本發(fā)明涉及一種含有雙噬菌體來(lái)源啟動(dòng)子的組成型表達(dá)載體、包含其的細(xì)菌及應(yīng)用，屬于基因工程和生物治療領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、癌癥是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一，并且癌癥的患病率每年在不斷增加。在所有的惡性腫瘤中，實(shí)體瘤約占90％，如肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等。

2、實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境具有共同的特征，包括異常的腫瘤血管系統(tǒng)、過(guò)多的結(jié)締組織、免疫抑制、酸性環(huán)境和低氧區(qū)域等。此外，實(shí)體瘤的異常微環(huán)境是傳統(tǒng)治療藥物難以穿透的天然屏障，化療藥物以及抗體類藥物在實(shí)體瘤微環(huán)境內(nèi)難以擴(kuò)散。并且，缺乏氧自由基使腫瘤對(duì)化學(xué)療法和放射療法產(chǎn)生抗性。

3、由于實(shí)體瘤內(nèi)的低氧環(huán)境，兼性厭氧菌和專性厭氧菌能夠侵入腫瘤并抑制其生長(zhǎng)，因此可用作具有巨大潛力的治療劑或載體。

4、早在1868年，德國(guó)醫(yī)生w.busch首先報(bào)道了部分腫瘤患者在感染細(xì)菌(肺炎鏈球菌)的同時(shí)，體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)被抑制，甚至?xí)粡氐浊宄?。在之后的三十年?nèi)，美國(guó)醫(yī)生coley和另外一名德國(guó)醫(yī)生fehleisen又分別報(bào)道了細(xì)菌感染可以抑制腫瘤這一現(xiàn)象。這些早期的研究工作一直存在爭(zhēng)議，因?yàn)槠浣Y(jié)果難以重復(fù)，細(xì)菌的毒力也難以控制。然而后期經(jīng)過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌的侵染確實(shí)可以降低腫瘤的大小，并且宿主的免疫系統(tǒng)也會(huì)在治療的過(guò)程中被激活。1975年carswell率先報(bào)道革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素(lipopolysaccharide)可以刺激免疫系統(tǒng)釋放腫瘤壞死因子tnf-α，并且可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。此外一些細(xì)菌性的疫苗也被證明可以刺激免疫系統(tǒng)從而治療腫瘤。其中，卡介苗(bcg)是最早應(yīng)用于臨床腫瘤治療的生物制劑。bcg是經(jīng)由強(qiáng)致病性牛型結(jié)核桿菌經(jīng)過(guò)連續(xù)接種傳代230代所制成的減毒活菌懸液，其目的是用于結(jié)核病的預(yù)防。經(jīng)大量試驗(yàn)和臨床實(shí)踐證實(shí)，bcg是治療膀胱癌最有效的手段之一。

5、近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的高速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)一些兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?，能在?shí)體瘤內(nèi)靶向、定植和增殖并誘導(dǎo)腫瘤消退，例如專性厭氧菌梭狀芽孢桿菌(clostridium)，益生菌雙歧桿菌(bifidobacterium)等。其中革蘭氏陰性兼性厭氧菌腸沙門氏菌(salmonella?enterica)的應(yīng)用前景最為廣泛。

6、研究表明，通過(guò)不同方法對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行減毒后，其在腫瘤組織中的定植能力可達(dá)到正常組織的1000-10000倍，可以作為潛在的靶向藥物用于治療腫瘤。

7、關(guān)于重組細(xì)菌靶向腫瘤區(qū)域的改進(jìn)，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道這些重組細(xì)菌也可以攜帶不同類型的藥物起到向腫瘤區(qū)域靶向藥物遞送的效果。然而，其效果卻不理想。原因可能是沒(méi)有綜合考慮細(xì)菌在腫瘤內(nèi)的藥物合成以及遞送的效率。需要著重考慮以下三點(diǎn)：

8、第一，目的藥物表達(dá)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性。

9、之前的細(xì)菌體外表達(dá)技術(shù)考慮的主要因素是在穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高表達(dá)，如在豐富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。但是如果細(xì)菌是處于體內(nèi)腫瘤環(huán)境中，細(xì)菌本身會(huì)面對(duì)復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境(包括低氧、低ph、高乳酸、針對(duì)細(xì)菌的免疫細(xì)胞等極端環(huán)境)的壓力，其生長(zhǎng)及目的蛋白的合成都會(huì)受到影響。并且，細(xì)菌自身的啟動(dòng)子會(huì)受到外界因素的影響，例如化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境、溫度或其他調(diào)控因子的控制等。因此，直接采用細(xì)菌天然的啟動(dòng)子或者采用傳統(tǒng)的細(xì)菌高表達(dá)策略可能會(huì)影響目的藥物蛋白的表達(dá)。此外，由于細(xì)菌染色體的容量有限，大多數(shù)基因都以單基因的形式存在，同時(shí)天然細(xì)菌啟動(dòng)子的強(qiáng)度也不高，因此藥物蛋白的表達(dá)量也會(huì)受到影響，從而影響抑制腫瘤的效果。

10、第二，藥物的選擇非常重要。

11、腫瘤內(nèi)的環(huán)境不是完全封閉的，因此如果在腫瘤內(nèi)直接釋放抗腫瘤的藥物，會(huì)有部分藥物沿血管擴(kuò)散到其他的器官和組織中，造成不必要的副作用。因此，選擇一種僅能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)殺傷腫瘤的藥物尤其重要。

12、第三，藥物的遞送方式非常重要。

13、如果要將藥物遞送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，細(xì)菌需要先入侵腫瘤細(xì)胞，然后在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部釋放藥物。由于細(xì)菌入侵細(xì)胞的方式是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，形成吞噬小泡，細(xì)菌合成的藥物需要穿過(guò)小泡才能到達(dá)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，并且天然細(xì)菌的釋放效率非常低下。因此，需要配合一種高效的穿透小泡釋放藥物的模式，以增加藥物的發(fā)揮效率。

14、綜上所述，目前迫切需要一種能夠使細(xì)菌在體內(nèi)腫瘤中穩(wěn)定、高效表達(dá)、且高效釋放的藥物蛋白系統(tǒng)和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本發(fā)明所使用的蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)的相關(guān)術(shù)語(yǔ)和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語(yǔ)和常規(guī)步驟。

2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明建立了一種在細(xì)菌中穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物蛋白表達(dá)、藥物遞送以及藥物殺傷三合一的系統(tǒng)。

3、為此，本發(fā)明一方面提供了一種組成型質(zhì)粒表達(dá)載體，其含有雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子，分別控制藥物蛋白基因和破膜蛋白基因的表達(dá)，且在宿主細(xì)菌染色體上整合有組成型表達(dá)的啟動(dòng)子控制的特異性噬菌體rna聚合酶基因。

4、本發(fā)明的組成型質(zhì)粒表達(dá)載體包含三個(gè)模塊，分別是：(1)蛋白表達(dá)控制模塊；(2)藥物遞送模塊；(3)藥物殺傷模塊。

5、通過(guò)上述三個(gè)模塊的有機(jī)結(jié)合，配合細(xì)菌的特點(diǎn)，本發(fā)明的組成型質(zhì)粒表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了在細(xì)菌中穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物蛋白表達(dá)、藥物遞送以及藥物殺傷的三合一系統(tǒng)。

6、(1)蛋白表達(dá)控制模塊

7、為了實(shí)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中穩(wěn)定而高效地表達(dá)基因，需要使用不受到環(huán)境影響的高強(qiáng)度啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)。

8、本發(fā)明優(yōu)選采用組成型人工啟動(dòng)子lacuv5控制噬菌體來(lái)源t7?rna聚合酶基因的表達(dá)，并且將此表達(dá)盒整合到細(xì)菌的染色體上，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳。由于t7?rna聚合酶特異性識(shí)別t7啟動(dòng)子，可以對(duì)t7啟動(dòng)子控制的基因?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定并且高強(qiáng)度的表達(dá)。因此，本發(fā)明選擇將藥物遞送模塊基因和藥物殺傷模塊基因分別置于t7啟動(dòng)子的后面，并且放在質(zhì)粒表達(dá)載體中進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。

9、(2)藥物遞送模塊

10、當(dāng)細(xì)菌入侵到腫瘤細(xì)胞中，會(huì)形成吞噬小泡。而吞噬小泡的存在會(huì)限制細(xì)菌及其合成的藥物進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)釋放。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明優(yōu)選采用李斯特菌溶血素o(listeriolysin-o，llo)作為破膜蛋白實(shí)現(xiàn)藥物遞送的目的。

11、(3)藥物殺傷模塊

12、為了實(shí)現(xiàn)僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮殺傷作用的精準(zhǔn)給藥，本發(fā)明采用細(xì)菌ab型外毒素蛋白的a片段實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的細(xì)胞內(nèi)殺傷作用。因?yàn)榧?xì)菌ab型外毒素蛋白的特點(diǎn)是外毒素蛋白可以劃分成獨(dú)立的兩個(gè)功能區(qū)域，其中b片段的特點(diǎn)是可以與靶細(xì)胞的胞外受體特異性結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生變化，并釋放a片段到細(xì)胞質(zhì)中。而a片段僅在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)才能發(fā)揮細(xì)胞毒性的作用，其作用機(jī)制與不同來(lái)源的細(xì)菌外毒素基因有關(guān)。因此，如果表達(dá)載體僅使用a片段，當(dāng)多余的a片段釋放到人體循環(huán)系統(tǒng)中，則不會(huì)產(chǎn)生毒副作用。

13、在采用本發(fā)明的組成型質(zhì)粒表達(dá)載體進(jìn)行腫瘤治療的過(guò)程中，細(xì)菌通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入腫瘤組織，并且在其中定植。在細(xì)菌的內(nèi)部，t7?rna聚合酶穩(wěn)定表達(dá)，促進(jìn)了位于質(zhì)粒上的殺傷藥物外毒素a片段和藥物遞送模塊破膜蛋白llo的穩(wěn)定高表達(dá)。當(dāng)細(xì)菌接近腫瘤組織中癌細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌利用自身的入侵系統(tǒng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞膜內(nèi)吞，形成包含有細(xì)菌的吞噬小泡。此后吞噬小泡會(huì)與細(xì)胞內(nèi)的溶酶體等液泡融合，從而降低吞噬小泡內(nèi)部的ph，此時(shí)細(xì)菌表達(dá)的破膜蛋白llo被激活，致使殺傷藥物外毒素a片段釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。此過(guò)程隨著細(xì)菌在腫瘤內(nèi)部生長(zhǎng)復(fù)制，不斷重復(fù)，引起腫瘤細(xì)胞的快速消解。

14、由此可知，本發(fā)明基于上述三合一系統(tǒng)的完美結(jié)合實(shí)現(xiàn)了在細(xì)菌中穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物蛋白表達(dá)、藥物遞送以及藥物殺傷。

15、因此，在本發(fā)明中，采用含有雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子，分別控制藥物蛋白外毒素a片段和破膜蛋白基因的表達(dá)，且所述噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子結(jié)合宿主細(xì)菌染色體上特異性噬菌體rna聚合酶基因編碼的rna聚合酶。

16、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子選自t7(seq?id?no.1)，t3(seq?id?no.2)和sp6啟動(dòng)子(seq?id?no.3)。

17、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子為t7啟動(dòng)子(seq?idno.1)。

18、此外，根據(jù)雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子方向的不同，本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)載體中雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子的方向相對(duì)，為對(duì)向啟動(dòng)子表達(dá)載體，具體如附圖18所示。

19、此外，為了防止質(zhì)粒表達(dá)載體的丟失，載體的構(gòu)建過(guò)程中需要植入沙門氏菌的一個(gè)必需基因，并同時(shí)在宿主細(xì)菌的染色體上移除該基因，從而形成一個(gè)平衡致死控制機(jī)制，即如果沙門氏菌丟失攜帶的質(zhì)粒載體，則細(xì)菌由于缺乏必需基因而快速死亡，存活下來(lái)的細(xì)菌都攜帶有質(zhì)粒表達(dá)載體，從而保證了整個(gè)系統(tǒng)穩(wěn)定高效地表達(dá)蛋白藥物。

20、沙門氏菌屬的asd基因(seq?id?no.11)及asd的蛋白序列(seq?id?no.12)編碼天冬氨酸β-半醛脫氫酶(aspartate?b-semialdehyde?dehydrogenase)，這是合成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁重要成分二氨基庚二酸(dap)的過(guò)程中所需的酶。敲除沙門氏菌的asd基因會(huì)導(dǎo)致沙門氏菌的裂解死亡，然而當(dāng)在培養(yǎng)基中額外補(bǔ)充dap或者通過(guò)使沙門氏菌攜帶包含asd基因的載體，可以維持沙門氏菌的正常生長(zhǎng)。

21、因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的表達(dá)載體包含沙門氏菌的必需基因asd，且宿主細(xì)菌染色體上的asd基因缺失。

22、為了實(shí)現(xiàn)表達(dá)載體的高效表達(dá)，本發(fā)明的表達(dá)載體優(yōu)選包含質(zhì)粒復(fù)制必需的復(fù)制子。

23、同時(shí)，本發(fā)明的表達(dá)載體不包含抗性基因。

24、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的復(fù)制子選自puc、p15a、cole1和r6k。

25、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的復(fù)制子為puc(seq?id?no.36)。

26、為了穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物殺傷，本發(fā)明選擇了具有高效、特異殺傷力的藥物蛋白，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，又可以防止藥物蛋白泄露后對(duì)其他器官造成誤傷。

27、因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物蛋白基因是細(xì)菌來(lái)源的ab型外毒素藥物基因a片段。

28、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的藥物蛋白基因是經(jīng)沙門氏菌密碼子優(yōu)化后的白喉毒素a片段(dta)(seq?id?no.15)及蛋白序列(seq?id?no.16)。

29、白喉毒素(dt)是一種蛋白毒素，由兩個(gè)功能相對(duì)獨(dú)立的亞基(a和b)通過(guò)二硫鍵連接組成。

30、a亞基(dta)具有酶活性，能夠通過(guò)催化adp的糖基化使延伸因子-2(ef-2)失活，從而阻斷真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。dta是白喉毒素細(xì)胞毒性的主要來(lái)源。

31、b亞基(dtb)無(wú)細(xì)胞毒性，其能與真核細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而介導(dǎo)a亞基進(jìn)入細(xì)胞中?；诎缀矶舅豥ta和dtb獨(dú)立的功能，當(dāng)dta獨(dú)立在細(xì)菌中表達(dá)但未進(jìn)入真核細(xì)胞時(shí)，不會(huì)對(duì)細(xì)菌以及真核細(xì)胞造成危害。只有當(dāng)dta蛋白被釋放進(jìn)入真核細(xì)胞體內(nèi)時(shí)才會(huì)對(duì)真核細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

32、此外，在本發(fā)明其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥物蛋白基因還可以選自其他具有類似a亞基和b亞基功能的ab型細(xì)菌外毒素基因。例如，霍亂毒素a亞基片段基因(seq?id?no.17)及其蛋白序列(seq?id?no.18)、志賀毒素基因stx1的a片段(seq?id?no.19)及蛋白序列(seq?id?no.20)、志賀毒素基因stx2的a片段(seq?id?no.21)及蛋白序列(seq?id?no.22)、百日咳毒素a亞基片段基因(seq?id?no.23)及蛋白序列(seq?id?no.24)、假單胞菌外毒素a亞基片段基因(seq?id?no.25)及蛋白序列(seq?id?no.26)。

33、霍亂毒素(choleratoxin，ct)源于霍亂弧菌，由a、b兩種亞基組成。a亞基是一種adp-核糖轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)破壞g蛋白信號(hào)傳導(dǎo)致使細(xì)胞脫水死亡。而霍亂毒素b亞基(choleratoxin?subunit?b，ctb)通過(guò)與神經(jīng)節(jié)苷脂gm1的戊多糖鏈結(jié)合附于細(xì)胞表面，可被軸突末端吸收并逆向運(yùn)輸至胞體。

34、志賀毒素基因是一個(gè)相關(guān)毒素家族，有兩大類：stx1和stx2。該毒素有兩個(gè)亞基a和b，二者是ab毒素之一。b亞基是一種五聚體，可與宿主細(xì)胞上的特定糖脂結(jié)合，特別是三?；窠?jīng)酰胺(gb3)。b亞基與gb3的結(jié)合會(huì)引起窄管狀膜內(nèi)陷的誘導(dǎo)，從而驅(qū)動(dòng)內(nèi)膜小管的形成，以便細(xì)菌攝取到細(xì)胞中。進(jìn)入細(xì)胞后，a亞基從核糖體60s亞基的28s?rna中裂解特定的腺嘌呤核堿基，從而停止蛋白質(zhì)合成。

35、百日咳毒素(pertussis?toxin，pt)是一種由百日咳博德特氏菌產(chǎn)生的基于蛋白質(zhì)的ab型外毒素，可引起百日咳。pt的a亞基具有酶活性，并在膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)b亞基發(fā)生構(gòu)象變化后轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞。百日咳毒素是一種具有六個(gè)亞基的外毒素(命名為s1至s5，每個(gè)復(fù)合體包含兩個(gè)s4副本)。亞基排列成ab結(jié)構(gòu)：a成分具有酶活性，由s1亞基形成，而b成分是受體結(jié)合部分，由亞基s2-s5組成。pt以非活性形式從百日咳博德特氏菌中釋放。pt與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，被內(nèi)體吸收，然后逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在運(yùn)輸過(guò)程中，a亞基通過(guò)谷胱甘肽和atp的作用而被激活催化異源三聚體g蛋白的adp-核糖基化，因此無(wú)法抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)camp濃度增加，并引起細(xì)胞死亡。

36、假單胞菌外毒素(pseudomonas?exotoxin)是由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的ab型外毒素。a亞基是將nad+上的二磷酸腺苷核糖(adp-ribose)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白質(zhì)上，這一過(guò)程稱為adp-核糖基化修飾。致病機(jī)制是通過(guò)將真核延伸因子2(ef2)的白喉酰胺殘基adp-核糖基化來(lái)抑制ef2，從而導(dǎo)致多肽的延長(zhǎng)停止(毒素的機(jī)制類似于白喉毒素)。

37、為了穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物遞送，本發(fā)明設(shè)計(jì)了精準(zhǔn)的藥物遞送系統(tǒng)。其目標(biāo)是精準(zhǔn)地把細(xì)菌合成的藥物蛋白釋放到腫瘤細(xì)胞中，進(jìn)一步分為細(xì)菌入侵宿主癌細(xì)胞和釋放合成的藥物蛋白兩個(gè)步驟。

38、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用沙門氏菌天然的入侵宿主動(dòng)物細(xì)胞的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌入侵宿主癌細(xì)胞。

39、腸沙門氏菌能夠侵入宿主細(xì)胞并在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，包括宿主的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此能力存在于沙門氏菌的致病島1中。通過(guò)iii型分泌系統(tǒng)1(t3ss1)，沙門氏菌分泌t3ss效應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)大量肌動(dòng)蛋白重排導(dǎo)致膜皺褶，從而形成包含沙門氏菌的吞噬小泡。接著通過(guò)沙門氏菌致病性島2(spi-2)基因編碼的iii型分泌系統(tǒng)2(t3ss2)促進(jìn)沙門氏菌在吞噬小泡中的存活及增殖。

40、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用沙門氏菌自身合成的經(jīng)沙門氏菌密碼子優(yōu)化的李斯特菌溶血素o(listeriolysin-o，llo)基因(seq?id?no.13)及蛋白序列(seq?idno.14)實(shí)現(xiàn)釋放合成藥物蛋白的目的。

41、llo由單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes，lm)的hlya基因編碼合成，可結(jié)合至宿主細(xì)胞膜的膽固醇上，形成直徑35nm的孔狀結(jié)構(gòu)。

42、llo有一個(gè)對(duì)ph敏感的酸性結(jié)構(gòu)域。使llo前體蛋白成熟并開(kāi)始發(fā)揮膜穿孔活性的最適ph約為5.0-5.5，而在ph為中性時(shí)失活。

43、當(dāng)沙門氏菌入侵形成吞噬小泡后，吞噬小泡會(huì)與溶酶體等細(xì)胞內(nèi)液泡發(fā)生融合，從而大大降低ph。在這個(gè)條件下，llo的活性被激活，發(fā)揮穿孔作用，使沙門氏菌實(shí)現(xiàn)釋放合成的藥物蛋白的作用。

44、因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，破膜蛋白基因?yàn)槔钏固鼐苎豩lya基因。

45、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子中，其一依次連接核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal?binding?site,rbs)(seq?id?no.35)與破膜蛋白基因，另一依次連接核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomal?binding?site,rbs)(seq?id?no.35)與藥物蛋白基因。

46、此外，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體的宿主細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。

47、本發(fā)明另一方面提供了一種構(gòu)建本發(fā)明所述質(zhì)粒表達(dá)載體的方法，包括以下步驟：

48、1、依次連接本發(fā)明所述的噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)與破膜蛋白基因，構(gòu)建破膜蛋白基因表達(dá)單元；

49、2、依次連接本發(fā)明所述的噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)與藥物蛋白基因，構(gòu)建藥物蛋白基因表達(dá)單元；

50、3、將質(zhì)粒復(fù)制子，asd基因，以及上述兩個(gè)基因表達(dá)單元連接到一起，形成完整的質(zhì)粒表達(dá)載體。

51、本發(fā)明另一方面提供了一種經(jīng)修飾的革蘭氏陰性菌，其包含本發(fā)明所述的表達(dá)載體。

52、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性噬菌體rna聚合酶基因是與雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子相對(duì)應(yīng)的基因。

53、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性噬菌體rna聚合酶基因選自經(jīng)沙門氏菌密碼子優(yōu)化后的t7?rna聚合酶基因(seq?id?no.4)及t7?rna聚合酶蛋白質(zhì)序列(seq?idno.5)、t3?rna聚合酶基因(seq?id?no.6)及t3?rna聚合酶蛋白質(zhì)序列(seq?id?no.7)和sp6rna聚合酶基因(seq?id?no.8)及sp6?rna聚合酶蛋白質(zhì)序列(seq?id?no.9)。

54、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性噬菌體rna聚合酶基因?yàn)閠7?rna聚合酶基因。

55、為了穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物蛋白的表達(dá)，本發(fā)明將藥物蛋白基因放置于多拷貝的質(zhì)粒表達(dá)載體上，并且通過(guò)t7啟動(dòng)子進(jìn)行控制，以實(shí)現(xiàn)最大強(qiáng)度的表達(dá)藥物蛋白基因。

56、為了實(shí)現(xiàn)更高強(qiáng)度的表達(dá)，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用了t7噬菌體的rna聚合酶表達(dá)系統(tǒng)，其包括t7?rna聚合酶和t7啟動(dòng)子來(lái)控制目的藥物蛋白的表達(dá)。

57、t7?rna聚合酶系統(tǒng)來(lái)源于大腸桿菌t7噬菌體的表達(dá)系統(tǒng)，由于其強(qiáng)大的蛋白表達(dá)能力被廣泛應(yīng)用在大腸桿菌的基因表達(dá)中。t7?rna聚合酶的特點(diǎn)是可以特異性識(shí)別t7啟動(dòng)子，而不會(huì)受到環(huán)境因素的影響。同時(shí)，t7rna聚合酶的rna合成速度是大腸桿菌rna聚合酶的五倍，因此可以高強(qiáng)度表達(dá)目的蛋白。

58、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以替代地將t7聚合酶及t7啟動(dòng)子替換成t3聚合酶及t3啟動(dòng)子。與t7?rna聚合酶系統(tǒng)類似，t3?rna聚合酶系統(tǒng)是一種來(lái)源于t3噬菌體的高度特異性識(shí)別t3啟動(dòng)子序列的rna聚合酶體系?；蛘呖梢蕴娲貙7聚合酶及t7啟動(dòng)子替換成sp6聚合酶及sp6啟動(dòng)子。與t7?rna聚合酶系統(tǒng)類似，sp6聚合酶也是一種來(lái)源于sp6噬菌體的高度特異性識(shí)別sp6啟動(dòng)子序列的rna聚合酶體系。t3?rna聚合酶或sp6?rna聚合酶與其相應(yīng)的啟動(dòng)子可功能性替換t7?rna聚合酶，特異性控制下游目的基因的表達(dá)。

59、為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)而不受細(xì)菌內(nèi)部代謝以及腫瘤內(nèi)微環(huán)境的影響，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，特異性噬菌體rna聚合酶基因的表達(dá)由組成型表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)控。

60、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步采用了組成型表達(dá)的lacuv5啟動(dòng)子(seqid?no.10)控制特異性噬菌體rna聚合酶基因的表達(dá)。

61、lacuv5啟動(dòng)子與經(jīng)典的lac啟動(dòng)子非常相似。與lac啟動(dòng)子相比，在-10區(qū)域僅包含2個(gè)堿基對(duì)的突變。lacuv5啟動(dòng)子不需要額外的激活劑，并且可以驅(qū)動(dòng)高水平的基因表達(dá)。雖然不需要激活劑，但lacuv5啟動(dòng)子的表達(dá)在大腸桿菌中可由laci阻遏物調(diào)節(jié)，并可由iptg誘導(dǎo)。在100μm至1.5mm的濃度范圍內(nèi)使用時(shí)，iptg是有效的誘導(dǎo)劑。

62、由于沙門氏菌在進(jìn)化過(guò)程中丟失了laci基因以及整個(gè)lac操縱子，因此在沙門氏菌中使用lacuv5啟動(dòng)子是一個(gè)絕佳的組成型表達(dá)系統(tǒng)。

63、因此，在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步將lacuv5啟動(dòng)子控制的t7?rna聚合酶表達(dá)盒轉(zhuǎn)入沙門氏菌的染色體，從而實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的組成型表達(dá)。

64、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性菌還包含低氧特異性基因表達(dá)盒，其包含：

65、a)正向低氧啟動(dòng)子，其為包含fnr結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子，所述正向低氧啟動(dòng)子能夠在低氧下被誘導(dǎo)表達(dá)；

66、b)生存必需基因；以及

67、c)反向高氧啟動(dòng)子，其為包含fnr及arca結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子，所述反向高氧啟動(dòng)子能夠在正常器官的氧氣含量條件下行使功能；

68、所述生存必需基因是編碼丙氨酸消旋酶的基因。

69、“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本發(fā)明中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然氨基酸的聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾形式，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥化和adp-核糖基化。

70、在本發(fā)明中，“多核苷酸”是指多個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸的序列可以針對(duì)不同的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，從而改善多肽的表達(dá)。進(jìn)行密碼子優(yōu)化的方法是本領(lǐng)域已知的。

71、為了實(shí)現(xiàn)細(xì)菌僅在低氧氣濃度條件下存活，需要滿足三個(gè)要求：

72、1)對(duì)上游啟動(dòng)子的強(qiáng)度及本底泄露表達(dá)進(jìn)行控制。

73、如果氧氣感受器在沒(méi)有結(jié)合到上游啟動(dòng)子的情況下就有部分的泄露表達(dá)，則會(huì)造成無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)氧氣的調(diào)控，結(jié)果就是在任何氧氣濃度下細(xì)菌都會(huì)存活；或者如果上游啟動(dòng)子的強(qiáng)度過(guò)弱則無(wú)法啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致在任何氧氣濃度下細(xì)菌都會(huì)不存活；

74、2)選擇適宜的存活必需基因。

75、通過(guò)對(duì)存活必需基因的選擇，可以保證在存活必需基因不表達(dá)時(shí)細(xì)菌死亡，而在低氧誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)能夠迅速保證細(xì)菌的存活；

76、3)在低氧和高氧的切換情況下，上游啟動(dòng)子可以迅速啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，快速實(shí)現(xiàn)生存必需基因的合成表達(dá)，保證改造后的細(xì)菌可以存活下來(lái)，而在高氧的情況下，則不會(huì)啟動(dòng)必需生存基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

77、因此，在本發(fā)明中，“低氧特異性基因表達(dá)盒”是指在低氧條件下能夠啟動(dòng)必需基因表達(dá)的一段dna，其含有受控于低氧誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的必需基因，且必要時(shí)可進(jìn)一步含有該必需基因表達(dá)所需的其他調(diào)控元件。

78、在本發(fā)明中，“必需基因”是指對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或存活起決定性作用的基因，一旦細(xì)菌缺失此基因或其功能性表達(dá)產(chǎn)物則無(wú)法正常存活、分裂和/或生長(zhǎng)。缺失必需基因或其功能性表達(dá)產(chǎn)物的典型示例是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其在無(wú)特定外源性補(bǔ)充物存在時(shí)，在體外培養(yǎng)條件下或體內(nèi)環(huán)境中無(wú)法正常存活、分裂和/或生長(zhǎng)。必需基因在細(xì)菌染色體上通常以單拷貝存在。

79、由此可知，對(duì)生存必需基因的要求如下：

80、(1)其是細(xì)菌繁殖的必需基因，如果有缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的快速死亡；

81、(2)此基因的產(chǎn)物在普通環(huán)境和人體中不存在，這樣可以保證在人體環(huán)境中不會(huì)脫離控制，并且可以在普通培養(yǎng)環(huán)境中通過(guò)添加該基因相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物方便細(xì)菌的培養(yǎng)和制備；

82、(3)此基因需要在低氧啟動(dòng)子的調(diào)控下快速啟動(dòng)，并且可以快速合成產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)菌的調(diào)控功能。

83、在本發(fā)明中，所述生存必需基因是編碼丙氨酸消旋酶的基因。

84、對(duì)于大腸桿菌以及沙門氏菌這類革蘭氏陰性細(xì)菌來(lái)說(shuō)，細(xì)胞壁是不可或缺的成分。細(xì)胞壁中的核心的成分是肽聚糖。在合成肽聚糖的時(shí)候，細(xì)菌需要一種d-丙氨酸作為重要的組成部分。如果缺失d-丙氨酸，細(xì)菌將無(wú)法合成細(xì)胞壁，進(jìn)而產(chǎn)生裂解。

85、自然界中存在的都是l型的氨基酸，因此革蘭氏陰性菌中存在兩個(gè)基因：生物合成丙氨酸消旋酶的alr基因和dadx，它們負(fù)責(zé)將l-丙氨酸轉(zhuǎn)換成d-丙氨酸，以滿足細(xì)胞壁合成的需求。

86、研究發(fā)現(xiàn)，如果同時(shí)突變alr基因和dadx基因，就可以實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的致死性突變，而這種突變是可以通過(guò)在培養(yǎng)基中額外補(bǔ)充d-丙氨酸得到補(bǔ)償。

87、在我們之前的研究中，yb1沙門氏菌采用的是asd基因作為必需基因進(jìn)行調(diào)控。相比于yb1沙門氏菌而言，本發(fā)明選擇了alr基因和dadx基因作為生存必需基因。alr基因和dadx基因?qū)儆谠诠δ苌贤吹幕颉Ｒ虼?，在本發(fā)明中丙氨酸消旋酶的基因可以是來(lái)自沙門氏菌的alr基因(seq?id?no.27)及沙門氏菌alr的蛋白序列(seq?id?no.28)或沙門氏菌dadx基因(seq?id?no.29)及沙門氏菌dadx的蛋白序列(seq?id?no.30)；或者其他革蘭氏陰性菌的alr或dadx基因或者同等功能的基因。

88、在本發(fā)明中，首先構(gòu)建了alr基因敲除的細(xì)菌，然后再對(duì)另一個(gè)基因dadx進(jìn)行修飾，使得細(xì)菌在編輯后成為alr基因和dadx基因的缺陷菌，同時(shí)使用正向低氧啟動(dòng)子和反向高氧啟動(dòng)子去調(diào)控額外的alr或dadx基因。

89、本發(fā)明所述正向低氧啟動(dòng)子是由fnr調(diào)節(jié)的低氧條件啟動(dòng)子；本發(fā)明所述反向高氧啟動(dòng)子是由fnr和arca負(fù)調(diào)節(jié)的反義啟動(dòng)子。延胡索酸和硝酸還原基因fnr是調(diào)節(jié)沙門氏菌需氧和厭氧性生長(zhǎng)的重要基因，這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)已在大腸桿菌以及沙門氏菌中得到廣泛的研究。其中fnr基因編碼的dna結(jié)合蛋白fnr感知氧氣的變化并控制不同基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)整體代謝水平上的切換。因此，fnr以及arca等dna結(jié)合序列成為控制下游基因表達(dá)的重要方式。

90、fnr有一個(gè)氧氣敏感的[4fe-4s]2+結(jié)構(gòu)域，可以直接感知氧氣，并調(diào)節(jié)位點(diǎn)特異性的dna結(jié)合。相比之下，arca感知來(lái)自有氧呼吸鏈的信號(hào)。因此在沙門氏菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性兼性厭氧菌中存在兩種不同的機(jī)制用于感受氧氣濃度的變化。fnr在調(diào)控低氧的基因表達(dá)時(shí)，分為激活和抑制兩種情況。

91、為此，本發(fā)明采用fnr在低氧情況下激活下游基因表達(dá)的正向低氧啟動(dòng)子yhbu和ynfk，以及fnr與arca在低氧情況下抑制下游基因表達(dá)的反向高氧啟動(dòng)子ydci和cyoa。

92、其中，本發(fā)明應(yīng)用的正向低氧啟動(dòng)子如下：

93、(1)沙門氏菌yhbu啟動(dòng)子(yhbu-s)(seq?id?no.31)，其中包含fnr的結(jié)合位點(diǎn)為“ctgccttaaatcaa”；

94、(2)大腸桿菌ynfk啟動(dòng)子(ynfk-e)(seq?id?no.32)，其中包含fnr的結(jié)合位點(diǎn)為“ttgcgctatctcaa”；

95、其中，本發(fā)明應(yīng)用的反向高氧啟動(dòng)子如下：

96、(1)沙門氏菌cyoa啟動(dòng)子(cyoa-s)(seq?id?no.33)，其中包含fnr的結(jié)合位點(diǎn)為“tttattgataataa”，arca的結(jié)合位點(diǎn)為“gttaagta”；

97、(2)沙門氏菌ydci啟動(dòng)子(ydci-s)(seq?id?no.34)，其中包含fnr的結(jié)合位點(diǎn)為“gttatcaaaaacaa”，arca的結(jié)合位點(diǎn)為“gttaataa”；

98、通過(guò)對(duì)上述反向低氧啟動(dòng)子和正向高氧啟動(dòng)子的分析，我們發(fā)現(xiàn)，其中fnr結(jié)合位點(diǎn)均符合“ttgatnnnnatcaa”的模式，并且保守結(jié)合位點(diǎn)中的ttgat、atcaa序列中任意堿基可以被替換，但是總數(shù)不超過(guò)3個(gè)，并且不能為連續(xù)相鄰的3個(gè)堿基被替換；以及arca符合其核心區(qū)域“gttaatta”的模式，并且保守結(jié)合位點(diǎn)中的gttaatta序列中任意堿基可以被替換，但是總數(shù)不超過(guò)2個(gè)。

99、由此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述正向低氧啟動(dòng)子或反向高氧啟動(dòng)子的fnr結(jié)合位點(diǎn)符合ttgatnnnnatcaa的模式，n為a，t，c，g任意堿基，保守結(jié)合位點(diǎn)中的ttgat、atcaa序列中的任意堿基可以被替換，但被替換的總數(shù)不超過(guò)3個(gè)，且不能為連續(xù)相鄰的3個(gè)堿基被替換；反向高氧啟動(dòng)子的arca結(jié)合位點(diǎn)符合gttaatta的模式，其中任意堿基可以被替換，但被替換的總數(shù)不超過(guò)2個(gè)。

100、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，低氧特異性基因表達(dá)盒的正向低氧啟動(dòng)子和/或反向高氧啟動(dòng)子是來(lái)源于革蘭氏陰性菌的啟動(dòng)子。

101、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，正向低氧啟動(dòng)子選自yhbu、ynfk的啟動(dòng)子區(qū)域序列；生存必需基因選自alr、dadx；反向高氧啟動(dòng)子選自cyoa、ydci的啟動(dòng)子區(qū)域序列。

102、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，正向低氧啟動(dòng)子為yhbu，其選自沙門氏菌、大腸桿菌、志賀菌、耶爾森氏菌、陰溝腸桿菌、克羅諾桿菌、克雷伯氏菌、泛菌屬、沙雷氏菌和西姆惠爾氏菌。

103、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，正向低氧啟動(dòng)子為ynfk，其選自沙門氏菌、大腸桿菌、沙雷氏菌、志賀菌和路氏腸桿菌。

104、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，alr基因和dadx基因選自沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、克雷伯氏菌、耶爾森氏菌、嗜血桿菌和假單胞菌。

105、在本發(fā)明更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒由正向低氧啟動(dòng)子yhbu、生存必需基因alr和反向高氧啟動(dòng)子cyoa組成。

106、在本發(fā)明更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒由正向低氧啟動(dòng)子yhbu、生存必需基因alr和反向高氧啟動(dòng)子ydci組成。

107、在本發(fā)明更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒由正向低氧啟動(dòng)子ynfk、生存必需基因dadx和反向高氧啟動(dòng)子cyoa組成。

108、在本發(fā)明更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒由正向低氧啟動(dòng)子ynfk、生存必需基因dadx和反向高氧啟動(dòng)子ydci組成。

109、專利cn104471057b中公開(kāi)的正向低氧啟動(dòng)子為pept，pept啟動(dòng)子并不完全被fnr調(diào)節(jié)，而是一種crp-camp和fnr雙調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。因此，pept啟動(dòng)子中的fnr結(jié)合位點(diǎn)一半是crp的結(jié)合位點(diǎn)，一半是fnr的結(jié)合位點(diǎn)。pept啟動(dòng)子的crp-fnr結(jié)合區(qū)域序列為gtgacctgacgcaa，其中前半部分gtga符合crp保守結(jié)合位點(diǎn)gtgannnnnntcac中的前半部分，而后半部分cgcaa符合fnr保守區(qū)域atcaa的部分，第十位的a被c替代，第十一位的t被g替代，不符合本發(fā)明中關(guān)于正向低氧啟動(dòng)子的規(guī)則。

110、專利cn104471057b中公開(kāi)的反向高氧啟動(dòng)子soda的fnr結(jié)合區(qū)域ttgataatcatttt僅僅包含fnr的前半個(gè)區(qū)域ttgat，而后半個(gè)區(qū)域包含有連續(xù)三個(gè)替換atcaa替換成atttt，因此不包含完整的fnr結(jié)合位點(diǎn)。其中包含arca的結(jié)合位點(diǎn)為tttaatta，其與arca的保守核心結(jié)合位點(diǎn)5’-gttaatta-3’比較，第一位的g被t取代。因此，soda的啟動(dòng)子僅包含一個(gè)單獨(dú)arca的結(jié)合位點(diǎn)，而其fnr結(jié)合位點(diǎn)不完整，不符合本發(fā)明中關(guān)于反向高氧啟動(dòng)子的規(guī)則。

111、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述低氧特異性基因表達(dá)盒受氧氣濃度的調(diào)控。

112、為了使沙門氏菌等革蘭氏陰性菌實(shí)現(xiàn)低氧區(qū)存活，1％氧氣濃度是一個(gè)非常重要的關(guān)鍵點(diǎn)，其代表的是病理性缺氧。因?yàn)?％氧氣濃度以下是一個(gè)腫瘤低氧區(qū)的一個(gè)明顯標(biāo)志，在正常器官組織中不存在氧氣濃度低于1％的區(qū)域。例如胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤中的低氧區(qū)氧氣濃度低于0.7％。

113、本發(fā)明設(shè)計(jì)的低氧特異性基因表達(dá)盒是通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控氧氣使沙門氏菌等革蘭氏陰性菌識(shí)別腫瘤低氧區(qū)域，并于腫瘤低氧區(qū)域增殖。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)就是在氧氣濃度低于0.8％時(shí)，改造的沙門氏菌等革蘭氏陰性菌可以存活增殖，并且在正常氧氣濃度環(huán)境中實(shí)現(xiàn)自殺裂解。

114、由此，在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述正向低氧啟動(dòng)子在氧氣含量低于1％時(shí)行使功能，而在氧氣含量高于1％時(shí)不能行使功能；和/或

115、反向高氧啟動(dòng)子在氧氣含量高于1％時(shí)行使功能，而在氧氣含量低于1％時(shí)不能行使功能。

116、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述正向低氧啟動(dòng)子在氧氣含量低于0.8％時(shí)行使功能，而在氧氣含量高于0.8％時(shí)不能行使功能；和/或

117、反向高氧啟動(dòng)子在氧氣含量高于0.8％時(shí)行使功能，而在氧氣含量低于0.8％時(shí)不能行使功能。

118、本發(fā)明另一方面提供了一種采用本發(fā)明所述的表達(dá)載體在原核細(xì)胞中控制藥物蛋白表達(dá)的方法，其包含以下步驟：

119、1、制備本發(fā)明所述的表達(dá)載體；

120、2、將組成型表達(dá)噬菌體rna聚合酶基因表達(dá)盒整合至宿主細(xì)菌染色體；

121、3、敲除宿主細(xì)菌染色體上的asd基因；

122、4、將本發(fā)明所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)菌。

123、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括將本發(fā)明所述的低氧特異性基因表達(dá)盒整合到宿主細(xì)菌染色體上。

124、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中的宿主細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。

125、在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“革蘭氏陰性菌”是指進(jìn)行革蘭氏染色已知的部分程序后，未保留作為的最初堿性染料染色劑(如，結(jié)晶紫)的細(xì)菌。在示例性革蘭氏染色中，首先通過(guò)加熱將細(xì)胞固定在載玻片上并用堿性染料(如，結(jié)晶紫)染色，所述堿性染料被革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌兩者吸收。然后，將載玻片用媒染劑(如，革蘭氏碘液)處理，所述媒染劑結(jié)合于堿性染料(如，結(jié)晶紫)并將其截留在細(xì)胞中。然后，將細(xì)胞用丙酮或乙醇洗滌，然后用不同顏色的第二染料復(fù)染色(如，番紅)。革蘭氏陽(yáng)性生物體保留最初的紫色染色，而革蘭氏陰性生物體通過(guò)有機(jī)洗滌溶劑脫色，因此顯示復(fù)染色。示例性革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于埃希氏菌屬種、志賀氏屬種、沙門氏菌屬種、彎曲菌屬種、奈瑟氏菌屬種、嗜血桿菌屬種、氣單胞菌屬種、弗朗西斯氏菌屬種、耶爾森菌屬某種、克雷伯菌屬某種、博德特氏菌屬某種、軍團(tuán)菌屬種、棒狀桿菌屬種、檸檬酸桿菌屬種、衣原體屬種、布魯氏菌屬種、假單胞菌屬種、螺桿菌屬種和弧菌屬種的細(xì)菌。

126、由此，在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性菌選自沙門氏菌、大腸桿菌、志賀菌、耶爾森氏菌、陰溝腸桿菌、克羅諾桿菌、克雷伯氏菌、泛菌屬、沙雷氏菌、西姆惠爾氏菌、路氏腸桿菌、嗜血桿菌、弧形菌、假單胞菌、巴氏桿菌、伯德特氏菌、百日咳桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、伯克霍爾德桿菌、創(chuàng)傷弧菌、脆弱擬桿菌、丁香假單胞菌、惡臭假單胞菌、軍團(tuán)桿菌、肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌、卡他球菌、卡他莫拉菌、空腸彎曲桿菌、痢疾桿菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、莫拉菌、腦膜炎奈瑟菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、溶血性巴氏桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、鼠疫耶爾森菌、宋內(nèi)志賀氏菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、新型隱球菌、洋蔥伯克霍爾德菌和幽門螺桿菌。

127、在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“活菌”是指一種有生命力、活動(dòng)性營(yíng)養(yǎng)代謝特征且能夠行使自身生物功能的菌株?；罹梢园ň甏x過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌類生物量。

128、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性菌是沙門氏菌。

129、當(dāng)將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入革蘭氏陰性菌(例如鼠傷寒沙門氏菌)而作為治療性細(xì)菌時(shí)，整合至細(xì)菌染色體的特異性噬菌體rna聚合酶與雙噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子所控制的藥物蛋白基因和破膜蛋白基因的高效表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的毒性增大。因此，為了實(shí)現(xiàn)作為治療性細(xì)菌的安全性，上述整合了本發(fā)明表達(dá)載體的細(xì)菌需要經(jīng)過(guò)一項(xiàng)或者多項(xiàng)減毒方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行修飾。減毒方法包括但不限于低氧特異性基因表達(dá)盒調(diào)節(jié)系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)缺陷、壓力反應(yīng)缺陷和毒力島調(diào)控缺陷等。

130、因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性菌是減毒的革蘭氏陰性菌。

131、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，減毒的革蘭氏陰性菌是沙門氏菌。

132、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述減毒方法選自沙門氏菌的aroa基因缺陷，低氧特異性基因表達(dá)盒調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

133、本發(fā)明另一發(fā)面提供了本發(fā)明所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明所述的革蘭氏陰性菌在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用。

134、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的腫瘤為實(shí)體瘤。

135、本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)體瘤”是指組織的異常腫塊，通常不包含囊腫或液體區(qū)域。實(shí)體瘤可能是良性的(非癌癥)，或惡性的(癌癥)。不同類型的惡性實(shí)體瘤以形成它們的細(xì)胞類型命名。惡性實(shí)體瘤的實(shí)例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌)通常不形成惡性實(shí)體瘤。惡性實(shí)體瘤包括但不限于可能源自不同組織類型的異常細(xì)胞團(tuán)，所述不同組織類型例如肝、結(jié)腸、結(jié)直腸、皮膚、乳腺、胰腺、子宮頸、子宮體、膀胱、膽囊、腎、喉、唇、口腔、食道、卵巢、前列腺、胃、睪丸、甲狀腺或肺等，因此惡性實(shí)體瘤包括惡性實(shí)體肝腫瘤、結(jié)腸腫瘤、結(jié)直腸腫瘤、皮膚腫瘤、乳腺腫瘤、胰腺腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮體腫瘤、膀胱腫瘤、膽囊腫瘤、腎腫瘤、喉腫瘤、唇腫瘤、口腔腫瘤、食道腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、睪丸腫瘤、甲狀腺腫瘤或肺腫瘤等。

136、由此，在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述實(shí)體瘤選自乳腺、骨、肝、肺、皮膚、腎、胃、胰腺、前列腺、淋巴(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)、腸(結(jié)腸癌、直腸癌)、盆腔(子宮頸癌、卵巢惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌)、神經(jīng)系統(tǒng)、頭頸癌和膀胱的腫瘤/癌癥等。

137、在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述實(shí)體瘤為乳腺癌、骨肉瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、鱗狀細(xì)胞癌和膀胱癌。

138、在本發(fā)明中，為了治療的目的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”優(yōu)選是需要治療目標(biāo)病理病況例如腫瘤的對(duì)象。為了預(yù)防的目的，所述對(duì)象優(yōu)選是處于發(fā)展目標(biāo)病理病況的風(fēng)險(xiǎn)中或傾向于發(fā)展目標(biāo)病理病況的對(duì)象。術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包括活生物體，例如原核生物和真核生物。對(duì)象的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物，例如人、狗、牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、刺猬、大鼠和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所述對(duì)象是人。

139、如本發(fā)明所用，“治療”是用于獲得有益或期望的臨床結(jié)果的過(guò)程。為了本發(fā)明的目的，有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：減少贅生性或癌性細(xì)胞的增殖(或破壞贅生性或癌性細(xì)胞)、抑制贅生性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、縮小或減小腫瘤的大小、緩解惡性腫瘤、減輕惡性腫瘤引起的癥狀、提高患有惡性腫瘤的對(duì)象的生活質(zhì)量、減少治療惡性腫瘤所需的其他藥物劑量、延緩惡性腫瘤進(jìn)展、治愈惡性腫瘤和/或延長(zhǎng)患有惡性腫瘤的患者的存活。

140、如本發(fā)明所用，細(xì)菌、藥物或藥物組合物的“有效量”或“有效劑量”是足以實(shí)現(xiàn)任何一種或多種有益或期望的結(jié)果的量。對(duì)于預(yù)防性用途，有益或期望的結(jié)果包括消除或降低疾病的風(fēng)險(xiǎn)，減少疾病嚴(yán)重性或延遲疾病的發(fā)作，包括疾病的生化、組織學(xué)和/或行為癥狀、其并發(fā)癥以及在疾病發(fā)展期間呈現(xiàn)的中間病理表型。對(duì)于治療性用途，有益或期望的結(jié)果包括諸如減輕疾病(諸如腫瘤)的一種或多種癥狀，減少治療疾病所需的其他藥物劑量，增強(qiáng)另一種藥物的效果，延長(zhǎng)所治療的對(duì)象的存活，和/或延遲患者中癌癥的進(jìn)展。例如，相對(duì)于未接受治療的對(duì)象，“有效量”優(yōu)選地將細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約10％，優(yōu)選至少約20％，更優(yōu)選至少約30％，更優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力可以在預(yù)測(cè)對(duì)人類腫瘤的療效的動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)價(jià)?；蛘撸部梢酝ㄟ^(guò)檢查抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力來(lái)評(píng)價(jià)，這種抑制可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試驗(yàn)在體外測(cè)定。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解對(duì)象的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)如下因素確定這種量，如對(duì)象的大小、對(duì)象癥狀的嚴(yán)重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。

141、如本發(fā)明所用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括當(dāng)與活性成分組合時(shí)允許成分保留生物活性并且與對(duì)象的免疫系統(tǒng)不反應(yīng)的任何材料，包括但不限于崩解劑、粘合劑、填充劑、緩沖劑、張力劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、表面活性劑或潤(rùn)滑劑。優(yōu)選地，該載體適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過(guò)注射或輸注)。例如，根據(jù)施用途徑，可將本發(fā)明的細(xì)菌包裹于一種材料中，以保護(hù)該細(xì)菌免受可使該細(xì)菌失活的酸和其他天然條件的作用。藥學(xué)上可接受的載體包括生理鹽水、pbs緩沖液、無(wú)菌水溶液或分散液和用于臨時(shí)制備注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域公知的。常規(guī)介質(zhì)或試劑，除了任何與活性化合物不相容的范圍外，都可能在本發(fā)明的藥物組合物中。

142、由此，本發(fā)明另一方面提供了一種藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的表達(dá)載體或者本發(fā)明的經(jīng)修飾的細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的細(xì)菌是活菌。

143、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物中還含有藥學(xué)上可接受的載體。

144、在本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的藥學(xué)上可接受的載體選自崩解劑、粘合劑、填充劑、緩沖劑、張力劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、表面活性劑和潤(rùn)滑劑。

145、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于治療實(shí)體瘤。本發(fā)明的細(xì)菌、藥物或藥物組合物通過(guò)如下途徑施用：靜脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、經(jīng)腦內(nèi)施用、胃腸道施用、體表施用、口腔黏膜施用、經(jīng)鼻施用、經(jīng)直腸施用、或經(jīng)陰道施用。

146、在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)菌、藥物或藥物組合物可以被配制為通過(guò)如下途徑施用的形式：靜脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、經(jīng)腦內(nèi)施用、胃腸道施用、體表施用、口腔黏膜施用、經(jīng)鼻施用、經(jīng)直腸施用、或經(jīng)陰道施用。

147、本發(fā)明的藥物或藥物組合物的劑型可以是溶液、乳液、冷凍干燥制劑或懸浮液形式；對(duì)于經(jīng)口施用，劑型可以是片劑或膠囊形式；對(duì)于鼻內(nèi)劑型，劑型可以是粉劑、滴鼻劑或氣溶膠形式；對(duì)于體表施用，劑型可以是水溶液、懸浮液、軟膏、乳膏或凝膠；對(duì)于直腸或陰道施用，劑型可以是栓劑、灌腸劑或作為內(nèi)窺鏡或結(jié)腸鏡檢查程序的一部分遞送。

148、本發(fā)明的細(xì)菌、藥物或藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法制造，諸如發(fā)酵罐中進(jìn)行微生物生長(zhǎng)，隨后進(jìn)行離心濃縮并洗滌、過(guò)濾或透析、常規(guī)造粒、混合、溶解、包封、凍干或乳化過(guò)程及其它方法?？梢砸愿鞣N形式產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)菌、藥物或藥物組合物，包括顆粒、沉淀或微粒、粉末，包括冷凍干燥、旋轉(zhuǎn)干燥或噴霧干燥的粉末、無(wú)定形粉末、注射劑、乳液、酏劑、混懸劑或溶液。制劑可以任選地含有穩(wěn)定劑、ph調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用率調(diào)節(jié)劑以及這些的組合。

149、本發(fā)明的細(xì)菌、藥物或藥物組合物可以單獨(dú)施用，或在載體的存在下與其他化合物或組合物組合施用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌、藥物或藥物組合物可以與其它惡性腫瘤療法(包括但不限于，放射療法、化學(xué)療法和外科手術(shù))組合施用。所述細(xì)菌、藥物或藥物組合物在這樣的情況下可以用作療法中的佐劑。

150、本發(fā)明通過(guò)采用上述技術(shù)方案，獲得了以下的有益效果：

151、1、本發(fā)明通過(guò)對(duì)噬菌體來(lái)源啟動(dòng)子與特異性噬菌體rna聚合酶基因進(jìn)行結(jié)合，使二者相配合，并通過(guò)質(zhì)粒搭載表達(dá)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定、高效地在腫瘤區(qū)域進(jìn)行藥物蛋白的表達(dá)。

152、2、本發(fā)明通過(guò)對(duì)噬菌體來(lái)源啟動(dòng)子與破膜蛋白基因、藥物蛋白基因進(jìn)行組合，使三者相配合，穩(wěn)定、高效地進(jìn)行藥物遞送，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的高效殺傷。

153、3、本發(fā)明通過(guò)合理設(shè)計(jì)低氧特異性基因表達(dá)盒，使修飾的細(xì)菌整體突變率低，在腫瘤內(nèi)部實(shí)現(xiàn)特異性分布，且在正常器官中的清除速度更快。