 :270_274(1984))。D-松醇可得自許多天然來源，例如松葉(pine needles)、雞豆(chick peas)、葉子 花屬葉子(Bougainvillea leaves)、紫花苜蓿(alfalfa)、大豆(soybeans)和其它豆科植 物，或者得自合成過程，優(yōu)選得自大豆級(jí)分。如本文中使用的，術(shù)語“破骨細(xì)胞”是指在其中由新的骨基質(zhì)代替老的骨基質(zhì)的骨 重新塑造過程中負(fù)責(zé)骨質(zhì)破壞的細(xì)胞。作為藥物組合物的活性成分的D-松醇具有抑制從破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化和形成破 骨細(xì)胞的過程的活性。因此，本發(fā)明的組合物可以有效地用于預(yù)防或治療骨代謝病癥。如本文中使用的，術(shù)語“骨代謝病癥”是指由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的活性或增 殖失衡所引起的病癥或疾病，例如由破骨細(xì)胞的過度活化或過度增殖引起的疾病或病況。 術(shù)語“由破骨細(xì)胞的過度活化或過度增殖引起的疾病或病況”是指從破骨細(xì)胞過度地活化 或增殖的狀態(tài)所產(chǎn)生的疾病。如本文中使用的，術(shù)語“預(yù)防”是指在可以發(fā)展為疾病或病癥但是尚未確診患病的 動(dòng)物中預(yù)防疾病或病癥發(fā)生。術(shù)語“治療”是指(i)抑制疾病或病癥的形成；(ii)減輕疾病 或病癥；和(iii)消除疾病或病癥。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物可用于改善、預(yù)防或治療由破骨細(xì)胞 產(chǎn)生過度的骨吸收所引起的病癥。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥和相關(guān) 的骨質(zhì)減少疾病。要用本發(fā)明的組合物治療、預(yù)防或改善的疾病包括骨質(zhì)疏松癥，特別是與圍絕經(jīng) 期或絕經(jīng)期后有關(guān)的骨質(zhì)疏松癥，佩吉特病，與骨贅生物有關(guān)的高鈣血癥和其它類型的骨 質(zhì)疏松疾病和相關(guān)病癥，所述相關(guān)病癥包括但不限于退化性骨質(zhì)疏松癥、I型或經(jīng)絕期后 骨質(zhì)疏松、II型或老年性骨質(zhì)疏松、幼年型骨質(zhì)疏松癥、特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、內(nèi)分泌異常、 甲狀腺功能亢進(jìn)、性腺機(jī)能減退、卵巢發(fā)育不全或特訥氏綜合癥、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)或 Cushing氏綜合征、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、骨髓異常、多發(fā)性骨髓瘤和相關(guān)病癥、系統(tǒng)性肥大細(xì) 胞增多癥、散布的癌、戈謝病、結(jié)締組織異常、成骨不全、高胱氨酸尿、埃-當(dāng)綜合征、馬氏綜 合征、門克斯綜合癥、制動(dòng)或失重(immobilization orweightlessness)、祖德克氏萎縮、慢 性阻塞性肺病、長期肝素給藥和抗驚厥藥物的長期攝取。本發(fā)明的組合物還用于但不限于治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周疾病、假體周 圍(periprosthetic)的骨質(zhì)溶解、其它自身免疫疾病、贅生性骨質(zhì)破壞、和與癌有關(guān)的骨 吸收病癥。還應(yīng)該理解，本發(fā)明的組合物可用于治療本文中沒有具體列舉的由破骨細(xì)胞的過 度活化或過度增殖所引起其它病癥和繼發(fā)性病況。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方案，由破骨細(xì)胞的過度活化或過度增殖所引起的其它病癥包 括骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高鈣血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、轉(zhuǎn)移性骨組織破壞、癌和免疫疾病。用于預(yù)防或治療由破骨細(xì)胞的過度活化或過度增殖所引起的病癥的本發(fā)明的藥物組合物還包括除活性成分之外的藥學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明的藥物組合物中，藥學(xué)可接受的載體可以是通常用于制劑的那些，包括 但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、rubber arable、磷酸鉀、arginate、明 膠、硅酸鉀、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、 羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、和礦物油。本發(fā)明的藥物組合物可以另外包括潤滑劑、濕 潤劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、助懸劑、和防腐劑。適合的藥學(xué)可接受的載體和制劑的細(xì)節(jié) 可以在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (19th ed.，1995)中找至Ij,所述文獻(xiàn)被并 入本文作為參考。
本發(fā)明的藥物組合物的適合的劑量可以取決于藥物配制方法、給藥方法、患者的 年齡、體重、性別、疾病的嚴(yán)重程度、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、對(duì)所用藥物組合物的排泄率 和敏感性而變化。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物以0. 001-1000mg/kg(體重)的日劑量給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以通過通常使用的途徑給藥，并且優(yōu)選非腸道給藥，即，通 過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、或局部給藥。優(yōu)選藥物組合物的給藥途徑由疾病的類型決 定。要被包含在這種組合物中作為活性成分的D-松醇的濃度可以取決于治療的目 的、患者的狀況、需要的時(shí)間段、疾病的嚴(yán)重程度來決定，而不局限于特定的濃度范圍。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，藥物組合物可以用如上所述的藥學(xué)可接受 的載體和/或媒介物來配制，最后提供包括單位劑量劑型和多劑量劑型的幾種劑型。制劑 可以是油或水介質(zhì)、再懸浮物或乳液、提取物、粉劑、顆粒劑、片劑和膠囊，并且還包括分散 劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的組合物可以制備用于提供食物組合物，特別是功能性食物組合物。所述 食物組合物可以包括用于制備食物組合物的常規(guī)添加劑，例如，蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、 營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)味劑。例如，在將本發(fā)明的食物組合物作為飲料提供時(shí)，其可以另外包括調(diào)味 劑和天然的碳水化合物以及作為活性成分的D-松醇。天然的碳水化合物的非限制性實(shí)例 包括但不限于單糖(例如，葡萄糖和果糖)、二糖(例如，麥芽糖和蔗糖)、低聚糖、多糖(例 如，糊精和環(huán)糊精)和糖醇(例如，木糖醇、山梨醇和赤蘚糖醇)。調(diào)味劑的非限制性實(shí)例包 括但不限于天然調(diào)味劑(例如，索馬甜、和Stevia的提取物)和合成調(diào)味劑(例如，糖精和 阿斯巴甜)。考慮到食物的可利用性，本發(fā)明的食物組合物對(duì)于預(yù)防、治療、或改善骨代謝病 癥非常有用。附圖簡述圖1示意性地表示破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)以及骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病 機(jī)制。圖2示意性地表示破骨細(xì)胞形成以及與其有關(guān)的細(xì)胞因子的功能。圖3示出了 D-松醇對(duì)Raw 264. 7細(xì)胞的增殖的影響。在用0，0. 2，0. 5，1，5，10，20 和50mM濃度的D-松醇處理之后以24小時(shí)間隔測量細(xì)胞數(shù)，持續(xù)3天。圖4示出了 D-松醇對(duì)骨髓衍生的造血干細(xì)胞增殖的濃度依賴性作用。圖5是照片，通過TRAP染色示出了 D-松醇對(duì)Raw 264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成的 影響。Raw 264. 7細(xì)胞用200ng/ml的RankL處理4天，然后在第四天通過TRAP染色確認(rèn)破 骨細(xì)胞形成。
圖6示出了根據(jù)D-松醇對(duì)Raw 264. 7細(xì)胞的處理濃度使用TRAP染色得到的破骨 細(xì)胞形成的多核破骨細(xì)胞數(shù)。
圖7示出了通過TRAP溶液分析得到的D-松醇對(duì)Raw 264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成 的濃度依賴性影響。圖8是示出了 D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化的濃度依賴性影響的照片。 將骨髓的造血干細(xì)胞與200ng/ml的RankL和50ng/ml的CSF保溫4天，然后在第四天通過 TRAP染色確認(rèn)破骨細(xì)胞形成。圖9表示通過TRAP染色得到的D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的多核化和破骨細(xì) 胞形成的濃度依賴性影響。圖10通過TRAP溶液分析示出了 D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的多核化和破骨 細(xì)胞形成的濃度依賴性影響。圖11是示出了在將成骨細(xì)胞和骨髓衍生的破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)D-松醇對(duì)破骨細(xì) 胞形成的濃度依賴性影響的照片。圖12表示D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞分化的每個(gè)階段的濃度依賴性影響。圖13是表示D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的骨質(zhì)吸收的濃度依賴性影響的照 片。下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實(shí)施例 意在更具體地舉例說明，權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明的范圍不限于實(shí)施例或受到實(shí)施例的限 制。
實(shí)施例方法Raw264. 7細(xì)胞的培養(yǎng)和破骨細(xì)胞的分化將妝《264.7細(xì)胞在包含10% 85(胎牛血清)的α-ΜΕΜ( α -最低必需培養(yǎng)基)中 培養(yǎng)。在檢查破骨細(xì)胞形成的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞調(diào)解到在96孔板上的2. 0 X IO3細(xì)胞/200 μ 1 并與200ng/ml的sRANKL保溫。在將細(xì)胞與分別為1、3. 5、7、12. 5、25和50mM的D-松醇濃 度處理培養(yǎng)3天之后在第四天進(jìn)行TRAP (酒石酸鹽耐酸性磷酸酶)染色和TRAP溶液分析。 將細(xì)胞固定，用于TRAP染色和TRAP溶液分析。將TARP陽性的多核(超過3個(gè)細(xì)胞核)細(xì) 胞計(jì)數(shù)為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞。使用LeicaDM IRM顯微鏡觀察細(xì)胞。TRAP 染色對(duì)于TRAP陽性的細(xì)胞的細(xì)胞化學(xué)染色，將培養(yǎng)基除去。然后，向細(xì)胞添加100 μ 1 的10%福爾馬林并在室溫下保溫10分鐘。添加100 μ 1的甲醇/丙酮并在室溫下保溫1 分鐘。將細(xì)胞用IOml的TRAP緩沖液(Tris-HCl, pH 4. 5，EDTA)、萘酚AS磷酸酯(底物， Sigma#N-4875)和5mg的固紅紫色染料(Sigma，F(xiàn)-1625)染色。使用溶解于150ml的N，N-二 甲基甲酰胺(DMF，Sigma#_319937)中的Img的萘酚AS磷酸酯。使反應(yīng)進(jìn)行10-30分鐘，然 后觀察紅色的顏色。在清楚地觀察到紅色的顏色時(shí)，將其用流水洗滌并干燥。在光學(xué)顯微 鏡下觀察TRAP染色的細(xì)胞。TRAP溶液分析根據(jù)以下方法進(jìn)行TRAP陽性細(xì)胞的TRAP溶液分析。除去培養(yǎng)基，添加100 μ 1的10%福爾馬林并在室溫下保溫10分鐘。在添加100 μ 1的甲醇/丙酮之后，在室溫下保溫 1分鐘，然后干燥。加入TRAP底物溶液并在37°C保溫20-30分鐘，所述TRAP底物溶液包括 溶解于20mlTRAP緩沖液(pH 5. 2)的pNPP (對(duì)硝基苯基磷酸酯)片劑。將100 μ 1的TRAP 底物溶液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，其中包含50 μ 1的IN NaOH0最后，在405nm測量OD (光密 度)值。D-松醇的細(xì)胞毒性分析為了驗(yàn)證D-松醇對(duì)Raw264. 7細(xì)胞的細(xì)胞毒性，將Raw264. 7細(xì)胞在96孔板上生 長，直到0. 5X103細(xì)胞/200μ 1。將細(xì)胞培養(yǎng)3天，同時(shí)用分別為1,3. 5,7,12. 5,25 ^P 50mM 的濃度的D-松醇處理。計(jì)數(shù)3天培養(yǎng)過程中增加細(xì)胞數(shù)，來確定所添加的化合物的細(xì)胞毒 性。為了研究D-松醇對(duì)骨髓細(xì)胞的細(xì)胞毒性，將骨髓細(xì)胞調(diào)節(jié)為在96孔板上的 1.0\105細(xì)胞/20(^1并與50叫/1111的M-CSF共同培養(yǎng)。然后使培養(yǎng)細(xì)胞生長4天，同時(shí)用 分別為1,3. 5,7,12. 5，25和50mM的濃度的D-松醇處理。使用CCK8試劑盒(Cell Counting Kit-8,Dojindo, Japan)測量細(xì)胞毒性。將10% CCK8溶液添加到每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)溶液 中并在37°C保溫2小時(shí)。在保溫之后，使用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Microplate reader) (Bio-Rad)測量450nm的吸光度。D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化的影響為了提取小鼠骨髓細(xì)胞，將3-4周齡的雄性C57BL/6小鼠的股骨和脛骨無菌摘出 并清除它們的軟組織。在所提取的骨組織中切掉長骨的兩端，然后通過在一端使用26G注 射器將α -MEM/10% FBS注射到骨髓腔中收集骨髓細(xì)胞。使收集的骨髓細(xì)胞經(jīng)受5ng/ml的 M-CSF并保溫16小時(shí)。收獲在板底部上的未連接的細(xì)胞。 為了誘導(dǎo)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化，在200ng/ml的s RANKL和50ng/ml的 M-CSF的存在下將每孔1. OX IO5細(xì)胞的骨髓細(xì)胞與α -MEM/10% FBS培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中將 D-松醇以不同的濃度添加到培養(yǎng)基中。在每個(gè)濃度進(jìn)行三個(gè)實(shí)驗(yàn)，并在包含sRANKL、M-CSF 和D-松醇的完全培養(yǎng)基中生長第三天之后更換培養(yǎng)基。在第四天在Leica DMIRM顯微鏡 下觀察細(xì)胞并進(jìn)行TRAP染色和TRAP溶液分析。為了考查在每個(gè)培養(yǎng)階段的D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞的影響，將D-松醇以不同的濃度 添加到破骨細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間分離用D-松醇處理的破骨細(xì)胞，然后使用 TRAP溶液分析來分析分化的破骨細(xì)胞的量。成骨細(xì)胞制備和與破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)為了制備小鼠的初級(jí)成骨細(xì)胞，將1天齡的胎小鼠的額骨和頂骨無菌摘出。在用 PBS溶液洗滌所摘出的骨組織之后，隨后以20分鐘間隔將其用混合酶溶液(0.2%膠原酶和 0.1%中性蛋白酶)處理6次。收獲具有成骨細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，然后用培養(yǎng)溶液洗滌。將經(jīng) 過洗滌的細(xì)胞在包含10%血清的α -MEM中培養(yǎng)3天并用作初級(jí)成骨細(xì)胞。以在包含維生 素D3(KT6M)和前列腺素E2(PGE2，I(T8M)的96孔板上培養(yǎng)1.0X104細(xì)胞/200 μ 1成骨細(xì)胞 和1. OX IO5細(xì)胞的骨髓細(xì)胞的方式進(jìn)行共培養(yǎng)，持續(xù)5天。在培養(yǎng)之后進(jìn)行TRAP染色。測量破骨細(xì)胞在骨吸收過程中的降解能力為了考查D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞在骨吸收過程中的降解能力的影響，將齒骨片段添加到96孔板中，然后培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，直到1. 0 X IO5細(xì)胞/200 μ 1。對(duì)于破骨細(xì)胞的分化，添加50ng/ml的M-CSF和200ng/ml的s RANKL0以濃度依賴性的方式將D-松醇添加到培養(yǎng) 基中并保溫4天。在完成培養(yǎng)之后觀察破骨細(xì)胞的分化，將細(xì)胞從骨片段中取出并通過1 % 甲苯胺藍(lán)染色在顯微鏡中觀察。結(jié)果
D-松醇對(duì)Raw264. 7細(xì)胞的細(xì)胞毒性本發(fā)明的發(fā)明人考查了不同濃度的D-松醇的細(xì)胞毒性。通過用不同濃度的D-松 醇處理Raw264. 7細(xì)胞考查D-松醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響。培養(yǎng)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞系，Raw264. 7 細(xì)胞，并用0-50mM濃度的D-松醇處理。以24小時(shí)間隔計(jì)數(shù)存活的細(xì)胞數(shù)，持續(xù)3天。如 圖3中所示，應(yīng)該理解，即使在50mM D-松醇的最高濃度也沒有觀察到Raw264. 7細(xì)胞細(xì)胞毒性。D-松醇對(duì)造血干細(xì)胞的細(xì)胞毒性本發(fā)明的發(fā)明人考查了 D-松醇對(duì)造血干細(xì)胞的細(xì)胞毒性。從骨髓提取造血干細(xì) 胞，然后通過用M-SCF(50ng/ml)處理來誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。然后，將誘導(dǎo)增殖的細(xì)胞用0_50mM 的D-松醇處理，并通過測量CCK8酶活性測定D-松醇對(duì)細(xì)胞增殖的影響。如圖4中所示， 在0-50mM的范圍內(nèi)，D-松醇對(duì)CCK8活性沒有影響。不超過50mM的D-松醇對(duì)造血干細(xì)胞 的增殖沒有影響。D-松醇對(duì)Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成的抑制活性-TRAP染色在通過RankL引發(fā)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，Raw264. 7細(xì)胞開始分化為破骨細(xì)胞。在分化 的早期發(fā)生細(xì)胞之間的融合。在分化完成時(shí)，破骨細(xì)胞變?yōu)榫哂?-50個(gè)細(xì)胞核的多核細(xì) 胞。多核細(xì)胞的形成是與破骨細(xì)胞分化有關(guān)的典型性質(zhì)。破骨細(xì)胞形成可以通過TRAP染 色來確認(rèn)。將Raw264. 7細(xì)胞系用200ng/ml的RankL處理4天。如圖5中所示，在沒有向 Raw264. 7細(xì)胞系添加RankL時(shí)(陰性對(duì)照)沒有發(fā)生Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成。在 向Raw264. 7細(xì)胞系添加200ng/ml的RankL時(shí)(陽性對(duì)照)，細(xì)胞之間的融合顯著增加。通 過RankL活化的細(xì)胞在TRAP染色中強(qiáng)烈地表現(xiàn)出猩紅色的顏色，并觀察到多核細(xì)胞，所述 融合的細(xì)胞。為了考查D-松醇對(duì)Raw264. 7細(xì)胞的分化過程的影響，向Raw264. 7細(xì)胞的培養(yǎng)物 添加表現(xiàn)出沒有細(xì)胞毒性的最高50mM濃度的D-松醇，然后，觀察破骨細(xì)胞形成。如圖5中 所示，隨著D-松醇濃度的增加，破骨細(xì)胞形成受到顯著削弱。在TRAP染色中觀察到的多核 細(xì)胞數(shù)目也隨D-濃度的增加而減少。通過這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)D-松醇是抑制破骨細(xì)胞形成的 物質(zhì)。為了量化D-松醇在Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成中的抑制活性，根據(jù)不同D-松 醇處理濃度，通過TRAP染色測量多核細(xì)胞數(shù)。如圖6中所示，隨著D-松醇濃度的增加，多 核細(xì)胞數(shù)顯著減少。因此，應(yīng)該理解，D-松醇是抑制Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成的物質(zhì)。 D-松醇在50mM的濃度使破骨細(xì)胞形成抑制幾乎100%。
D-松醇對(duì)Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成的抑制活性-TRAP溶液分析為了研究D-松醇在Raw264. 7細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成中的抑制活性，進(jìn)行TRAP溶液 分析。已知TRAP(酒石酸鹽耐酸性磷酸酶)是破骨細(xì)胞形成中的典型的標(biāo)記物蛋白。如圖 7中所示，在TRAP溶液分析中得到的結(jié)果與TRAP染色的結(jié)果相似，證明了 D-松醇對(duì)于破骨細(xì)胞形成的抑制活性。然而，得自TRAP溶液分析的D-松醇抑制活性與通過計(jì)數(shù)多核細(xì)胞 數(shù)得到的抑制活性相比相對(duì)較弱。從這些結(jié)果，可以提示D-松醇對(duì)TRAP陽性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化機(jī)制的影響是相對(duì)弱的，盡管TRAP作為破骨細(xì)胞標(biāo)記物有重要性。D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化的抑制活性-TRAP染色破骨細(xì)胞由骨髓中的單核細(xì)胞分化得到。骨髓衍生的破骨細(xì)胞是最接近存在于生 物體中的破骨細(xì)胞的初生細(xì)胞，其與Raw264. 7細(xì)胞形成對(duì)比。從骨髓分離破骨細(xì)胞的祖細(xì)胞，然后用于分化為破骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?？梢匀?Raw264. 7細(xì)胞那樣通過TRAP染色在骨髓衍生的破骨細(xì)胞中觀察多核細(xì)胞的分化形式。如圖8中所示，可以確認(rèn)，在RankL(200ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)(陽性對(duì)照)的 存在下從骨髓培養(yǎng)祖細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)4天時(shí)形成破骨細(xì)胞。然而，在未用細(xì)胞因子處理的細(xì) 胞(陰性對(duì)照)中沒有觀察到破骨細(xì)胞。為了研究D-松醇對(duì)從骨髓衍生的單核細(xì)胞分化破骨細(xì)胞的影響，從骨髓提取造 血干細(xì)胞并用M-CSF (5ng/ml)活化1天，導(dǎo)致誘導(dǎo)分化為單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞在200ng/ ml的RankL和50ng/ml的M-CSF的存在下培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)過程中添加0_50mM的D-松醇 并使用TRAP染色觀察破骨細(xì)胞的分化模式。如圖8中所示，TRAP染色的破骨細(xì)胞的數(shù)目與 D-松醇的濃度成比例地減少，表明D-松醇抑制骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化，這與Raw264. 7 細(xì)胞相似。為了量化D-松醇對(duì)骨髓衍生的單核細(xì)胞的破骨細(xì)胞形成的影響，使用TRAP染色 測量樣品內(nèi)的破骨細(xì)胞細(xì)胞數(shù)。如圖9中所示，多核細(xì)胞數(shù)目隨著D-松醇濃度的增加而減 少并且從25mM觀察到顯著減少。50mM濃度的D-松醇使破骨細(xì)胞形成抑制幾乎達(dá)100%。D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化的抑制活性-TRAP溶液分析為了確定D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用，使用TRAP溶液分析來分析由骨髓 初級(jí)細(xì)胞衍生的破骨細(xì)胞。如圖10中所示，在TRAP溶液分析中也觀察到對(duì)骨髓衍生的破 骨細(xì)胞分化的抑制作用，這表明D-松醇對(duì)于骨髓衍生的初級(jí)細(xì)胞分化為TRAP陽性細(xì)胞有 抑制作用。D-松醇對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)中的破骨細(xì)胞形成的抑制活性成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)是可以提供與人體最相似環(huán)境的并且允許研 究破骨細(xì)胞形成過程的共培養(yǎng)系統(tǒng)。從小鼠顱骨提取成骨細(xì)胞，然后與骨髓的造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，以便誘導(dǎo)破骨細(xì)胞 的分化。通過在分化誘導(dǎo)過程中用0-50mM范圍內(nèi)的D-松醇處理細(xì)胞來研究D-松醇對(duì)破 骨細(xì)胞形成的影響如圖11中所示，多核破骨細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)隨著D-松醇濃度的增加而顯著 減少。在50mM D-松醇的濃度時(shí)破骨細(xì)胞形成明顯地受到抑制。從這個(gè)結(jié)果，可以理解， D-松醇對(duì)于與人體非常相似的共培養(yǎng)系統(tǒng)中的破骨細(xì)胞分化也有抑制作用。D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞形成的各個(gè)階段中的破骨細(xì)胞分化的抑制活性為了分析D-松醇對(duì)骨髓衍生的破骨細(xì)胞分化的各個(gè)階段的影響，以時(shí)間依賴性 的進(jìn)程估計(jì)在不同濃度D-松醇的存在下培養(yǎng)的破骨細(xì)胞的分化狀態(tài)。如圖12中所示，隨 著D-松醇濃度的增加，破骨細(xì)胞的多核細(xì)胞數(shù)目顯著減少。在不低于25mM的D-松醇時(shí)， 從培養(yǎng)之后的2天開始，骨髓衍生的破骨細(xì)胞的分化顯著受到抑制。以50mM濃度的D-松醇處理時(shí)，明顯地顯示出D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制活性，這證明D-松醇是在破骨細(xì)胞 形成的早期階段產(chǎn)生抑制作用的化合物。還應(yīng)該理解，D-松醇影響破骨細(xì)胞形成的細(xì)胞融合階段。
D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收和降解的抑制活性在身體內(nèi)，骨碎片被破骨細(xì)胞降解和吸收。使用骨碎片測定破骨細(xì)胞的骨吸 收_降解能力是體內(nèi)估計(jì)破骨細(xì)胞功能的適合的分析方法。為了研究D-松醇對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收-降解能力的影響，在得自人牙齒的骨碎片 上在分化為破骨細(xì)胞的過程中將細(xì)胞用0-50mM范圍內(nèi)的D-松醇處理。如圖13中所示，使 用骨染色試驗(yàn)法證實(shí)，破骨細(xì)胞的骨吸收_降解能力隨著D-松醇濃度的增加顯著地降低。 特別地，在不低于25mM的濃度時(shí)，破骨細(xì)胞的骨吸收-降解能力顯著地降低。這個(gè)結(jié)果證 明，對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用與對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收_降解能力的抑制有關(guān)。已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解，落入本發(fā)明范圍內(nèi)的變體和改進(jìn) 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等價(jià)物來決 定。參考文獻(xiàn)1. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factorreceptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in Tcells. J Biol Chem. 1997 Oct 3 ； 272(40) :25190-4.2.Diverse roles of the tumornecrosis factor family memberTRANCE in skeletal physiology revealed by TRANCE deficiency andpartial rescue by al ymphocyte-expressed TRANCE trans gene. ProcNatl Acad Sci USA. 2000Sep 26 ； 97(20) 10905-10.3.TRANCE, a TNF family member, act ivates Akt/PKB througha signaling complex inyolving TRAF6and c-Src. Mol Cell.1999Dec ；4(6) 1041-9.4. Bisphosphona tes :Mechanisms of Action. Endocr. Rev. , Febl998 ； 19 80-100.5. The pathobiology of the osteoclast. J. Clin. Pathol. , Mar 1985 ；38 241-252.6. Cancer and Bone. Endocr. Rev.，F(xiàn)eb 1998 ；19 18-54.
權(quán)利要求
用于抑制破骨細(xì)胞形成(osteoclastogenesis)的組合物，其包括D-松醇作為活性成分。
2.用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的藥物組合物，其包括(a)治療有效量的D-松醇；和 (b)藥學(xué)可接受的載體。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述骨代謝病癥為骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高鈣血癥、贅 生性破壞(neoplastic destruction)、與癌有關(guān)的骨吸收疾病、骨質(zhì)溶解、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 或免疫性疾病。
4.用于預(yù)防或改善骨代謝病癥的功能性食物組合物，其包括D-松醇作為活性成分。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述骨代謝病癥為骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高鈣血癥、贅 生性破壞、與癌有關(guān)的骨吸收疾病、骨質(zhì)溶解、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或免疫性疾病。
6.用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的方法，包括對(duì)患有骨代謝病癥的受治療者給予藥物組 合物，所述藥物組合物包括(a)治療有效量的D-松醇；和(b)藥學(xué)可接受的載體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述骨代謝病癥為骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高鈣血癥、贅生 性破壞、與癌有關(guān)的骨吸收疾病、骨質(zhì)溶解、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或免疫性疾病。
8.D-松醇用于制備藥物的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療骨代謝病癥。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述骨代謝病癥為骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、高鈣血癥、贅 生性破壞、與癌有關(guān)的骨吸收疾病、骨質(zhì)溶解、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或免疫性疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括D-松醇作為活性成分的用于抑制破骨細(xì)胞形成的組合物和用于預(yù)防或治療骨代謝病癥的藥物組合物。本發(fā)明的組合物對(duì)破骨細(xì)胞的分化有抑制活性并且可用于預(yù)防或治療由破骨細(xì)胞過度活化或過度增殖所引起的骨代謝病癥。
文檔編號(hào)A61K47/00GK101808628SQ200880108501
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日
發(fā)明者盧載郎, 明賢君 申請(qǐng)人:索建特股份有限公司