技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明提供一種cpg復(fù)合佐劑在muc1融合蛋白抗腫瘤中的用途，涉及cpg-odn2006與mf59聯(lián)合作為免疫佐劑在重組muc1-mbp融合蛋白抗腫瘤中的醫(yī)用用途，屬于免疫學(xué)治療領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
：

cpg-odn是人工合成的含有非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cpg)的寡脫氧核苷酸(odn)，可模擬細(xì)菌dna刺激b細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞活化，間接激活nk和t細(xì)胞等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的加工和提呈，誘導(dǎo)th1型免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可用于腫瘤治療、過敏性疾病、感染性疾病、免疫功能低下者。目前公認(rèn)的對(duì)人免疫刺激活性最強(qiáng)是cpg-odn2006。國外已經(jīng)對(duì)cpg-odn2006進(jìn)行了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，包括對(duì)黑色素瘤、肺小細(xì)胞癌、皮膚t細(xì)胞淋巴瘤，證實(shí)是高效低毒的新型免疫佐劑。國內(nèi)沃森生物將cpg-odn作為乙型肝炎疫苗佐劑，目前正在進(jìn)行臨床iii期實(shí)驗(yàn)，而國內(nèi)目前尚未發(fā)現(xiàn)用于腫瘤疫苗佐劑的報(bào)道。

mf59是將span85(0.5％，v/v),tween80(0.5％，v/v)，角鯊烯(4.3％，v/v)混和乳化制得的水包油乳劑，1997年作為流感疫苗佐劑在歐盟獲批上市。因其誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的效果更好，常被用于人類流感疫苗。但近年，已有研究者通過向疫苗制劑中添加病原相關(guān)分子模式(pamp)的模擬物來改變mf59的免疫特點(diǎn)，并證實(shí)mf59聯(lián)合其它佐劑確實(shí)可以通過某些機(jī)制向利于腫瘤免疫的th1方向發(fā)展。這為mf59在其他領(lǐng)域存在潛在應(yīng)用價(jià)值提供了一定的理論基礎(chǔ)。

muc1是mucins粘蛋白家族的重要成員，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及其來源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核芯(核芯肽)和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。由于正常組織muc1與腫瘤組織不同，使其成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)。經(jīng)反復(fù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及部分人體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，muc1是腫瘤疫苗研制的有效靶點(diǎn)。目前以muc1為靶點(diǎn)研制的腫瘤疫苗，49個(gè)處于臨床試驗(yàn)階段，其中，tg4010和tecemotide也已經(jīng)完成iii期臨床并取得良好的結(jié)果。本研究組長期以來以muc1為靶點(diǎn)，首次通過基因工程技術(shù)將muc1基因與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白偶聯(lián)制成重組muc1-mbp融合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)重組muc1-mbp融合蛋白單獨(dú)免疫小鼠，很難產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答；而與cpg-odn2006聯(lián)合免疫，既能產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，又能產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答；尤其是當(dāng)cpg-odn2006與mf59聯(lián)合后，能更加顯著協(xié)同增強(qiáng)重組muc1-mbp融合蛋白誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮更加顯著的抗腫瘤作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供了一種cpg復(fù)合佐劑在muc1融合蛋白抗腫瘤中的用途，用于人類治療或預(yù)防腫瘤。

所述的cpg復(fù)合佐劑為cpg-odn與mf59聯(lián)合復(fù)合佐劑，其中，cpg-odn2006，序列是：5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'，也稱cpg-odn7909，是一種非甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸為核心的序列。mf59是將span85(0.5％，v/v),tween80(0.5％，v/v)，角鯊烯(4.3％，v/v)混和乳化制得的水包油乳劑。

本發(fā)明涉及cpg-odn2006與mf59以及muc1-mbp聯(lián)合適用于下述醫(yī)療用途：

1.cpg-odn2006與mf59作為重組muc1-mbp融合蛋白佐劑，三者聯(lián)合作為治療性疫苗，治療癌癥包括表達(dá)muc1的腺癌、肝癌、血液腫瘤等。

2.cpg-odn2006與mf59作為重組muc1-mbp融合蛋白佐劑，三者聯(lián)合作為預(yù)防性疫苗，應(yīng)用于各種表達(dá)muc1的各種癌癥的預(yù)防，包括表達(dá)muc1的腺癌、肝癌、血液腫瘤等。

本發(fā)明所述的cpg-odn2006與mf59復(fù)合佐劑的制備工藝，包括以下步驟：

1、將span85、tween80、角鯊烯和10nm檸檬酸鈉分別按照體積比0.5％、0.5％、4.3％和94.7％進(jìn)行混合，用乳化機(jī)乳化10min，變成乳白色勻質(zhì)狀，制成mf59乳劑；

2、采用冷凍離心機(jī)離心，6000rpm離心5min不發(fā)生分層，即達(dá)到乳化標(biāo)準(zhǔn).

3、經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，備用；

4、將cpg-odn2006按照2mg/ml溶于水中，與mf59乳劑按照1:2體積比進(jìn)行混合制成復(fù)合佐劑。

通過研究實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明cpg-odn2006與mf59與muc1-mbp融合蛋白不僅協(xié)同刺激誘導(dǎo)muc1特異性體液免疫應(yīng)答，而且能顯著協(xié)同誘導(dǎo)muc1特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，并具有顯著的抗腫瘤作用。因此，cpg-odn2006與mf59與muc1-mbp三者聯(lián)用可作為癌癥疫苗開發(fā)應(yīng)用于臨床免疫治療和預(yù)防領(lǐng)域。

本發(fā)明的積極效果在于：以cpg-odn2006與mf59作為聯(lián)合佐劑，利用它們的聯(lián)合協(xié)同增強(qiáng)重組muc1-mbp誘導(dǎo)muc1特異性抗體應(yīng)答和t細(xì)胞免疫應(yīng)答，協(xié)同誘導(dǎo)顯著地抑制腫瘤的效果，cpg-odn2006與mf59聯(lián)合重組muc1-mbp融合蛋白可作為疫苗用于表達(dá)muc1的腫瘤包括腺癌、血液腫瘤等治療或預(yù)防的用途；cpg-odn2006與mf59聯(lián)合可制成重組muc1-mbp疫苗的佐劑。

附圖說明

圖1為重組muc-mbp的sds-page分析電泳圖；

圖2為不同佐劑聯(lián)合對(duì)muc1-mbp誘導(dǎo)的荷瘤小鼠生存期的影響曲線圖。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

cpg-odn2006與mf59復(fù)合佐劑的制備工藝，包括以下步驟：

將0.5mlspan85、0.5mltween80和4.3ml角鯊烯加入10nm檸檬酸鈉94.7ml中，用乳化機(jī)乳化10min，變成乳白色勻質(zhì)狀，制成mf59乳劑。采用冷凍離心機(jī)離心，6000rpm離心5min不發(fā)生分層，即達(dá)到乳化標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，備用。將cpg-odn2006按照2mg/ml溶于水中，與mf59乳劑按照1:2體積比進(jìn)行混合制成復(fù)合佐劑。

實(shí)施例2

cpg-odn2006與mf59復(fù)合佐劑聯(lián)合muc1-mbp融合蛋白疫苗的制備工藝，包括以下步驟：

重組muc1-mbp融合蛋白(純度98％，內(nèi)度素小于5eu/mg)參見重組人muc1-mbp融合蛋白抗腫瘤疫苗及生產(chǎn)工藝，(專利號(hào)zl03111045.2)制備；按照實(shí)施例1中的方法制備cpg-odn2006與mf59復(fù)合佐劑；將muc1-mbp融合蛋白與復(fù)合佐劑按照1：3體積的比例混合制成疫苗。

實(shí)驗(yàn)例1

1.材料

重組muc1-mbp融合蛋白(純度98％，內(nèi)度素小于5eu/mg)參見重組人muc1-mbp融合蛋白抗腫瘤疫苗及生產(chǎn)工藝，(專利號(hào)zl03111045.2)制備，丙烯酰胺和tris購自sigma公司，亞甲丙烯酰胺購自上海生物工程公司，bsa購自碧云天生物科技有限公司。

2.方法

2.1重組muc1-mbp純度分析

將重組muc1-mbp融合蛋白10μl加入10％分離膠和4％濃縮膠sds-page凝膠上樣孔中，并采用低分子量蛋白marker作為對(duì)照，在10-20ma下進(jìn)行電泳，結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行顏色分析。

2.2重組muc1-mbp含量分析

將重組muc1-mbp融合蛋白稀釋成6個(gè)稀釋度，按照bca試劑盒說明書進(jìn)行操作，配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，采用酶標(biāo)儀檢測吸光光度值a490nm。

3.結(jié)果

3.1重組muc1-mbp的鑒定

將本研究組制備的重組muc-mbp通過sds-page分析，如圖1所示，在62kd處可見一條較純的條帶，通過分析結(jié)果表明，電泳純度為100％.結(jié)果與預(yù)期一致，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

3.2重組muc1-mbp的含量分析

經(jīng)bca試劑盒分析結(jié)果表明1.15mg/ml,與實(shí)際值1.2mg/ml相比較,結(jié)果基本一致，占實(shí)測值95.8％,在質(zhì)量控制90-110％的范圍內(nèi)，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)例2

1.材料

cpg-odn2006由上海生工合成(lot：9405454467)；30個(gè)氨基酸muc1多肽(純度95％)由上海紫域生物，bcg購自成都生物制品所，抗igg1-hrp、抗igg2c-hrp和抗igg-hrp購自southernbiotech。span85和tween80購自genview，角鯊烯購自tci。

6～8周齡，18～20gc57bl/690只小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司。

2.方法

2.1小鼠免疫

將小鼠稱重，隨機(jī)分為9組，每組10只鼠，雌雄各半，分別為生理鹽水組，cpg-odn2006(0.25mg/kg)，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+mf59組，muc1-mbp(0.25mg/kg)組，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+muc1-mbp(0.25mg/kg)組，cpg-odn2006(0.5mg/kg)+mf59+muc1-mbp(0.25mg/kg)組，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+al(oh)3+muc1-mbp(0.25mg/kg),cpg-odn2006(0.25mg/kg)+bcg(15mg/kg)+muc1-mbp(0.25mg/kg)組。皮下多點(diǎn)注射，每2周免疫一次，共免疫2次。

2.2elisa檢測muc1特異抗體及亞類

如上所述，小鼠第2次免疫后4-7天安樂死處死小鼠，眼球采血，常溫靜置4小時(shí)后，4℃離心，3000rpm，10min，分離小鼠血清，通過間接elisa分析抗muc1抗體的效價(jià)。簡而言之，采用0.5μg/wellmuc1多肽包被96孔板,4℃過夜，次日，通過3％bsa封閉液封閉1h，采用0.5‰tween-20的pbs(pbs-t)液洗滌后，加入小鼠不同稀釋度的血清，均設(shè)雙復(fù)孔，37℃孵育0.5-1.5h，棄去孔內(nèi)液體，pbs-t洗液5-7次后，加入hrp標(biāo)記山羊抗小鼠igg或igg2c或igg1(按說明書稀釋)，37℃孵育0.5-1.5h，棄去孔內(nèi)液體，pbs-t洗液5-7次后加入底物opd顯色5-10min，加2mol/l硫酸溶液終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀檢測a490吸光光度值。

3.結(jié)果

為研究muc1-mbp疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答情況，在小鼠末次免疫后眼球采血，分離血清，采用間接elisa檢測muc1特異性抗體及亞類。如表1結(jié)果所示，生理鹽水對(duì)照組、cpg-odn2006以及cpg-odn2006+mf59各組均未見muc1特異性抗體產(chǎn)生；muc1-mbp單獨(dú)免疫組小鼠產(chǎn)生較微量的抗muc1igg,igg2c以及igg1抗體；cpg-odn2006聯(lián)合muc1-mbp組，muc1特異性抗體igg,igg2c以及igg1均明顯較單獨(dú)muc1-mbp組增高；mf59聯(lián)合muc1-mbp組，muc1特異性抗體igg和igg1效價(jià)較muc1-mbp單獨(dú)用略有增加，但igg2c未見明顯增加。當(dāng)cpg-odn2006、mf59以及muc1-mbp聯(lián)合后，三者聯(lián)用比muc1-mbp與cpg-odn2006二者聯(lián)用更加顯著提高了muc1特異性抗體igg,igg2c以及igg1的效價(jià)，而且以igg2c增加的幅度最高；當(dāng)muc1-mbp聯(lián)合cpg-odn2006與al(oh)3或bcg三者聯(lián)用，與二者聯(lián)用比較均未見muc1特異性抗體igg,igg2c以及igg1有明顯提高。上述結(jié)果提示cpg-odn2006與muc1-mbp二者聯(lián)用能協(xié)同促進(jìn)muc1特異性抗體應(yīng)答的產(chǎn)生，cpg-odn2006和mf-59與muc1-mbp三者聯(lián)用更加顯著協(xié)同誘導(dǎo)muc1特異性體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的igg2c，間接提示cpg-odn2006或cpg-odn2006聯(lián)合mf59不僅促進(jìn)muc1-mbp疫苗產(chǎn)生th2應(yīng)答，同時(shí)也產(chǎn)生th1應(yīng)答。而muc1-mbp與mf-59二者聯(lián)用只能產(chǎn)生較低水平的抗體應(yīng)答；cpg-odn2006與muc1-mbp聯(lián)合后再加入al(oh)3或bcg，muc1特異性抗體應(yīng)答并未見明顯提升。

表1cpg-odn2006、mf59以及muc-mbp三者協(xié)同促進(jìn)產(chǎn)生muc1特異性抗體igg、igg2c和igg1

4.結(jié)論

cpg-odn2006、mf-59與muc1-mbp三者聯(lián)合比cpg-odn2006與muc1-mbp二者聯(lián)合更加顯著協(xié)同誘導(dǎo)muc1特異性體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的igg2c，可作為優(yōu)良的腫瘤疫苗開發(fā)利用。

實(shí)驗(yàn)例3

1.材料

小鼠淋巴細(xì)胞分層液購自索萊寶公司，il-2購自protech30個(gè)氨基酸muc1多肽(純度95％)由上海紫域生物，胎牛血清購自biobio、imdm購自gibco，wst試劑購自promega，il-4以及ifn-γelesa試劑盒均購自于ebioscience公司。

2.方法

2.1muc1特異性淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子分析

如上所述，在第4次免疫后4-7天殺鼠，無菌取脾、研磨、細(xì)胞記數(shù),制備脾細(xì)胞懸液，采用小鼠淋巴細(xì)胞分層液分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，用imdm調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10⁷/ml，以100μl/well加入96孔板中。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組，每組設(shè)3復(fù)孔，分別為陰性對(duì)照組、il-2單獨(dú)刺激組(終濃度100u/ml)、muc1多肽刺激組(muc1多肽10μg/ml+il-2100u/ml)。37℃的co2培養(yǎng)箱3天，半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)5天后，吸取每孔細(xì)胞培養(yǎng)上清100μl用于細(xì)胞因子的檢測。通過夾心elisa檢測ifn-γ和il-4的分泌水平。按照ebioscience公司的elisa檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。簡而言之，首先將包被抗體(抗ifn-γ和il-4的抗體)包被96孔酶標(biāo)板，每個(gè)樣本設(shè)雙復(fù)孔，4℃過夜。采用pbs-0.05％tween-20洗板5次，加入封閉液封閉1h后，洗滌2次，加入標(biāo)準(zhǔn)品(ifn-γ：2000、1000、500、250、125、62.5、32.5、15.625pg/ml；il-4標(biāo)準(zhǔn)品配制：500、250、125、62.5、32.5、15.6、7.8、3.9pg/ml)和樣品，100μl/孔，4℃過夜。洗滌5次后，加入檢測抗體室溫孵育1h，洗滌5次，加入酶標(biāo)抗體avindin-hrp,室溫孵育30min。洗7次，加tmb，室溫15min。加硫酸終止后，采用酶標(biāo)儀450nm波長測定吸光度值波長450nm。

3.結(jié)果

3.1cpg-odn與mf59以及muc1-mbp協(xié)同促進(jìn)muc1特異性淋巴細(xì)胞分泌ifn-γ水平

為研究muc1-mbp疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，在小鼠第4次免疫后取脾，分離淋巴細(xì)胞，采用il-2加muc1多肽特異性刺激淋巴細(xì)胞5天后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過雙抗體夾心elisa檢測ifn-γ和il-4分泌水平。將體外muc1多肽聯(lián)合il-2刺激所得的數(shù)值減去il-2單獨(dú)刺激的數(shù)值即得到muc1特異性th1釋放的細(xì)胞因子。如表2結(jié)果所示，cpg-odn2006組和cpg-2006+mf59組，均能產(chǎn)生較低水平的ifn-γ，cpg-odn2006聯(lián)合muc1-mbp組，muc1特異性t細(xì)胞釋放ifn-γ水平明顯增高，在muc1-mbp聯(lián)合cpg-odn2006聯(lián)合基礎(chǔ)上，加入mf59后，ifn-γ水平增高更加明顯；加入al(oh)3后，ifn-γ水平略有下調(diào)，加入bcg后，ifn-γ水平也明顯上升，但各鼠之間差異較大。同時(shí)，各組il-4的水平也不同程度增加。結(jié)果提示cpg-odn2006與muc1-mbp二者聯(lián)合協(xié)同促進(jìn)muc1特異性th1應(yīng)答和th2應(yīng)答，cpg-odn2006與mf59以及muc1-mbp三者聯(lián)合協(xié)同刺激產(chǎn)生更高水平的muc1特異性th1應(yīng)答。

表2各組小鼠免疫后muc1特異性淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(n＝10，)

其中，a，b：p<0.05，與對(duì)照組比較；c，p<0.01,與cpg-2006組比較；d：p<0.01,與muc1-mbp組比較；e，f：p<0.01,與muc1-mbp+cpg-2006

4.結(jié)論

cpg-odn2006與mf59以及muc1-mbp三者具有顯著的協(xié)同誘導(dǎo)產(chǎn)生產(chǎn)生muc1特異th1應(yīng)答的作用，提示三者可作為良好的癌癥疫苗開發(fā)利用。

實(shí)驗(yàn)例4

1.材料

g418，胎牛血清購自biobio、imdm購自gibco。

動(dòng)物c57bl/6小鼠,18-20克購自北京華阜康生物公司

細(xì)胞b16-muc1細(xì)胞系是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人全長muc1的小鼠b16黑色素瘤細(xì)胞。用含g418(終濃度為600μg/ml)，青、鏈霉素(100u/ml)及10％新生牛血清的imdm培養(yǎng)液培養(yǎng)b16-muc1細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀鑒定muc1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示b16-muc1細(xì)胞muc1的表達(dá)率在97.8％以上可用于腫瘤模型的構(gòu)建。

2.方法

2.1小鼠分組及免疫

c57bl/6小鼠,18-20克50只，隨機(jī)分5組，分別為生理鹽水組(ns)cpg-odn2006+mf59+muc1-mbp組，cpgodn2006+muc1-mbp組，mf59+muc1-mbp組，cpg-odn2006+mf59組。每組10只鼠，雌雄各半。首先，給小鼠背部右脅皮下接種b16-muc1細(xì)胞，1×10⁶個(gè)/只。然后，在腫瘤接種后的7天可觸及小米粒大小腫瘤后，頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫，每7天免疫一次，共免疫三次。觀察小鼠的一般狀態(tài)，小鼠成瘤情況，記錄小鼠的死亡時(shí)間，繪制生存曲線。

3.結(jié)果

3.1重組muc1-mbp融合蛋白的抗腫瘤作用

如圖2所示：不同佐劑聯(lián)合對(duì)muc1-mbp誘導(dǎo)的荷瘤小鼠生存期的影響曲線圖(m-m:muc1-mbp；2006:cpg-odn-2006；ns:生理鹽水)，小鼠注射腫瘤細(xì)胞后一周，可觸及小米粒大小的腫塊。此后，經(jīng)cpg-2006與mf59以及muc1-mbp三者聯(lián)合組免疫組小鼠腫瘤生長最慢，其次是cpg-2006與muc1-mbp二者聯(lián)合組，mf59與muc1-mbp二者聯(lián)合組.在腫瘤注射后60天，上述三組小鼠生存率分別為80％，60％和40％；而生理鹽水組與cpg-2006與mf59聯(lián)合組小鼠腫瘤生長迅速，在腫瘤注射后60天生存率分別為10％和20％。上述結(jié)果提示，cpg-2006與mf59以及muc1-mbp三者聯(lián)合組，cpg-odn2006與muc1-mbp二者聯(lián)合組，mf59與muc1-mbp二者聯(lián)合組均能延長荷瘤小鼠的生存期，尤其以muc1-mbp與cpg-2006以及mf59三者聯(lián)合效果最佳。

4.結(jié)論

muc1-mbp與cpg-2006二者聯(lián)合，muc1-mbp與cpg-2006和mf59三者聯(lián)合均明顯延長荷瘤小鼠生存期，尤其以三者聯(lián)合最為顯著。因此，muc1-mbp與cpg-2006和mf59三者聯(lián)合可作為良好的疫苗開發(fā)利用。