本發(fā)明屬于桑脈帶病毒檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在國家實(shí)施“東桑西移”產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整戰(zhàn)略和東部地區(qū)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移等因素推動下，廣西桑蠶產(chǎn)業(yè)自“十五”以來迅猛發(fā)展，從2005年以來，廣西蠶繭產(chǎn)量已連續(xù)12年居全國第一。桑蠶業(yè)的迅猛發(fā)展為廣西農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效、縣域經(jīng)濟(jì)大發(fā)展和新農(nóng)村建設(shè)作出了重要貢獻(xiàn)，也已成為廣西的新興優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，更是部分地區(qū)的主要支柱產(chǎn)業(yè)。然而，桑樹病毒病在廣西桑蠶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)生率為40％左右，個別桑園發(fā)病率甚至達(dá)到80％，已成為廣西桑樹的主要病害之一，嚴(yán)重影響了廣西桑蠶業(yè)的發(fā)展。

桑脈帶病毒(mulberryveinbandingvirus,mvbv)是廣西桑樹病毒病主要病原，該病毒是番茄斑萎病毒屬(tospovirus)新成員，與西瓜銀色斑駁病毒血清型病毒具有較近的親緣關(guān)系。然而，由于桑脈帶病毒是近年新發(fā)現(xiàn)的侵染桑樹的病毒，尚未建立系統(tǒng)的檢測方法，有必要開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的mvbv檢測方法，以滿足桑蠶產(chǎn)業(yè)需求。

目前檢測植物病毒的方法主要是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)和酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)，這兩種方法均存在不足：rt-pcr需要購買專業(yè)的pcr儀，且反應(yīng)時間較長；elisa需要制備高質(zhì)量的病毒血清，檢測時間亦長，且靈敏度相對分子生物學(xué)方法低。此外，番茄斑萎病毒屬(tospovirus)成員中，如果其n蛋白的同源性高，氨基酸水平一致性達(dá)到50％，采用elisa檢測還會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技術(shù)是日本學(xué)者notomi在2000年建立的一種核酸擴(kuò)增方法，該方法具有檢測速度快、靈敏度高、無需專業(yè)儀器等優(yōu)點(diǎn)。rt-lamp檢測是在lamp檢測的基礎(chǔ)上加入反轉(zhuǎn)錄酶，把反轉(zhuǎn)錄與靶基因擴(kuò)增結(jié)合，在60-65℃溫度進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過加入熒光染料即可觀察到結(jié)果。目前rt-lamp已經(jīng)廣泛運(yùn)用到人類、動/植物病毒的檢測和快速診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏、簡便的桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測引物組，包括外側(cè)引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內(nèi)側(cè)引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測引物組在檢測桑脈帶病毒方面的應(yīng)用。

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒，包括rt-lamp檢測引物組、rt-lamp反應(yīng)液、酶溶液和核酸熒光染料；rt-lamp檢測引物組包括外側(cè)引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內(nèi)側(cè)引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

rt-lamp反應(yīng)液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液含有bstdna聚合酶和amv逆轉(zhuǎn)錄酶。

核酸熒光染料為sybrgreenⅰ(10000×)。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒，還包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為感染mvbv的桑葉組織，陰性對照為健康桑葉組織。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒在檢測桑脈帶病毒方面的應(yīng)用。

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法，以待測樣品的總rna為模板，利用rt-lamp檢測引物組進(jìn)行rt-lamp擴(kuò)增反應(yīng)，以檢測待測樣品是否感染桑脈帶病毒；rt-lamp檢測引物組包括外側(cè)引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內(nèi)側(cè)引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

rt-lamp擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為：

反應(yīng)體系：共25μl，包含以下組分：rt-lamp反應(yīng)液12.5μl，酶溶液1μl，濃度20μm的mvbv-fip、mvbv-bip各2μl，濃度20μm的mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl，模板2μl，加rnasefreeh2o至25μl，反應(yīng)結(jié)束加入1μl核酸熒光染料(稀釋10倍)；

反應(yīng)條件：在63℃恒溫下，擴(kuò)增60min，80℃，反應(yīng)5min使酶失活

本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(lamp)技術(shù)，并根據(jù)桑脈帶病毒的基因序列設(shè)計了相應(yīng)的rt-lamp檢測引物組，包括外側(cè)引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內(nèi)側(cè)引物對mvbv-fip和mvbv-bip。由此發(fā)明了桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及試劑盒。本發(fā)明是檢測桑脈帶病毒的首個rt-lamp檢測方法，應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法及試劑盒，僅需通過對疑似感染的待測樣品進(jìn)行rna提取并進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增，一步完成逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，反應(yīng)結(jié)束后加入核酸熒光染料，直觀地根據(jù)反應(yīng)液顏色變化判斷，若反應(yīng)液顯綠色，則判斷為陽性；若反應(yīng)液為橙色，則判斷為陰性；因而可能快速、準(zhǔn)確、高效地檢測出是否感染桑脈帶病毒?？傊景l(fā)明用于檢測桑脈帶病毒具有特異性強(qiáng)、操作簡單和靈敏度高的特點(diǎn)，不需要專門儀器，能通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，無需電泳和紫外觀察等步驟，適用于桑苗繁育和田間桑樹上mvbv的檢測，不僅可應(yīng)用于桑脈帶病毒病的早期診斷、流行學(xué)等研究，而且適合于在基層單位開展mvbv檢測。

附圖說明

圖1是rt-lamp產(chǎn)物可視化圖分析圖，圖中：1攜帶mvbv桑葉樣品(rt-pcr檢測確定含有mvbv的樣品，陽性對照)，2健康桑葉樣品(rt-pcr檢測確定不含有mvbv的樣品，陰性對照)。

圖2是rt-lamp特異性分析圖，圖中：1表現(xiàn)為典型脈帶癥狀的桑葉樣品，2番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tomatozonatespotvirus,tzsv)樣品，3朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(hippeastrumchloroticringspotvirus，hcrv)樣品。

圖3是rt-lamp靈敏度可視化結(jié)果分析圖，圖中：1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖4是rt-lamp靈敏度電泳結(jié)果分析圖，圖中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖5是rt-pcr靈敏度電泳結(jié)果分析圖，圖中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖6是rt-lamp檢測田間桑病樣檢測結(jié)果分析圖，圖中：1陰性對照；2陽性對照；3-8田間樣品。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1mvbvrt-lamp檢測試劑盒的制備

1.1試劑

引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；植物總rna提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；bstdna聚合酶及其反應(yīng)緩沖液購自newenglandbiolabs(neb)公司，amv逆轉(zhuǎn)錄酶購自promega公司，核酸熒光染料為sybrgreenⅰ(10000×)購自上海索萊寶生物科技有限公司，betaine購自生工生物工程(上海)股份有限公司，dntps購自寶生物工程(大連)有限公司(takara)。引物組保存于-20℃冰箱，其他試劑按照對應(yīng)產(chǎn)品說明書描述的條件進(jìn)行保存條件。

1.2試劑盒的組裝

試劑盒包含rt-lamp引物組、rt-lamp反應(yīng)液、酶溶液和核酸熒光染料。

rt-lamp引物組：包括外側(cè)引物對mvbv-f3(seq.id.no.1)和mvbv-b3(seq.id.no.2)、內(nèi)側(cè)引物對mvbv-fip(seq.id.no.3)和mvbv-bip(seq.id.no.4)。

rt-lamp反應(yīng)液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液：8單位(u)的bstdna聚合酶和2單位的amv逆轉(zhuǎn)錄酶

核酸熒光染料：sybrgreenⅰ(10000×)。

陽性對照：含有mvbv的顯癥桑葉。

陰性對照：不含有mvbv的健康桑葉(經(jīng)rt-pcr方法檢測確認(rèn))。

實(shí)施例2rt-lamp檢測方法檢測mvbv及其特異性

檢測樣品3份，其中顯癥桑葉1份、被番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tzsv)侵染的煙草樣品1份和被朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒感染的水鬼蕉1份。

采用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法包括以下步驟：

(1)提取待測樣品總rna：利用天根生化科技(北京)有限公司總rna提取試劑盒提取待測樣品總rna。

(2)建立rt-lamp反應(yīng)體系：在薄壁pcr管中建立25μl的反應(yīng)體系：rt-lamp反應(yīng)液12.5μl，酶溶液1μl，外側(cè)引物mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl(20μm)，內(nèi)側(cè)引物mvbv-fip、mvbv-bip各2.0μl(20μm)，步驟1獲得的總rna模板2μl，加rnasefreeh2o至25.0μl；含有mvbv的桑葉的總rna為對照，健康桑葉的總rna為陰性對照。

(3)rt-lamp反應(yīng)的條件：在63℃恒溫條件下，擴(kuò)增60min，在80℃條件下反應(yīng)5min使酶失活；

(4)分析判斷反應(yīng)結(jié)果：反應(yīng)結(jié)束，在步驟“(3)”獲得的反應(yīng)液中加入1μl核酸熒光染料sybrgreenⅰ(10000×)(稀釋10倍)，若為反應(yīng)液顏色為綠色則判定為陽性反應(yīng)，為橙色則判定為陰性反應(yīng)。

如圖1所示，rt-lamp反應(yīng)的結(jié)果顯示，陽性對照的反應(yīng)液變?yōu)榫G色，而陰性對照的反應(yīng)液保持橙色不變，表明檢測能正常檢測出目標(biāo)病毒mvbv。圖2顯示，待測顯癥桑葉樣品的反應(yīng)液變?yōu)榫G色，而煙草番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tzsv)樣品和朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒的反應(yīng)液保持橙色不變，說明rt-lamp僅檢測出目標(biāo)mvbv，不能檢測出同一血清型的番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tzsv)和同屬的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒，表明引物具有較強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例3mvbvrt-lamp檢測方法的敏感性試驗(yàn)

按照實(shí)施例2提取的含有mvbv的桑病葉組織的總rna，利用微量分光光度計測其濃度，取總rna濃度為10ng/μl的核酸模板進(jìn)行檢測。按照10倍比例進(jìn)行稀釋后用作模板，共設(shè)10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl和10fg/μl共7個梯度。分別進(jìn)行rt-lamp檢測和常規(guī)rt-pcr檢測，rt-lamp檢測步驟同實(shí)施例2中的(2)-(4)。

rt-pcr檢測：采用對應(yīng)的總rna作為模板，rt-pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系按諾唯贊生物科技有限公司的一步法rt-pcr試劑盒說明進(jìn)行，反應(yīng)體系組成為：2×onestepmix25μl，onestepenzymemix2.5μl，上游引物mvbv-n-f(10μm)1μl、下游引物mvbv-n-r(10μm)1μl，模板1μl，加水至50μl。反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35個循環(huán)；72℃終延伸7min。反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35個循環(huán)；72℃終延伸7min；4℃保存。取1.0μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

rt-pcr的引物序列如下：

mvbv-n-f：5'-atgtctaccgtccgtcagctg-3'(seq.id.no.5)，

mvbv-n-r：5'-acttctatagaattagaagtgcttgg-3'(seq.id.no.6)。

結(jié)果顯示，使用rt-lamp方法檢測，當(dāng)模板含量為100fg時，反應(yīng)液呈綠色(陽性反應(yīng))，電泳時條帶清晰可見(圖3、圖4)；使用rt-pcr方法檢測，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)模板含量為1pg時，擴(kuò)增條帶較弱；當(dāng)模板含量為100fg時，已無明顯的可見特性條帶(圖5)。本發(fā)明的rt-lamp檢測方法比常規(guī)rt-pcr檢測方法的靈敏度高10倍。

實(shí)施例4mvbvrt-lamp的檢測試劑盒的應(yīng)用

采集桑樹樣品，包含顯癥樣品、可能攜帶mvbv隱癥樣品和健康無mvbv樣品為試驗(yàn)材料，桑脈帶病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法同實(shí)施例1和案例2。將所提取的桑葉組織總rna作為模板，進(jìn)行rt-lamp檢測。rt-lamp檢測結(jié)果如圖6所示，6份待測桑葉樣品中，3、5、7、8號樣品顯示為綠色，表明這4個樣品中含有病毒，4、6號樣品顯示為橙色，表明這2個樣品中沒有病毒樣品。其中3號樣品為無癥狀的隱癥樣品，說明rt-lamp方法檢測到隱癥樣品中的目標(biāo)病毒。

sequencelisting

<110>廣西大學(xué)

<120>桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<400>1

agagacagaggtcctccaatg21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<400>2

caatgccgggattgatgattg21

<210>3

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(46)

<400>3

cctttggtgtctgcttatggtctatagcatcagcctcaatgcacaa46

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(43)

<400>4

atttggattcgttgcttgctgcactgaggcactcatcagagtt43

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<400>5

atgtctaccgtccgtcagctg21

<210>6

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<400>6

acttctatagaattagaagtgcttgg26