本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種新型新生兒敗血檢快速檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

新生兒敗血癥是新生兒常見疾病之一，指新生兒期致病菌經(jīng)各種途徑侵入其血循環(huán)系統(tǒng)，并在其中生長繁殖、產(chǎn)生毒素，最終造成全身性的炎癥反應(yīng)。該病的病因較復(fù)雜，常見致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白桿菌及b組鏈球菌等，主要通過宮內(nèi)感染、產(chǎn)時感染及產(chǎn)后感染。新生兒敗血癥是新生兒常見的全身性疑團莫釋感染疾病。

新生兒時期該病的發(fā)生率和病死率均較高，常常會危及到新生兒的生命，嚴(yán)重者可并發(fā)化膿性腦膜炎并遺留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，但因缺乏典型的臨床表現(xiàn)和體征，往往病情進展迅速，嚴(yán)重威脅新生兒的生命。由新生兒敗血癥引起的指新生兒期病原菌進入血液循環(huán)系統(tǒng)并進行繁殖釋放毒素進而導(dǎo)致全身性感染，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一，其發(fā)生率為0。1％至1.0％，在早產(chǎn)兒中發(fā)生率更高，病死率高達10％至50％，因此做好早期診斷具有重要意義。

目前，臨床上的血培養(yǎng)檢測細(xì)菌常用方法由于檢測時間長，且陽性率較低，難以達到早期診斷的目的。例如，作為目前新生兒敗血癥有主要診斷手?jǐn)嗟募?xì)菌培養(yǎng)，受細(xì)菌培養(yǎng)周期的影響，其相關(guān)診斷結(jié)果需要在培養(yǎng)后72小時以后才可以獲得。即便如此，由于一些相關(guān)細(xì)菌分離存在一定的困難，使得結(jié)果出現(xiàn)一定概率的假陰性，相關(guān)報告表明在確診的新生兒中有30％-40％的患兒血液培養(yǎng)時出現(xiàn)了假陰性情況。而臨床常用的其它非特異性指標(biāo)也存在著一定的問題，例如crp在感染后24小時左右才會出現(xiàn)升高的情況，而出生體重較低的嬰兒反應(yīng)更慢，白細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)在診斷新生兒敗癥明缺乏敏感性與特異性。

對于新生兒敗血癥的檢測與診斷，傳統(tǒng)的診斷方法存在的固有的缺點，例如操作周期長，靈敏度低等。因此有必要建立一個快速、準(zhǔn)確的診斷方法，確保新生兒敗血癥檢測與診斷進行快速診斷

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型新生兒敗血癥快速檢測試劑盒，其目的在于對新生兒敗血癥進行快速檢測，起到早其診斷的目的，可用于臨床可疑感染患者的病原鑒別與診斷。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：通過一種熒光pcr引物、探針及試劑盒的制備對疑似患有新生兒敗血癥的患兒的血樣進行分析、檢測，進而起到快速診斷新生兒敗血癥的目的。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測用引物及探針對新生兒敗血癥進行檢測。

進一步，本發(fā)明提供的用于檢測新生兒敗血癥的引物序列為seqidno.1～seqidno.2

進一步，本發(fā)明提供的用于檢測新生兒敗血癥的所述探革蘭陽性菌及陰性菌探針，所述序列分別為seqidno.3和seqidno.4，探針的5’端分別連接不同的報告基團，3’端連接非發(fā)光的猝滅基團：

優(yōu)選的，所述報告基團為fam,tet,joe或hex其中一種，淬滅基團為tamra或bhq1其中一種，所述檢測體系中還加有rt-pcrmix及超純水。所述試劑盒還含有rt-pcr酶及陽性對照品。

優(yōu)選的，所述陽性對照品以革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的目的基因片斷進行pcr擴增并將擴增的目的電泳條帶回收，連接到克隆質(zhì)粒載體，測序篩選陽性克隆，并以陽性重組質(zhì)粒做為陽性對照品，革蘭陽性菌上下游引物引物序列分別為seqidno.5和seqidno.6，革蘭陰性菌的上下游引物序列分別為seqidno.7和seqidno.8。

優(yōu)選的，本發(fā)明，通過紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并將其最終稀釋到10⁸copies/μl。

優(yōu)選的，本發(fā)明，陰性對照管包含高溫壓滅的焦碳酸二乙脂處理水。

優(yōu)選的，本發(fā)明，試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，待測樣品5μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為100-1000nm，探針濃度為50-500nm。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述待測樣品為樣本核酸提取液體及陽性對照品。

本發(fā)明的pcr擴增程序為：94℃2min；94℃15s；60℃1min,40個循環(huán)。

本發(fā)明樣本核酸提取液來自新生兒血液。

本發(fā)明提供的熒光宣試劑盒需保存于-20℃條件下，熒光檢測體系混合液需避光保存。

本發(fā)明的優(yōu)點在于快速檢測新生兒敗血癥。本試劑盒法靈敏度高、特異性好，能夠檢測到最低濃度為10copies/μl數(shù)量級的陽性標(biāo)準(zhǔn)品，能夠特異性識別新生兒敗血癥并對細(xì)菌進行分型。

附圖說明

附圖1為本試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖2為陽性革蘭菌及陰性革蘭菌的特異性擴增結(jié)果。

附圖3為本試劑盒陽性標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果。

附圖4為本試劑盒的檢測范圍測試，從左到右依次為10⁶、10⁵、10³、10²、10copies/μl。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、優(yōu)點和技術(shù)方案容易理解，結(jié)合下面實施案例，對本發(fā)明作進一步的說明，對本發(fā)明的具體實施案例進行解釋，當(dāng)不限定本發(fā)明的具體使用范圍。

實施例1：陽性標(biāo)準(zhǔn)品的獲得及檢測分析

參見圖1，一種新型新生兒敗血癥快速檢測試劑盒，由1、熒光檢測反應(yīng)板，2、rt-pcr酶混合液管，3、陰性對照管，4、陽性對照管(革蘭陽性)，5、陽性對照管(革蘭陰性)及6、盒體組成。其中反應(yīng)板裝有熒光檢測體系混合液，陽性對照管中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品按如下步驟制備：

以革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌及革蘭陰性菌大腸埃希菌為模板進行普通rt-pcr擴增。如圖2所示，3株金黃色葡萄球菌擴增后，均獲得920bp產(chǎn)物。另外3株菌大腸埃希菌擴增后，均獲得353bp產(chǎn)物。

將目的電泳條帶回收，連接到克隆質(zhì)粒載體，并以陽性重組質(zhì)粒做為陽性對照品。通過紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并將其最終稀釋到10⁸copies/μl。

建立擴增體系，具體擴增體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，陽性重組質(zhì)粒2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴增程序為：94℃2min；94℃15s；60℃1min,40個循環(huán)。結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，擴增片段在預(yù)期范圍內(nèi)，且引物的特異性良好。

實施例2：試劑盒的檢測范圍檢測

分別以1-10⁶copies/μl濃度梯度的質(zhì)粒為模板做多重?zé)晒鈘t-pcr，測試所建立體系的可行性，試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，陽性重組質(zhì)粒2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴增程序為：94℃2min；94℃15s；60℃1min,40個循環(huán)。結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出,試劑盒的最低檢測濃度為10copies/μl,檢測的的靈敏度高，體系表現(xiàn)良好。

實施例3：試劑盒重復(fù)性及敏感性分析

選取經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)的稀釋品分別為100cfu、50cfu、10cfu、5cfu、1cfu和0cfu的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌進行雙重?zé)晒舛縫cr檢測，每個濃度檢測6個平行樣，3次重復(fù)，分析檢測結(jié)果的重復(fù)性(cv值)。試劑盒檢測體系為：熒光檢測體系混合液10μl，rt-pcr酶3.5μl，待測樣品為2μl。熒光檢測體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為400nm，探針濃度為250nm。pcr擴增程序為：94℃2min；94℃15s；60℃1min,40個循環(huán)。結(jié)果如下表所示。

由上表可知，雙重實時熒光定量pcr檢測濃度100cfu、50cfu、10cfu、5cfu、1cfu和0cfu的樣品，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均不到1.5％，可這說明本試劑盒對具有良好的重復(fù)性。

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