本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及二氫辣椒素在預(yù)防和治療過(guò)敏性鼻炎的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、過(guò)敏性鼻炎(allergic?rhinitis，ar)是一種由免疫球蛋白ige介導(dǎo)的慢性、非感染性鼻黏膜炎癥性疾病，常因塵螨、花粉、霉菌和動(dòng)物皮屑等環(huán)境過(guò)敏原的刺激而發(fā)作。其主要癥狀包括陣發(fā)性打噴嚏、鼻癢、鼻塞和流涕，同時(shí)約60％-70％的患者還會(huì)伴有眼癢、流淚等眼部炎性反應(yīng)，且容易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前臨床治療主要集中在避免接觸過(guò)敏原和使用藥物控制癥狀。常用藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑和減充血?jiǎng)┑龋@些藥物只能暫時(shí)緩解癥狀，無(wú)法根治疾病，且長(zhǎng)期使用可能引發(fā)副作用和耐藥性問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)出副作用更小且能夠長(zhǎng)期控制癥狀的新型治療手段，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要方向。

2、許多中藥復(fù)方也應(yīng)用于過(guò)敏性鼻炎的治療。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的治療體系中，中藥復(fù)方因其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，通過(guò)多層次、多途徑的作用機(jī)制，往往能夠達(dá)到整體調(diào)理和標(biāo)本兼治的效果。這種復(fù)雜的作用模式不僅是中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)所在，也為它在疾病治療中的獨(dú)特療效提供了基礎(chǔ)。然而，這種多成分的復(fù)雜性也帶來(lái)了挑戰(zhàn)。方劑中的成分關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，成分之間可能存在協(xié)同或拮抗作用，使得藥效機(jī)制難以精準(zhǔn)解析，尤其是在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求明確成分和作用機(jī)制的背景下，這成為中醫(yī)藥走向標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化的障礙。

3、為了解決這一問(wèn)題，本發(fā)明將現(xiàn)代藥理學(xué)的篩選技術(shù)應(yīng)用于經(jīng)典方劑，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方劑中的關(guān)鍵有效成分，解析其獨(dú)立的作用機(jī)制。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典名方小柴胡湯對(duì)過(guò)敏性鼻炎具有顯著的抑制作用。然而，小柴胡湯中包括柴胡、黃芩、半夏、炙甘草、人參、生姜、大棗多種中藥材，成分多且相互作用復(fù)雜。為了更明確其藥效機(jī)制并推動(dòng)其應(yīng)用，我們進(jìn)一步篩選出小柴胡湯中的關(guān)鍵化合物二氫辣椒素。從方劑到單一化合物逐步解析其藥理機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探索創(chuàng)新藥物的開(kāi)發(fā)途徑。

4、二氫辣椒素(dihydrocapsaicin)作為生姜的活性成分之一，在多種炎癥性疾病和神經(jīng)性疾病的研究中展現(xiàn)出顯著的潛力。由于過(guò)敏性鼻炎是一種由免疫球蛋白ige介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，其病理過(guò)程涉及炎性介質(zhì)的釋放和神經(jīng)系統(tǒng)的參與，二氫辣椒素憑借其抗炎特性，有望在ar治療中發(fā)揮積極作用。本項(xiàng)目以二氫辣椒素為切入點(diǎn)，驗(yàn)證其在ar治療中的潛在價(jià)值，為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化提供新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供二氫辣椒素在制備治療和或預(yù)防過(guò)敏性鼻炎的藥物中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過(guò)藥理學(xué)篩選出經(jīng)典名方小柴胡湯治療過(guò)敏性鼻炎的有效成分二氫辣椒素，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二氫辣椒素在預(yù)防和治療過(guò)敏性鼻炎的應(yīng)用。

3、本發(fā)明所述的藥物應(yīng)用，是指：

4、二氫辣椒素在制備顯著抑制過(guò)敏性鼻炎小鼠打噴嚏和撓鼻的次數(shù)，顯著抑制過(guò)敏性鼻炎小鼠血清中ige和組胺水平的藥物中的應(yīng)用。

5、二氫辣椒素在制備顯著減輕過(guò)敏性鼻炎引起的鼻粘膜增厚，增加鼻粘膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin和胞質(zhì)緊密粘連蛋白zo-1的表達(dá)，occludin和zo-1在維持鼻上皮細(xì)胞的完整性、調(diào)節(jié)通透性以及參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的藥物中的應(yīng)用?；謴?fù)這兩個(gè)蛋白的正常水平對(duì)于保護(hù)鼻粘膜免受過(guò)敏原和病原體的侵襲至關(guān)重要，有助于修復(fù)上皮屏障，減輕癥狀。

6、二氫辣椒素在制備明顯減少鼻粘膜上杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量，抑制血清中炎癥因子il-4、il-5和il-13的水平的藥物中的應(yīng)用。

7、二氫辣椒素對(duì)肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶alt和尿素氮bun的表達(dá)水平也證實(shí)二氫辣椒素對(duì)肝功和腎功無(wú)明顯影響。

8、本發(fā)明所述組合物為藥物制劑型式，所述藥物制劑中，根據(jù)需要還可包括藥用輔料。

9、本發(fā)明所述藥物制劑，可以制備成任何可藥用的劑型，包括口服和外用劑型。選自：片劑、膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、膏劑、噴霧劑、滴劑(滴鼻劑)、滴丸劑或貼劑。

10、本發(fā)明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤(rùn)劑，必要時(shí)可對(duì)片劑進(jìn)行包衣。

11、適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤(rùn)滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤(rùn)劑包括十二烷基硫酸鈉。

12、本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中。

13、口服液體制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。

14、對(duì)于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無(wú)菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過(guò)將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過(guò)濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。

15、本發(fā)明的藥物組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自：甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素c、edta二鈉、edta鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。

16、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

17、本發(fā)明的有效分成及藥物療效是經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選得到的：

18、1、采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選小柴胡湯治療過(guò)敏性鼻炎的有效成分

19、利用tcmsp數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old.tcmsp-e.com)檢索小柴胡湯中所有藥物的主要成分，根據(jù)生物利用度≥30％和類藥性≥0.18進(jìn)行過(guò)濾篩選，得到小柴胡湯活性成分。應(yīng)用swiss?target?prediction(http://swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)一步根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)(gi?absorption：high)和類藥性(lipinski五規(guī)則和ghose法則)評(píng)估活性成分潛在的治療靶點(diǎn)。

20、在genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.genecards.org)、omim數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//omim.org/)、disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.disgenet.org/web/disgenet/)中以關(guān)鍵詞“allergic?rhinitis”篩選過(guò)敏性鼻炎的相關(guān)基因。

21、采用作圖工具venny?2.1構(gòu)建小柴胡湯的潛在治療靶點(diǎn)和過(guò)敏性鼻炎的相關(guān)基因的交集，即為小柴胡湯治療過(guò)敏性鼻炎的關(guān)鍵基因。使用string數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集中靶點(diǎn)的信息互作網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用cytoscape?3.9.1軟件分析該網(wǎng)絡(luò)的屬性，并進(jìn)行聚類、度值等分析，根據(jù)degree、betweenness和closeness篩選出前十個(gè)核心靶點(diǎn)。繼續(xù)應(yīng)用cytoscape根據(jù)核心靶點(diǎn)搜索對(duì)應(yīng)的小柴胡湯中的有效成分，構(gòu)建靶點(diǎn)-藥物成分網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值篩選出二氫辣椒素可能對(duì)過(guò)敏性鼻炎的治療具有較大的潛力。從化合物信息數(shù)據(jù)庫(kù)pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得二氫辣椒素的三維結(jié)構(gòu)，采用autodockvina和pymol軟件通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證二氫辣椒素與核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

22、2、構(gòu)建過(guò)敏性鼻炎小鼠模型及給藥

23、采用致敏劑雞卵白蛋白o(hù)va和佐劑氫氧化鋁建立過(guò)敏性鼻炎小鼠模型，并應(yīng)用elisa試劑盒檢測(cè)血清中ige水平以及行為學(xué)的變化驗(yàn)證過(guò)敏性鼻炎小鼠模型的建立是否成功。

24、過(guò)敏性鼻炎小鼠模型的建立

25、于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)8周齡雄性balb/c小鼠，第1、8、15天腹腔注射含25μg致敏劑雞卵白蛋白o(hù)va和2mg佐劑氫氧化鋁的pbs200μl，第22-35天改為鼻內(nèi)輸注20μl含有25mg/ml?ova的pbs。在第35天最后一次鼻腔激發(fā)后，立即觀察并計(jì)算小鼠30分鐘內(nèi)撓鼻、打噴嚏次數(shù)和流涕程度進(jìn)行評(píng)分。噴嚏：1-3個(gè)，1分；4-10個(gè)，2分；11個(gè)以上，3分。撓鼻：輕擦鼻幾次，1分；撓鼻頻繁，2分；雙前肢撓鼻不停，3分。流涕：流至前鼻孔、超過(guò)前鼻孔及流涕滿面分別評(píng)為1分、2分、3分。以上3個(gè)癥狀記分疊加計(jì)算，總分大于5分即提示造模成功。模型建立流程如圖2所示。

26、分組和給藥

27、實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組，過(guò)敏性鼻炎小鼠組，小柴胡湯治療組，二氫辣椒素治療組以及氯雷他定陽(yáng)性對(duì)照組。每組20只小鼠，分裝于2個(gè)鼠籠中，每籠10只。小柴胡湯的用量為：柴胡15g，黃芩9g，姜半夏9g，炙甘草9g，人參片9g，生姜9g，大棗6g。配置方法為：(1)冷水浸泡：將藥材放入適量的冷水中，確保水量足以沒(méi)過(guò)藥材2-5cm，以防止藥材煎干或煮焦。浸泡時(shí)間為40min。(2)大火熬開(kāi)：將浸泡好的藥材放入砂鍋中，加入300ml水，用大火煮沸。(3)小火熬煮：待藥液沸騰后，轉(zhuǎn)小火繼續(xù)熬煮。此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，熬煮30min。在煎煮過(guò)程中，需要不斷地用玻璃棒攪拌，以保證藥材充分煮透。(4)過(guò)濾藥液：熬煮30min后，使用篩子將藥液過(guò)濾出來(lái)，將其倒入燒杯中。將濾渣重新放入砂鍋中，加入300ml水，再次煮沸后轉(zhuǎn)小火熬煮30min。在此過(guò)程中，也需要不斷攪拌。(5)混合藥液：將第二次熬煮的藥液過(guò)濾出來(lái)，與第一次的藥液合并，倒入砂鍋中。(6)蒸發(fā)濃縮：將合并后的藥液在砂鍋中進(jìn)行蒸發(fā)濃縮。將藥液晾涼，并分裝到15ml的離心管中，放入-20℃冰箱保存。按人與小鼠體表面積比換算給藥劑量，成人與小鼠的折算系數(shù)為9.1，按70kg成人每日一付藥，小鼠單次給藥量為8.58g/kg，合水煎劑的體積為0.2ml。二氫辣椒素設(shè)置高、中(根據(jù)9g生姜中所含二氫辣椒素的量計(jì)算而得)、低劑量組，給藥劑量分別為6mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照組氯雷他定用量為1.5mg/kg。于第1-3天，第8-10天，第15-17天，第22-35天通過(guò)灌胃分別給予小鼠藥物。

28、elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清ige和組胺水平：

29、采用elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清ige和組胺的水平，評(píng)估過(guò)敏性鼻炎小鼠模型的建立是否成功，以及過(guò)敏反應(yīng)的嚴(yán)重程度。小鼠麻醉后，采用眼球取血，將血液收集至1.5mlep管中。血液室溫靜置1h至其自然凝固，4000rpm離心10min，收集血清至新的ep管中。從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl。樣本孔先加待測(cè)樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到曲線方程。將各樣品的od值代入到方程得到相應(yīng)數(shù)值再乘以5即為ige和組胺實(shí)際濃度。

30、3、he染色評(píng)估小鼠鼻組織病理學(xué)變化

31、采用he染色觀察小鼠鼻組織形態(tài)和鼻粘膜厚度變化，評(píng)估二氫辣椒素對(duì)過(guò)敏性鼻炎小鼠鼻粘膜的影響。組織切片首先進(jìn)行脫蠟處理，將切片依次浸泡于二甲苯i和ⅱ中各10min；接著進(jìn)行水化處理，將切片分別浸泡于無(wú)水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇中各1min，然后用雙蒸水沖洗2min；接下來(lái)進(jìn)行染色處理，將切片浸泡于蘇木素染液中浸染1min，自來(lái)水輕輕沖洗2min，流水沖洗1min，然后用1％鹽酸酒精分色2s，流水沖洗5min，最后進(jìn)行伊紅染色10s，流水沖洗1min；再進(jìn)行脫水和透明處理，將切片依次浸泡于75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇和無(wú)水乙醇中各1min，然后依次浸泡于二甲苯i和ⅱ中各2min；最后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察并采集圖像。

32、4、免疫熒光染色評(píng)估小鼠鼻上皮完整性

33、采用免疫熒光染色檢測(cè)小鼠鼻粘膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin和胞質(zhì)緊密粘連蛋白zo-1的表達(dá)水平，評(píng)估小鼠鼻上皮完整性。首先，將石蠟切片置于60℃下烤片1.5h以促使組織粘附；依次使用二甲苯和梯度乙醇(100％、95％、85％)進(jìn)行脫蠟和水化，每步處理5min，并以蒸餾水洗滌；使用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，在高溫微波爐加熱后自然冷卻，將切片置于pbs中洗滌3次，每次5min；用3％bsa封閉30min，以防非特異性結(jié)合；滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜；pbs洗滌3次，每次5min；滴加二抗，并在室溫避光條件下孵育1h；pbs洗滌3次，每次5min；滴加染核試劑dapi，避光孵育10min；pbs洗滌3次，每次5min；抗熒光淬滅封片劑封片，使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

34、5、pas染色評(píng)估小鼠鼻粘膜杯狀細(xì)胞的水平

35、采用pas染色檢測(cè)小鼠鼻粘膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估小鼠異常的粘液分泌功能。切片經(jīng)過(guò)脫蠟和水化處理后，將過(guò)碘酸溶液取出并平衡至室溫，向每個(gè)樣品中滴加100μl的過(guò)碘酸溶液，避光反應(yīng)5min；去除過(guò)碘酸溶液，浸泡于蒸餾水中，置于搖床洗滌5min；滴加100μl的schiff試劑，放入濕盒中，在37℃恒溫箱中避光染色5min；去除染色液后浸泡于蒸餾水中，置于搖床洗滌5min；經(jīng)梯度乙醇和二甲苯處理，待適當(dāng)干燥后，使用中性樹(shù)膠封片；在顯微鏡下觀察并采集圖像。

36、6、giemsa染色評(píng)估小鼠鼻粘膜肥大細(xì)胞的水平

37、采用giemsa染色檢測(cè)小鼠鼻粘膜肥大細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估小鼠鼻粘膜炎癥水平。切片經(jīng)過(guò)脫蠟和水化處理后，加入吉姆薩工作液200μl，染色1min；用蒸餾水從一側(cè)充分充水洗滌；經(jīng)梯度乙醇和二甲苯處理，干燥后用中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察和采集圖像。

38、7、計(jì)算過(guò)敏性鼻炎小鼠脾指數(shù)

39、在建立過(guò)敏性鼻炎小鼠模型的培養(yǎng)周期內(nèi)，每7天記錄一次小鼠體重。待模型建立和給藥結(jié)束后，處死小鼠并取出脾臟，用濾紙吸干脾臟表面水分后稱重。利用最終體重和脾臟重量計(jì)算脾指數(shù)：脾指數(shù)＝脾臟重量(g)/體重(g)，評(píng)估小鼠免疫反應(yīng)水平。

40、8、elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清il-4、il-5和il-13的水平

41、采用elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清il-4、il-5和il-13的水平，評(píng)估小鼠鼻粘膜炎癥水平。從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl。樣本孔先加待測(cè)樣10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到曲線方程。將各樣品的od值代入到方程得到相應(yīng)數(shù)值再乘以5即為il-4、il-5和il-13實(shí)際濃度。

42、9、he染色評(píng)估二氫辣椒素對(duì)小鼠肝組織和腎組織的影響

43、采用he染色小鼠肝組織和腎組織的病理結(jié)構(gòu)，評(píng)估二氫辣椒素對(duì)小鼠腎臟和肝臟的毒性。組織切片首先進(jìn)行脫蠟處理，將切片依次浸泡于二甲苯i和ⅱ中各10min；接著進(jìn)行水化處理，將切片分別浸泡于無(wú)水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、75％乙醇中各1min，然后用雙蒸水沖洗2min；接下來(lái)進(jìn)行染色處理，將切片浸泡于蘇木素染液中浸染1min，自來(lái)水輕輕沖洗2min，流水沖洗1min，然后用1％鹽酸酒精分色2s，流水沖洗5min，最后進(jìn)行伊紅染色10s，流水沖洗1min；再進(jìn)行脫水和透明處理，將切片依次浸泡于75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇和無(wú)水乙醇中各1min，然后依次浸泡于二甲苯i和ⅱ中各2min；最后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，在顯微鏡下觀察并采集圖像。

44、10、試劑盒檢測(cè)小鼠肝功和腎功的水平

45、采用elisa試劑盒檢測(cè)小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶alt和尿素氮bun的水平，評(píng)估二氫辣椒素對(duì)小鼠肝臟和腎臟的毒性。alt：將20μl基質(zhì)液預(yù)溫至37℃；在測(cè)定孔中加入20μl基質(zhì)液和5μl待測(cè)樣本，在對(duì)照孔中加入20μl基質(zhì)液；輕輕震蕩微孔板混勻，37℃反應(yīng)30min；在測(cè)定孔中加入20μl2,4-二硝基苯肼溶液，在對(duì)照孔中加入5μl的2,4-二硝基苯肼溶液；輕輕震蕩微孔板混勻，37℃反應(yīng)20min；在測(cè)定孔和對(duì)照孔中各加入200μl0.4?mol/l氫氧化鈉溶液；輕輕震蕩微孔板混勻，室溫放置15min；波長(zhǎng)設(shè)定為505nm，測(cè)定各孔o(hù)d值，用測(cè)定孔o(hù)d值減去對(duì)照孔o(hù)d值得到凈od值；代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算alt活力值。bun：在空白管中加入0.02ml蒸餾水，在標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.02ml?10mmol/l?bun標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，在測(cè)定管中加入0.02ml待測(cè)樣本；每個(gè)管中加入0.25ml緩沖酶液；混勻后置于37℃恒溫箱中孵育10min；每個(gè)管中分別加入1ml顯色劑和1ml堿性次氯酸鈉；充分混勻后，再次置于37℃恒溫箱中孵育10min；波長(zhǎng)設(shè)為640nm，光徑為1cm，以蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度od值，帶入公式得到尿素氮濃度：尿素氮濃度(mmol/l)＝(a測(cè)定-a空白)/(a標(biāo)準(zhǔn)-a空白)×c標(biāo)準(zhǔn)。

46、11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

47、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用spss17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，單因素方差分析(anova)進(jìn)行多組間比較，anova分析有差異時(shí)通過(guò)bonferroni修正的t-檢驗(yàn)或dunnett?t-檢驗(yàn)評(píng)估各組是否有差異，p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

48、對(duì)于說(shuō)明書(shū)中一些英文縮寫(xiě)或術(shù)語(yǔ)的解釋：

49、ige：免疫球蛋白e

50、occludin：緊密連接蛋白

51、zo-1：胞質(zhì)緊密粘連蛋白

52、degree：度數(shù)

53、betweenness：介數(shù)

54、closeness：接近中心性

55、ova：卵清蛋白

56、alt：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶

57、bun：尿素氮

58、il-4：白介素4

59、il-5：白介素5

60、il-13：白介素13。