本發(fā)明涉及血漿等離子體制備，具體為一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法。
背景技術(shù)：
1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，具有較高的分化潛能，可向多個方向進行分化，在培養(yǎng)和移植后后可產(chǎn)生大量生物活性因子。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。人臍帶中分離出mscs，且細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓mscs，免疫原性比骨髓mscs低，并且具有取材方便，無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，因此越來越受到研究工作者們的關(guān)注。
2、血漿等離子體中有多種生長因子，各生長因子的比例與體內(nèi)正常比例相符，使生長因子之間有最佳的協(xié)同作用，在包括細(xì)胞移動、分化、分裂、基質(zhì)增生、血管新生、平衡分布等諸多方面作用病變位置，彌補了單一生長因子刺激創(chuàng)面修復(fù)不佳的缺點。同時也含有大量纖維蛋白，為修復(fù)細(xì)胞提供良好的支架，可以收縮創(chuàng)面，具有促凝血的作用，可刺激軟組織再生，促進傷口早期閉合和防止感染。自體血漿置換和使用是應(yīng)用非常廣泛的成熟技術(shù)。
3、現(xiàn)有治療膝關(guān)節(jié)病變技術(shù)之一是取新鮮健康臍帶，用pbs或0.9％鹽水沖洗干凈后，用剪刀鑷子剔去血管，剝出里面的華氏膠組織，將所得組織充分剪碎至1.5?mm大小，加入α-mem培養(yǎng)液置于37℃，5%的co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%helios?uitragro血清替代物。臍帶組織培養(yǎng)5-7天后，可見有部分細(xì)胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細(xì)小的梭形，一周后，細(xì)胞開始迅速增殖，形成大小不等的細(xì)胞集落，待細(xì)胞長滿后，消化傳代擴增，待細(xì)胞融合度達(dá)到要求后，收集一定數(shù)量的細(xì)胞注入病變的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，達(dá)到治療膝骨關(guān)節(jié)病變的目的。此種方法缺點在于干細(xì)胞修復(fù)周期較長，不能達(dá)到關(guān)節(jié)病變短期止痛、承重力改善等療效。在一定程度上并沒有緩解病人的即時病痛。
4、現(xiàn)有治療膝關(guān)節(jié)病變技術(shù)之二是取病人自體血液，經(jīng)離心處理后獲得血漿等離子體，血漿等離子體中有多種生長因子和纖維蛋白，生長因子之間協(xié)同作用，在包括細(xì)胞移動、分化、分裂、基質(zhì)增生、血管新生、平衡分布等諸多方面作用病變位置。大量纖維蛋白，可以收縮創(chuàng)面，減少磨損，起到快速止痛的作用，也可刺激軟組織再生，促進傷口早期閉合和防止感染。此種方法缺點在于血漿等離子體中的生物活性因子和纖維蛋白修復(fù)緩解快，但作用周期較短，長期軟骨修復(fù)和組織再生能力差，需要定期治療才能達(dá)到治療目的，一定程度上增加了病人的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，該制備方法的具體步驟如下：
3、s1：實驗準(zhǔn)備：
4、器械消毒：制備過程中使用的剪刀、鑷子器械應(yīng)事先清洗消毒，滅菌后放干燥箱烘干；
5、空間消毒：實驗室潔凈間和生物安全柜提前進行紫外或臭氧消毒；
6、物品準(zhǔn)備：制備物品事先查點，保證數(shù)量充足、質(zhì)量合格；
7、試劑配制：原代間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基：450mlα-mem無血清培養(yǎng)基+50mlultragro-advanced；
8、s2：原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)：
9、生物安全柜內(nèi)用眼科鑷將臍帶移到培養(yǎng)皿中，加生理鹽水清洗去除血漬，移入含75%醫(yī)用乙醇的培養(yǎng)皿中，浸泡8-12秒，再重復(fù)鹽水清洗2次；
10、移入加有生理鹽水的培養(yǎng)皿中去除血管，剝離膠體，用眼科鑷將撕好的華通氏膠擠干水分，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)；
11、將離心管底部的膠體用精細(xì)剪剪切成1-2mm3組織勻漿塊后平鋪于t75瓶，將t75瓶平放到37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
12、s3：原代臍帶間充質(zhì)細(xì)胞的收集：
13、組織勻漿塊周圍爬出細(xì)胞成大團時，收集細(xì)胞傳代，15個大細(xì)胞團接種1個t175瓶，即為p1代；
14、s4：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代：
15、細(xì)胞融合度的達(dá)到85%-90%左右時進行傳代操作，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，加入10ml生理鹽水洗去瓶中殘余培養(yǎng)基，棄去生理鹽水后，加入2-3mltryple-express，37℃靜置消化2min左右，直至倒置顯微鏡觀察細(xì)胞呈透亮圓形；
16、輕輕晃動飄起，消化好的細(xì)胞加入3倍體積的生理鹽水稀釋消化液，沖洗下瓶壁殘余細(xì)胞后將液體轉(zhuǎn)移至200ml離心管內(nèi)，400g離心6min，棄上清，收集細(xì)胞后按比例接種新的t175瓶；
17、s5：重復(fù)步驟4傳代操作，直至p5代，選取1*108個間充質(zhì)干細(xì)胞備用；
18、s6：等離子體血漿制備：
19、用采血袋取病人自體血60ml，經(jīng)200g，10min離心后，吸取上層血漿；
20、再次3000g，10min離心后，獲取沉淀，將沉淀用血漿定容至8ml備用；
21、s7：將步驟s5和步驟s6獲得產(chǎn)物混合，輕輕吹打至均勻狀態(tài)，終產(chǎn)物定容8-10ml獲得psf混合生物制劑。
22、優(yōu)選的，所述實驗室潔凈間和生物安全柜消毒時間不小于30min。
23、優(yōu)選的，所述步驟s1中還需要樣品接收與登記:核對并記錄樣品的相關(guān)信息、檢查知情同意書、相關(guān)病毒檢測報告、家族遺傳病史篩查信息。
24、優(yōu)選的，所述步驟s2中，醫(yī)用乙醇用量為50ml，且該醫(yī)用乙醇經(jīng)過過濾后使用。
25、優(yōu)選的，所述步驟s2中，t75瓶在培養(yǎng)過程中，6小時或過夜后，每瓶補加8ml完全培養(yǎng)基，每4-5天更換培養(yǎng)基，具體按爬出的細(xì)胞生長狀態(tài)調(diào)整補液間隔時間。
26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
27、將現(xiàn)有技術(shù)進行融合，形成生物制劑psf，psf是一種含有高濃度的間充質(zhì)干細(xì)胞、纖維蛋白、生物活性因子復(fù)合制劑，在治療骨關(guān)節(jié)病和軟組織損傷等病變時，高濃度的纖維蛋白和細(xì)胞因子可以快速修復(fù)創(chuàng)面、刺激軟組織再生，減少關(guān)節(jié)磨損，及時止痛。兩者還為間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)節(jié)、組織修復(fù)再生等長效作用的發(fā)揮提供良好的修復(fù)環(huán)境。三者相輔相成，共同奠定了psf技術(shù)在治療骨關(guān)節(jié)疾病時短期止痛及創(chuàng)面修復(fù)和長期的組織及軟骨再生的技術(shù)基礎(chǔ)。
1.一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，其特征在于，該制備方法的具體步驟如下：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，其特征在于：所述實驗室潔凈間和生物安全柜消毒時間不小于30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，其特征在于：所述步驟s1中還需要樣品接收與登記:核對并記錄樣品的相關(guān)信息、檢查知情同意書、相關(guān)病毒檢測報告、家族遺傳病史篩查信息。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，其特征在于：所述步驟s2中，醫(yī)用乙醇用量為50ml，且該醫(yī)用乙醇經(jīng)過過濾后使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性因子血漿等離子體的制備方法，其特征在于：所述步驟s2中，t75瓶在培養(yǎng)過程中，6小時或過夜后，每瓶補加8ml完全培養(yǎng)基，每4-5天更換培養(yǎng)基，具體按爬出的細(xì)胞生長狀態(tài)調(diào)整補液間隔時間。