本申請涉及生物，具體提供一種細胞株及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、中國倉鼠卵巢(cho)細胞是用于重組蛋白商業(yè)生產(chǎn)的表達宿主。目前，由cho細胞生產(chǎn)的多種生物治療藥物組合已獲批上市，包括多種單克隆抗體(mab)以及其他蛋白質(zhì)。自30多年前cho細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)工藝出現(xiàn)以來，本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)過不懈的努力顯著改善了cho細胞的生產(chǎn)能力。特別地，過去的工業(yè)化抗體生產(chǎn)滴度通常遠低于1g/l。不過，現(xiàn)在制造團隊抗體的生產(chǎn)實現(xiàn)了克/升以上的滴度，通常在3g/l以上的水平。然而，目前在上游細胞株構(gòu)建篩選階段仍然習(xí)慣使用非靶向轉(zhuǎn)基因整合方法來產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cho細胞庫，從所述的cho細胞庫建立生產(chǎn)細胞系。因此，需要在充滿異質(zhì)性的細胞庫內(nèi)通過繁瑣的篩選鑒定到具有適合生產(chǎn)特性的那些克隆。由于這一類篩選到的細胞株通常是多拷貝的，細胞株不同位點的穩(wěn)定性存在很大的差異。相比之下，位點特異性整合提供了產(chǎn)生更一致的克隆手段，該技術(shù)減少了細胞系開發(fā)時間線。因此，位點特異性整合已經(jīng)成為一種有前途的策略，通過該策略，cho細胞系可以重復(fù)靶向能夠高度活性和穩(wěn)定表達的其優(yōu)選基因組位點。但在位點特異性整合的實際使用過程中，表達結(jié)果仍有待提高，且仍存在錯配率高的問題。

2、有鑒于此，特提出本申請。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本申請的第一目的在于提供一種細胞株。

2、本申請的第二目的在于提供上述細胞株的制備方法。

3、本申請的第三目的在于提供上述細胞株的應(yīng)用。

4、為了實現(xiàn)上述目的，本申請?zhí)夭捎萌缦录夹g(shù)方案，

5、一種細胞株，所述細胞株包含高表達片段和整合在所述高表達片段內(nèi)的外源核酸片段；

6、所述高表達片段包含seq?id?no.1所示的核苷酸序列；

7、所述外源核酸片段包含編碼第一蛋白片段的第一目的基因和編碼第二蛋白片段的第二目的基因，所述第一蛋白片段的表達難度高于所述第二蛋白片段，所述第一目的基因位于所述第二目的基因的上游。

8、進一步地，所述外源核酸片段還包含編碼第三蛋白片段的第三目的基因和編碼第四蛋白片段的第四目的基因，所述第三蛋白片段的表達難度高于所述第四蛋白片段，所述第三目的基因位于所述第四目的基因的上游，其中，所述第一目的基因、所述第二目的基因、所述第三目的基因和所述第四目的基因共同編碼雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

9、進一步地，所述第二目的基因位于所述第三目的基因的上游。

10、進一步地，所述第一蛋白片段為第一輕鏈，所述第二蛋白片段為第二輕鏈，所述第三蛋白片段為第一重鏈，所述第四蛋白片段為第二重鏈；可選地，所述第一輕鏈和所述第一重鏈結(jié)合的蛋白可與第一靶點特異性結(jié)合；所述第二輕鏈和所述第二重鏈結(jié)合的蛋白可與第二靶點特異性結(jié)合。

11、進一步地，所述第一目的基因的序列如seq?id?no.2所示，所述第三目的基因的序列如seq?id?no.3所示，所述第二目的基因的序列如seq?id?no.4所示，所述第四目的基因的序列如seq?id?no.5所示。

12、進一步地，所述第一目的基因和所述第二目的基因的上游分別含有編碼seq?idno.6所示第一信號肽的核苷酸序列，所述第三目的基因和所述第四目的基因的上游分別含有編碼seq?id?no.7所示第二信號肽的核苷酸序列。

13、進一步地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第11至430個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

14、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第21至414個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

15、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第38至402個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

16、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第53至389個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

17、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第73至373個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

18、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第91至360個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

19、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第108至342個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

20、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第126至326個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

21、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第143至310個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

22、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第160至295個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

23、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第178至274個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

24、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第194至263個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

25、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第209至253個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

26、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第221至242個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

27、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第231至240個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

28、可選地，所述外源核酸片段的整合位點為cho細胞上的注釋信息如nw_003616785.1:83044所示位置。

29、進一步地，所述細胞株為cho細胞。

30、一種細胞株的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將所述外源核酸片段定點整合入所述高表達片段內(nèi)，得到所述細胞株。

31、進一步地，所述制備方法包括以下步驟：

32、s1：設(shè)置外源核酸片段，所述外源核酸片段在5’-3’方向依次包括編碼第一輕鏈的第一目的基因、編碼第二輕鏈的第二目的基因、編碼第一重鏈的第三目的基因和編碼第二重鏈的第四目的基因，所述第一目的基因的表達難度高于所述第二目的基因，所述第三目的基因的表達難度高于所述第四目的基因；所述第一目的基因、所述第二目的基因、所述第三目的基因和所述第四目的基因均獨立地分別在上游設(shè)有編碼信號肽的核苷酸序列；

33、所述第一目的基因、所述第二目的基因、所述第三目的基因和所述第四目的基因共同編碼雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段；

34、s2.將所述外源核酸片段定點整合入高表達片段內(nèi)，得到細胞株。

35、上述細胞株在蛋白表達中的應(yīng)用。

36、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請的技術(shù)效果為：

37、本申請通過對cho細胞內(nèi)的基因位點進行篩選和分析，得到適用于位點特異性重組(或稱位點特異性整合)技術(shù)的插入位點及高表達片段，通過進一步研究發(fā)現(xiàn)多種目的蛋白的情況下，當(dāng)編碼相對難表達的蛋白的基因位于編碼相對易表達的蛋白的基因的上游時，即通過限定目的蛋白的基因的順序，可實現(xiàn)目的蛋白的高表達、多種目的蛋白的均衡表達，以及降低目的蛋白的錯配率的目的。

技術(shù)特征：

1.一種細胞株，其特征在于，所述細胞株包含高表達片段和整合在所述高表達片段內(nèi)的外源核酸片段；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞株，其特征在于，所述外源核酸片段還包含編碼第三蛋白片段的第三目的基因和編碼第四蛋白片段的第四目的基因，所述第三蛋白片段的表達難度高于所述第四蛋白片段，所述第三目的基因位于所述第四目的基因的上游，其中，所述第一目的基因、所述第二目的基因、所述第三目的基因和所述第四目的基因共同編碼雙特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞株，其特征在于，所述第二目的基因位于所述第三目的基因的上游。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞株，其特征在于，所述第一蛋白片段為第一輕鏈，所述第二蛋白片段為第二輕鏈，所述第三蛋白片段為第一重鏈，所述第四蛋白片段為第二重鏈；可選地，所述第一輕鏈和所述第一重鏈結(jié)合的蛋白可與第一靶點特異性結(jié)合；所述第二輕鏈和所述第二重鏈結(jié)合的蛋白可與第二靶點特異性結(jié)合。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞株，其特征在于，所述第一目的基因的序列如seq?idno.2所示，所述第三目的基因的序列如seq?id?no.3所示，所述第二目的基因的序列如seqid?no.4所示，所述第四目的基因的序列如seq?id?no.5所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細胞株，其特征在于，所述第一目的基因和所述第二目的基因的上游分別含有編碼seq?id?no.6所示第一信號肽的核苷酸序列，所述第三目的基因和所述第四目的基因的上游分別含有編碼seq?id?no.7所示第二信號肽的核苷酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的細胞株，其特征在于，所述外源核酸片段的整合位點為高表達片段的第11至430個堿基區(qū)間內(nèi)的任意位點；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細胞株，其特征在于，所述細胞株為cho細胞。

9.一種權(quán)利要求1至8任一項所述的細胞株的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：將所述外源核酸片段定點整合入所述高表達片段內(nèi)，得到所述細胞株。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

11.權(quán)利要求1至8任一項所述的細胞株在蛋白表達中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體提供一種細胞株及其制備方法與應(yīng)用。細胞株包含高表達片段和整合在高表達片段內(nèi)的外源核酸片段；高表達片段包含SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；外源核酸片段包含編碼第一蛋白片段的第一目的基因和編碼第二蛋白片段的第二目的基因，第一蛋白片段的表達難度高于第二蛋白片段，第一目的基因位于第二目的基因的上游。該高表達片段可實現(xiàn)目的蛋白的穩(wěn)定高表達，同時通過限定目的蛋白的順序，可實現(xiàn)目的蛋白的高表達、多種目的蛋白的均衡表達，以及降低目的蛋白的錯配率的目的。

技術(shù)研發(fā)人員：陳亮,張寧,林隆志,梁國龍
受保護的技術(shù)使用者：深圳太力生物技術(shù)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8