本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)的制備領域，具體涉及一種裝載喜樹堿的殼聚糖納米維素γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球的制備方法。

背景技術：

1、癌癥是威脅人類健康的主要疾病，世界衛(wèi)生組織相關癌癥研究部門2020年發(fā)布的《全球癌癥研究一般報告》顯示，全世界每年新增各類癌癥約1930萬例，死亡約996萬例，癌癥與心血管疾病、意外事故共同構成人類死亡的主要原因。癌癥與急性傳染病、常規(guī)性營養(yǎng)不良不同，并不會因人類科技進步、經(jīng)濟快速發(fā)展而減少，所以對癌癥的治療必須引起足夠的重視。

2、喜樹堿(cpt)被認為是21世紀主要有效的抗癌前體藥之一，在腫瘤細胞體外活性實驗中顯示出良好的抗腫瘤活性。遺憾的是，喜樹堿(cpt)在治療應用方面存在一些主要缺點，如水溶性差和生物利用度低等。此外，在生理ph值下，cpt的內(nèi)酯環(huán)容易被水解導致無活性羧酸酯形式產(chǎn)生。因此，設計用于遞送cpt的新載體是非常需要的。近年來納米技術的發(fā)展為藥物配制和給藥過程提供了新的可能方案，各種納米遞送系統(tǒng)可通過表面修飾及配體偶聯(lián)靶向傳遞,實現(xiàn)藥物高包封率和高細胞攝取效率。因此,基于藥物納米遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)為提高cpt制劑的溶解性、滲透性和穩(wěn)定性，提高藥物療效、降低不良反應發(fā)生率、逆轉耐藥性提供了新思路、新方法。

3、環(huán)糊精金屬有機骨架(cd-mofs)是以生物質材料環(huán)糊精為有機配體合成的一種新型金屬有機骨架材料，其具有外部親水而內(nèi)腔疏水的特性，而這種特性又使其具有承載其它客體分子的能力，與客體分子形成穩(wěn)定的包合物后，可以改變客體分子的理化性質，使其具有控制釋放、改善穩(wěn)定性、抗氧化性和水溶性等性質。因此，環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等領域應用十分廣泛。其中，α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精是三種最常見的環(huán)糊精，分別由6，7，8個葡萄糖單元構成，α-環(huán)糊精空腔尺寸最小，容易與單環(huán)芳烴形成穩(wěn)定的超分子，如偶氮苯及其衍生物；β-環(huán)糊精空腔尺寸適中，容易與蒽醌、膽固醇、二茂鐵、金剛烷、環(huán)二烯、偶氮化合物及其衍生物等形成包合物；γ-環(huán)糊精空腔尺寸最大，通常與尺寸較大的客體分子，如芘、蒽、菲、甾體等形成包合物。由于γ-環(huán)糊精的對稱性更好，以γ環(huán)糊精為原料制備得到的環(huán)糊精金屬有機框架具有較高的結構穩(wěn)定性；另一方面，γ-環(huán)糊精金屬有機框架相比α-環(huán)糊精金屬有機框架和β-環(huán)糊精金屬有機框架具有更高的比表面積和更豐富的孔道，更適合應用于藥物遞送領域。

4、由于γ-環(huán)糊精金屬有機框架的粉末晶體結構、高脆性和在水中的不穩(wěn)定性使其在加工成型方面面臨巨大的挑戰(zhàn)，限制了其應用范圍。天然高分子聚合物如纖維素和殼聚糖等具有可降解、可再生、柔韌性好、易加工成型等優(yōu)勢，可作為mofs的復合基底材料，提高其加工成型性，拓寬其應用范圍。作為甲殼素的衍生物，殼聚糖由于自身的特殊性質引起人們廣泛關注：(1)殼聚糖的生物相容性好，且能被生物降解，降解產(chǎn)物無毒性；(2)殼聚糖及其衍生物具有許多獨特性質，如抗菌性、抗微生物性、對重金屬離子的螯合性、抗病毒性、抗癌性、促進傷口的愈合等。因此它們有望在藥物釋放體系、傷口愈合材料、污水處理、重金屬回收、膜分離、化妝品、抗凝血藥物、日用化工等方面獲得應用。

5、纖維素是世界上蘊藏量最豐富的天然高分子化合物，是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖。納米纖維素是一種從天然纖維素中提取的納米級的纖維或晶體，具有可降解、可再生、無毒性和高強度等優(yōu)點，可以用于制備各種高附加值的先進功能材料。根據(jù)制備方法和來源的不同，納米纖維素可以分為三類：纖維素納米晶(cnc)、纖維素納米纖維(cnf)和細菌纖維素(bc)。纖維素納米纖維(cnf)直徑小，具有活性高、比表面積大、透明度高、可再生、可降解等多重優(yōu)勢，納米纖維素可制備納米復合材料、氣凝膠、水凝膠、生物醫(yī)藥等領域中的應用前景廣闊。

6、然而天然高分子聚合物的加工成型大多以水溶液為介質，而環(huán)糊精金屬有機框架在水溶液中的不穩(wěn)定性使其難以以完整的框架結構復合到天然高分子聚合物中。失水山梨醇三油酸(司盤85)是一種非離子表面活性劑，由親水的羥基段和疏水的長烷基鏈構成.司盤85能夠通過其極性羥基端與γ-環(huán)糊精金屬有機框架金屬中心的物理吸附作用結合到γ-環(huán)糊精金屬有機框架的外表面，而γ-環(huán)糊精金屬有機框架外表面的司盤85的疏水長烷基鏈能夠有效防止水分子與mof接觸從而增強其耐濕性.由于司盤85具有長鏈結構，可以避免其進入到γ-環(huán)糊精金屬有機框架的內(nèi)部孔隙中導致材料的孔隙率降低.通過簡單的溶液浸泡工藝在mof的外表面沉積一層司盤85得到水穩(wěn)定的γ-環(huán)糊精金屬有機框架。這種方法簡便，無需繁雜的化學合成.此外，司盤85無化學毒性、價格低廉，能夠實現(xiàn)耐濕性的γ-環(huán)糊精金屬有機框架的規(guī)模化生產(chǎn)。

7、綜上所述，我們成功制備了一種裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球。其粒徑均一，具有豐富的比表面積和孔道，制備方法安全便捷，制備過程綠色環(huán)保，具有優(yōu)異的物化性質和顯著的酸誘導溶脹能力，可作為喜樹堿的一種優(yōu)良的藥物遞送系統(tǒng)。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術的問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種裝載喜樹堿的殼聚糖/納米維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球的制備方法，本發(fā)明制備得到的喜樹堿藥物遞送系統(tǒng)生物相容性高、藥物負載率良好、具有優(yōu)良的物化性質，在腫瘤微環(huán)境中能夠實現(xiàn)喜樹堿的緩慢釋放，并一定程度上減緩了喜樹堿本身的毒性。

2、為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了以下技術方案：

3、本發(fā)明提供了一種裝載喜樹堿的殼聚糖/納米維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球的制備方法，包括以下步驟：

4、(1)將γ-環(huán)糊精和氫氧化鉀溶解于50ml的去離子水中，超聲混合均勻，將溶液通過水性一次性混合纖維素酯濾膜過濾至燒杯中，迅速倒入5ml乙醇，將燒杯放入底部裝有乙醇溶液的大燒杯中，封口膜封住大燒杯頂部，水浴加熱6h，離心去除微米尺寸晶體，在離心液中迅速加入聚乙二醇20000和乙醇，室溫結晶過夜，離心收集晶體；用異丙醇、乙醇分別洗滌三次，真空干燥24h后用二氯甲烷活化三天，得到活化后的堿性γ-環(huán)糊精金屬有機框架。

5、(2)將制備的堿性γ-環(huán)糊精金屬有機框架，加入至乙酸和乙醇的混合溶液(冰乙酸:無水乙醇＝1:9，v/v)，室溫下振蕩30min。離心收集沉淀，并用無水乙醇洗滌5次，最后在60°c下真空干燥24h，得到中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架。

6、(3)將制備的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架與喜樹堿溶解在甲醇溶液中，采用簡單的浸泡工藝將藥物負載在中空的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架中，離心獲取沉淀后真空干燥12h，將10ml司班85溶于20ml二氯甲烷中，然后向此溶液中加入1g負載喜樹堿的γ-環(huán)糊精金屬有機框架并靜置48h，反應完成后通過過濾得到沉淀物并用二氯甲烷多次洗滌，最后在在40℃的真空下干燥12h。

7、(4)采用堿尿體系經(jīng)過冷凍解凍步驟溶解殼聚糖，向其中加入5％wt羧基化纖維素納米纖維和環(huán)氧氯丙烷，得到殼聚糖/納米纖維素預凝膠溶液，將一定量殼聚糖預凝膠溶液緩慢加入到含有200ml異辛烷和2ml司班85的油相中，并在1500rpm條件下室溫乳化，使殼聚糖/納米纖維素預凝膠微液滴完全凝膠化。隨后，將乳液轉移至2l乙醇/水(7:3,v/v)混合溶劑中破乳，并通過離心收集微球。將得到的凝膠微球在無水乙醇和去離子水中反復洗涂，去除殘留乳化劑和堿溶劑。最后，將純化后的微球冷藏(4℃)。

8、(5)將上述步驟(3)的司班85修飾的負載喜樹堿的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架與上述步驟(4)中的殼聚糖/納米纖維素混合溶液混合，通過乳化法制備得到裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架復合微球。

9、上述技術方案中，步驟(1)中所用的反溶劑與表面活性劑的搭配為乙醇和聚乙二醇20000。

10、上述技術方案中，步驟(1)中所制備的γ-環(huán)糊精金屬有機框架的尺寸為200-350nm。

11、上述技術方案中，步驟步驟(1)中清除過量聚乙二醇20000的溶劑為異丙醇和乙醇(各自3次，每次100ml)。

12、上述技術方案中，步驟步驟(2)中冰乙酸和無水乙醇的比例為1:9。

13、上述技術方案中，步驟(3)中司班85修飾的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架中所載藥物為喜樹堿。

14、上述技術方案中，步驟(4)中加入羧基化纖維素納米纖維。

15、上述技術方案中，步驟(4)中采用堿尿體系作溶劑、羧基化纖維素納米纖維素作增強劑制備殼聚糖/納米纖維素多孔微球。

16、上述技術方案中，步驟(5)將裝載喜樹堿的經(jīng)過司班85修飾的γ-環(huán)糊精金屬有機框架以完整的框架復合到殼聚糖/納米纖維素多孔微球中。

17、一種采用上述制備方法制備的裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球，載藥前的γ-環(huán)糊精金屬有機框架粒徑為200-350nm，而載喜樹堿后的γ-環(huán)糊精金屬有機框架的粒徑為300-400nm，制備得到的活化后的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架的比表面積在900-1050m2/g。

18、一種采用上述制備方法制備的裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球，載藥率為22％-30％。

19、一種采用上述制備方法制備的裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球，經(jīng)過司班85修飾后的γ-環(huán)糊精金屬有機框架的晶體結構、物化性質并未改變，而司班85能夠一定程度上協(xié)同γ-環(huán)糊精金屬有機框架改善喜樹堿的溶解度。

20、一種采用上述制備方法制備的裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球，具有優(yōu)異的力學性能和顯著的酸誘導溶脹行為。

21、本發(fā)明提供了一種裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球的制備方法。通過改進的蒸汽擴散法，以乙醇為反溶劑，聚乙二醇20000為表面活性劑制備出粒徑均一、形貌優(yōu)良的堿性γ-環(huán)糊精金屬有機框架，由于喜樹堿在堿性條件下不穩(wěn)定，采用乙酸中和上述制備的堿性γ-環(huán)糊精金屬有機框架，并通過浸漬法將喜樹堿裝載在中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架的疏水空腔中，有效提高了喜樹堿藥物的溶解度、穩(wěn)定性及生物利用度。為了解決γ-環(huán)糊精金屬有機框架在水中的高溶解性使其無法實現(xiàn)喜樹堿的緩慢釋放問題，采用司班85對γ-環(huán)糊精金屬有機框架進行表面疏水涂層，以堿尿體系做溶劑制備殼聚糖/納米纖維素多孔微球并以此為基質裝載負載喜樹堿的司班85修飾的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架，該復合材料具有良好的生物相容性、生物降解性以及可實現(xiàn)藥物緩釋等優(yōu)點，制備方法簡單，制備過程綠色環(huán)保，具有良好的應用前景。

22、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：引入綠色安全的具有內(nèi)部疏水空腔的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架，增強了喜樹堿的溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度；司班85的修飾提高了制備的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架在水溶液中的穩(wěn)定性，保證了在后續(xù)水環(huán)境中負載喜樹堿的中性γ-環(huán)糊精金屬有機框架能以一個完整的框架復合進殼聚糖/納米纖維素多孔微球。制備的裝載喜樹堿的殼聚糖/納米纖維素/γ-環(huán)糊精金屬有機框架多孔復合微球生物相容性好、制備過程安全環(huán)保，能實現(xiàn)腫瘤環(huán)境下實現(xiàn)喜樹堿的緩慢釋放。