本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種促進1,3-丙二醇合成的融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、1,3-丙二醇是一種重要的二元醇，可以與二元羧酸縮聚合成聚酯類高分子材料，還可用于生產(chǎn)增塑劑、表面活性劑、乳化劑、破乳劑、潤滑油、染料、油墨、防凍劑、化妝品等。

2、丙烯醛法和環(huán)氧乙烷法是目前1,3-丙二醇主要采用的化學(xué)合成方法。這兩種技術(shù)成熟可靠，但生產(chǎn)成本較高，會產(chǎn)生污染環(huán)境的廢物，限制了大規(guī)模應(yīng)用。

3、生物合成方法相對于化學(xué)合成方法更為環(huán)保，且自然界中擁有多種天然高產(chǎn)1,3-丙二醇的菌株。例如，肺炎克雷伯氏菌(klebsiella?pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiella?oxytoca)、弗氏檸檬酸菌(citrobacter?freundii)等等。這些菌株通過在厭氧或微厭氧條件下代謝甘油合成1,3-丙二醇并同時獲取生長所需的物質(zhì)與能量。

4、合成1,3-丙二醇的代謝通路中，甘油脫水是極為關(guān)鍵的一個步驟。根據(jù)輔因子依賴性區(qū)分，甘油脫水酶可分為兩種，一種是依賴維生素b12的甘油脫水酶，一種是不依賴維生素b12的甘油脫水酶。這兩種酶的同源性較低，但催化原理類似，都是利用腺苷自由基來完成催化，不同的是依賴維生素b12的甘油脫水酶所需的腺苷自由基來自于維生素b12，不依賴維生素b12的甘油脫水酶所需的腺苷自由基來自于s-腺苷甲硫氨酸。但在實際催化環(huán)境中，依賴維生素b12的甘油脫水酶可耐受一定濃度的氧氣，而不依賴維生素b12的甘油脫水酶對氧氣極為敏感，因此在工程應(yīng)用中多以依賴維生素b12的甘油脫水酶為主。例如杜邦公司開發(fā)的以葡萄糖為原料一步發(fā)酵合成1,3-丙二醇的大腸桿菌工程菌(cn100471946c)，suman?lama改造的一株能以葡萄糖為碳源合成1,3-丙二醇的肺炎克雷伯氏菌工程菌株(https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.09.001)。

5、根據(jù)催化蛋白組織形式的不同，依賴維生素b12的甘油脫水酶還可分為兩種：一種是溶解在細(xì)胞漿中的水溶性甘油脫水酶，另一種是與其它輔助蛋白組裝聚集成為一個催化微體的二醇脫水酶。甘油脫水酶與二醇脫水酶的功能與結(jié)構(gòu)均極為相似，都能催化甘油脫水，但二醇脫水酶的功能更多的是偏向于1,2-丙二醇的利用。在不同種類的克雷伯氏菌中，有些兼有甘油脫水酶操縱子(圖1)和二醇脫水酶操縱子(圖2)如肺炎克雷伯氏菌；有些僅有甘油脫水酶操縱子如土生克雷伯氏菌；有些僅有二醇脫水酶操縱子如密歇根克雷伯氏菌。

6、甘油脫水酶操縱子由多個組分構(gòu)成，屬于較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)(圖1)。與之相比，二醇脫水酶結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，是一個一共包含19個基因的操縱序列(圖2)，這些蛋白表達后會緊密結(jié)合形成一個細(xì)胞微區(qū)室結(jié)構(gòu)。細(xì)菌微區(qū)室是廣泛存在于細(xì)菌門中的蛋白質(zhì)細(xì)胞器，由包裹酶核的蛋白殼和活性中間體組成，有加速催化，防止副反應(yīng)，包裹有毒中間體等功能。第一個得到鑒定的細(xì)菌微區(qū)室是羧體，它被用來增強二氧化碳固定。更廣泛的研究表明，細(xì)菌微區(qū)室參與了1,2-丙二醇、乙醇胺、膽堿、甘油、鼠李糖、焦糖和巖藻糖膠的分解代謝。

7、在克雷伯氏菌中，二醇脫水酶微區(qū)室由多個殼蛋白組成，形成一個100-150納米的封閉包膜，包膜中包含二醇脫水酶和丙二醇脫氫酶，這八種殼蛋白分為三大類:六聚體、三聚體和五聚體，它們在酶周圍形成一個多形性的偽二十面體殼，將丙二醇代謝相關(guān)的蛋白包裹在微室中進行反應(yīng)，致密的空間會增加反應(yīng)效率，還可以避免中間物醛的外散，減低細(xì)胞毒性。從空間致密性、包裹有毒物質(zhì)的角度上分析，二醇脫水酶微區(qū)室在催化合成1,3-丙二醇代謝通路中應(yīng)當(dāng)更具優(yōu)勢，但天然二醇脫水酶微區(qū)室的原生功能是將環(huán)境中的1,2-丙二醇代謝為丙酸以供細(xì)胞生長，缺乏能夠催化甘油脫水產(chǎn)物3-羥基丙醛還原合成1,3-丙二醇的醇脫氫酶，3-羥基丙醛只能從微區(qū)室排到胞漿中才能被胞漿中的可溶性醇脫氫酶還原，因此導(dǎo)致了1,3-丙二醇合成過程不通暢，合成效率低。為了完善二醇脫水酶微區(qū)室在1,3-丙二醇合成過程中的缺陷，需要通過分子生物學(xué)改造補充微區(qū)室的醇脫氫酶活性，使1,3-丙二醇的合成在微區(qū)室中完成，避免有毒產(chǎn)物3-羥基丙醛的外排。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主要開發(fā)了能夠包裝進二醇脫水酶微區(qū)室并促進1,3-丙二醇合成的nadph依賴型醇脫氫酶融合蛋白(簡稱為l-yqhd)，以及nadh依賴型醇脫氫酶融合蛋白(簡稱為l-dhat)，并驗證了其對菌株發(fā)酵性能的提升。其是通過在nadph依賴型醇脫氫酶融合蛋白，以及nadh依賴型醇脫氫酶融合蛋白(不包含起始密碼子編碼的甲硫氨酸)的前述增加催化微體中的錨定序列來實現(xiàn)。

2、因而本發(fā)明提供由于催化微體中的錨定序列與nadph依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白，或者與nadh依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白。

3、所述nadph依賴型醇脫氫酶yqhd來源于大腸桿菌，是nadph型醇脫氫酶；所述nadh依賴型醇脫氫酶dhat來源于肺炎克雷伯氏菌，是nadh型醇脫氫酶。兩者的共同點是都能催化3-羥基丙醛合成1,3-丙二醇，異同點是使用的輔因子不同。

4、優(yōu)選地，所述錨定序列的氨基酸序列為mntseletlirtilseql(seq?id?no：1)或者mktfslqtrlysgqgsla(seq?id?no：2)。

5、更優(yōu)選地，錨定序列與nadph依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白l-yqhd的氨基酸序列為(seq?id?no：3)：

6、mntseletlirtilseqlnnfnlhtptrilfgkgaiaglreqiphdarvlitygggsvkktgvldqvldalkgmdvlefggiepnpayetlmnavklvreqkvtfllavgggsvldgtkfiaaaanypenidpwhilqtggkeiksaipmgcvltlpatgsesnagavisrkttgdkqafhsahvqpvfavldpvytytlpprqvangvvdafvhtveqyvtkpvdakiqdrfaegilltliedgpkalkepenydvranvmwaatqalngligagvpqdwathmlgheltamhgldhaqtlaivlpalwnekrdtkrakllqyaervwnitegsdderidaaiaatrnffeqlgvpthlsdygldgssipallkkleehgmtqlgenhditldvsrriyeaar。

7、優(yōu)選地，錨定序列與nadh依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白l-dhat的氨基酸序列為(seq?id?no：4)：

8、mktfslqtrlysgqgslasyrmfdylvpnvnffgpnaisvvgercqllggkkallvtdkglraikdgavdktlhylreagievaifdgvepnpkdtnvrdglavfrreqcdiivtvgggsphdcgkgigiaathegdlyqyagietltnplppivavnttagtasevtrhcvltntetkvkfvivswrnlpsvsindpllmigkpaaltaatgmdalthaveayiskdanpvtdaaamqairliarnlrqavalgsnlqarenmayasllagmafnnanlgyvhamahqlgglydmphgvanavllphvarynlianpekfadiaelmgenitglstldaaekaiaaitrlsmdigipqhlrdlgvkeadfpymaemalkdgnafsnprkgneqeiaaifrqaf。

9、本發(fā)明還提供上述融合蛋白的編碼基因。

10、優(yōu)選地，錨定序列與nadph依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白l-yqhd的編碼基因核苷酸序列為(seq?id?no：5)：

11、atgaatacttctgaactcgaaacccttattcgcaccattcttagcgaacagttaaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctggtttacgcgaacaaattcctcacgatgctcgcgtattgattacctacggcggcggcagcgtgaaaaaaaccggcgttctcgatcaagttctggatgccctgaaaggcatggacgtgctggaatttggcggtattgagccaaacccggcttatgaaacgctgatgaacgccgtgaaactggttcgcgaacagaaagtgactttcctgctggcggttggcggcggttctgtactggacggcaccaaatttatcgccgcagcggctaactatccggaaaatatcgatccgtggcacattctgcaaacgggcggtaaagagattaaaagcgccatcccgatgggctgtgtgctgacgctgccagcaaccggttcagaatccaacgcaggcgcggtgatctcccgtaaaaccacaggcgacaagcaggcgttccattctgcccatgttcagccggtatttgccgtgctcgatccggtttatacctacaccctgccgccgcgtcaggtggctaacggcgtagtggacgcctttgtacacaccgtggaacagtatgttaccaaaccggttgatgccaaaattcaggaccgtttcgcagaaggcattttgctgacgctaatcgaagatggtccgaaagccctgaaagagccagaaaactacgatgtgcgcgccaacgtcatgtgggcggcgactcaggcgctgaacggtttgattggcgctggcgtaccgcaggactgggcaacgcatatgctgggccacgaactgactgcgatgcacggtctggatcacgcgcaaacactggctatcgtcctgcctgcactgtggaatgaaaaacgcgataccaagcgcgctaagctgctgcaatatgctgaacgcgtctggaacatcactgaaggttccgatgatgagcgtattgacgccgcgattgccgcaacccgcaatttctttgagcaattaggcgtgccgacccacctctccgactacggtctggacggcagctccatcccggctttgctgaaaaaactggaagagcacggcatgacccaactgggcgaaaatcatgacattacgttggatgtcagccgccgtatatacgaagccgcccgctaa。

12、優(yōu)選地，錨定序列與nadh依賴型醇脫氫酶融合蛋白l-dhat的編碼基因的核酸序列(seq?id?no：6)：

13、atgaagactttctcactacaaacgcggttgtacagcggtcagggtagcctggcgagctatcgtatgtttgattatctggtgccaaacgttaacttttttggccccaacgccatttccgtagtcggcgaacgctgccagctgctgggggggaaaaaagccctgctggtcaccgacaaaggcctgcgggcaattaaagatggcgcggtggacaaaaccctgcattatctgcgggaggccgggatcgaggtggcgatctttgacggcgtcgagccgaacccgaaagacaccaacgtgcgcgacggcctcgccgtgtttcgccgcgaacagtgcgacatcatcgtcaccgtgggcggcggcagcccgcacgattgcggcaaaggcatcggcatcgccgccacccatgagggcgatctgtaccagtatgccggaatcgagaccctgaccaacccgctgccgcctatcgtcgcggtcaacaccaccgccggcaccgccagcgaggtcacccgccactgcgtcctgaccaacaccgaaaccaaagtgaagtttgtgatcgtcagctggcgcaacctgccgtcggtctctatcaacgatccgctgctgatgatcggtaaaccggccgccctgaccgcggcgaccgggatggatgccctgacccacgccgtagaggcctatatctccaaagacgctaacccggtgacggacgccgccgccatgcaggcgatccgcctcatcgcccgcaacctgcgccaggccgtggccctcggcagcaatctgcaggcgcgggaaaacatggcctatgcttctctgctggccgggatggctttcaataacgccaacctcggctacgtgcacgccatggcgcaccagctgggcggcctgtacgacatgccgcacggcgtggccaacgctgtcctgctgccgcatgtggcccgctacaacctgatcgccaacccggagaaattcgccgatattgctgaactgatgggcgaaaatatcaccggactgtccactctcgacgcggcggaaaaagccatcgccgctatcacgcgtctgtcgatggatatcggtattccgcagcatctgcgcgatctgggggtaaaagaggccgacttcccctacatggcggagatggctctgaaagacggcaatgcgttctcgaacccgcgtaaaggcaacgagcaggagattgccgcgattttccgccaggcattctga。

14、本發(fā)明提供含有所述編碼基因的重組表達載體。具體地，其是原核表達載體。本發(fā)明進一步提供含有所述編碼基因的重組宿主菌。優(yōu)選地，其是密歇根克雷伯氏菌。更優(yōu)選地，將所述編碼基因整合到密歇根克雷伯氏菌的基因組上。更優(yōu)選地，其整合到密歇根克雷伯氏菌的pdup基因位點或者pduq位點上，更具體地實施例中錨定序列與nadh依賴型醇脫氫酶串聯(lián)的融合蛋白l-yqhd的編碼基因整合于pdup位點，錨定序列與nadh依賴型醇脫氫酶融合蛋白l-dhat的編碼基因整合于pduq位點。

15、本發(fā)明進而提供所述編碼基因或其表達載體或其重組宿主菌在制備1，3-丙二醇中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明還提供一種制備1，3-丙二醇的方法，其包括如下步驟：發(fā)酵所述重組宿主菌以產(chǎn)生1，3-丙二醇，進一步包括收集產(chǎn)生的1，3-丙二醇的步驟。

17、優(yōu)選地，所述重組宿主菌采用重組密歇根克雷伯氏菌，具體方法是將所述重組密歇根克雷伯氏菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣量0.5vvm，ph控制為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)24小時后再次接入150g甘油，與初始培養(yǎng)基中的甘油濃度合計100g/l；發(fā)酵60h后結(jié)束發(fā)酵，獲取1，3-丙二醇。

18、本發(fā)明為完善催化微體的催化功能，利用催化微體中的錨定序列，將醇脫氫酶yqhd、dhat構(gòu)建為融合蛋白l-yqhd、l-dhat，使其能夠組裝進催化微體并完善催化微體的功能，進而增強了菌株對1,3-丙二醇的生產(chǎn)能力。開展本發(fā)明原因在于，二醇脫水酶催化微體因為其具有致密的結(jié)構(gòu)，能夠增加局部物質(zhì)的反應(yīng)濃度并且包裹有毒中間體不擴散，但原始的二醇脫水酶催化微體不具備將3-羥基丙醛還原為1,3-丙二醇的功能，導(dǎo)致其在合成1,3-丙二醇方面存在缺陷。另外，其它的1,3-丙二醇工程菌大多使用功能對應(yīng)的可溶性的蛋白完成系列催化，但存在催化環(huán)境松散、有毒中間物外泄等缺陷。