本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的沙門氏菌用于遞送異源載荷的用途及其方法。

背景技術(shù)：

1、微生物(諸如細(xì)菌)可以被基因工程改造以攜帶和遞送異源載荷。涉及基因表達(dá)調(diào)節(jié)的許多當(dāng)前技術(shù)基于質(zhì)粒。然而，基于質(zhì)粒的系統(tǒng)具有許多與其相關(guān)的缺點(diǎn)，包括導(dǎo)入細(xì)胞間的變異性、增強(qiáng)的代謝負(fù)荷、依賴抗生素抗性基因和從所得治療性菌株中去除。

2、可以克服這些問題的一種方式是通過將期望的載荷導(dǎo)入宿主生物體的染色體中。kuhlman和cox(nucleic?acids?research,2010,38:6,e92)公開了一種系統(tǒng)，其中輔助質(zhì)粒tkred催化將“著陸區(qū)(landing?pad)”導(dǎo)入大腸桿菌染色體中的任意位置以能夠插入異源載荷。snoeck等人(biotechnology?and?bioengineering,2019,116:364-374)也使用了這種方法，他們使用絲氨酸重組酶將載荷整合到具有著陸區(qū)的大腸桿菌染色體中，該著陸區(qū)含有位于基因組上隨機(jī)位置的同源att位點(diǎn)。另外，us2014/127816?a1公開了在基因上游和下游的基因間區(qū)域中導(dǎo)入重組酶識(shí)別位點(diǎn)以有效地切除基因。

3、然而，基因組整合也帶來許多挑戰(zhàn)。例如，對(duì)于非常大的構(gòu)建體，將載荷整合到染色體中是費(fèi)力且具有挑戰(zhàn)性的。另外，任何基因組修飾/整合都可能以不可預(yù)測(cè)的方式影響菌株生理學(xué)，從而改變其作為潛在治療性菌株的有效性，尤其是基因在基因間位點(diǎn)被修飾的情況下(如us2014/127816?a1)，其具有破壞或以其他方式影響周圍活性基因的潛在副作用。最后，導(dǎo)入的回路可以產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的量取決于其在基因組中的位置。因此，隨機(jī)整合可導(dǎo)致產(chǎn)生的期望載荷具有不可控和不可靠水平。因此，在本領(lǐng)域中需要能夠?qū)⑤d荷導(dǎo)入宿主生物體的染色體中的改進(jìn)方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，包含在預(yù)先確定基因組位置上的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列的沙門氏菌菌株的產(chǎn)生不僅能夠有效和快速地將任何期望載荷導(dǎo)入到所述菌株中，而且還允許將載荷導(dǎo)入已知轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的基因組位置，從而允許更受控地遞送各種載荷。此外，本發(fā)明人已經(jīng)識(shí)別了特定的假基因組的基因組位置，其包括非活性dna區(qū)域，用于插入這些染色體整合序列，其允許正常的細(xì)菌細(xì)胞生理學(xué)及其作為治療性菌株的能力受到最小程度的影響。通過將“著陸區(qū)”導(dǎo)入細(xì)菌染色體內(nèi)的假基因(非活性dna區(qū)域)中，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⑿禄蚝凸δ軐?dǎo)入沙門氏菌菌株而不影響周圍基因的方式，從而允許正常的細(xì)菌細(xì)胞生理學(xué)和細(xì)菌菌株的任何治療性能力受到最小程度的影響。

2、因此，在第一方面，本發(fā)明公開了一種修飾的減毒活沙門氏菌菌株，所述菌株包含插入預(yù)先確定的假基因組位置中的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

3、在第二方面，本發(fā)明公開了包含本文公開的修飾的減毒活菌株的疫苗組合物。

4、在第三方面，本發(fā)明公開了本文公開的修飾的減毒活菌株用于治療癌癥的用途。

5、在第四方面，本發(fā)明公開了本文公開的修飾的減毒活菌株用于治療感染性疾病的用途。

6、在第五方面，本發(fā)明公開了本文公開的修飾的減毒活菌株用于治療自身免疫性疾病或病癥的用途。

7、在第六方面，本發(fā)明公開了治療、抑制或控制對(duì)象的腫瘤性疾病或感染性疾病的方法，其中該方法包括向?qū)ο笫┯眯揎椀臏p毒活沙門氏菌菌株，所述菌株包含插入預(yù)先確定的假基因組位置中的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?idno:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

8、在第七方面，本發(fā)明公開了用于修飾減毒活沙門氏菌菌株的方法，所述方法包括將合成多核苷酸序列插入減毒活沙門氏菌菌株的預(yù)先確定的假基因組位置中，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

技術(shù)特征：

1.一種修飾的減毒活沙門氏菌菌株，所述菌株包含插入預(yù)先確定的假基因組位置中的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾菌株，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列所定義。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的修飾菌株，其中所述限定重組位點(diǎn)是attb重組位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的修飾菌株，其中所述attb重組位點(diǎn)是phic31?attb重組位點(diǎn)和/或bxbl?attb重組位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列還包含所述限定重組位點(diǎn)兩側(cè)的絕緣子區(qū)域。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾菌株，其中每個(gè)絕緣子區(qū)域選自seq?id?no:43-59中任一個(gè)或與seq?id?no:43-59中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的修飾菌株，其中每個(gè)絕緣子區(qū)域選自seq?id?no:43-59中任一個(gè)或與seq?id?no:43-59中任一個(gè)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株包含插入預(yù)先確定的基因組位置中的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)染色體整合合成多核苷酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株包含三個(gè)染色體整合合成多核苷酸。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列具有根據(jù)seq?id?no:60、61、62的序列或與其具有至少70％同一性的序列。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的修飾菌株，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列具有根據(jù)seq?id?no:60、61、62的序列或與seq?id?no:60、61、62中任一個(gè)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。

12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株是腸道沙門氏菌菌株。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株是腸道沙門氏菌血清型typhi菌株或腸道沙門氏菌血清型typhimurium菌株。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株選自y21a、cvd?908-htra、cvd?909、ty800、m01zh09、x9633、x639、x9640、x8444、zh9pa、dty88、md58、wt05、zh26、sl7838、sl7207、vnp20009、a1-r或其任意組合。

15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株是基因工程改造的菌株。

16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的修飾菌株，其中所述減毒活菌株包含沙門氏菌致病島2(spi-2)基因中的減毒突變和/或第二基因中的減毒突變，優(yōu)選地其中所述spi-2是ssav基因并且所述第二基因是aroc基因。

17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述預(yù)先確定的基因組位置是低轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度或高轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的基因組位置。

18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述異源多核苷酸序列編碼免疫原性化合物和/或癌癥治療劑。

19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的修飾菌株，其中所述異源多核苷酸的大小在1kbp至10kbp的范圍內(nèi)。

20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的修飾菌株，其中所述異源多核苷酸的大小在1kbp至2kbp的范圍內(nèi)。

21.一種疫苗組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的修飾的減毒活菌株。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的疫苗組合物，還包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑。

23.用于治療用途的權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的修飾菌株。

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述用途的修飾菌株，其中所述治療是癌癥的治療。

25.根據(jù)權(quán)利要求24所述用途的修飾菌株，其中所述癌癥選自前列腺癌、肝癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、腦癌、肝細(xì)胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、惡性上皮腫瘤、頭頸癌、皮膚癌或肉瘤，優(yōu)選地其中所述癌癥選自肺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)直腸癌、頭頸癌或乳腺癌。

26.根據(jù)權(quán)利要求23所述用途的修飾菌株，其中所述治療是感染性疾病的治療。

27.根據(jù)權(quán)利要求23所述用途的修飾菌株，其中所述治療是自身免疫性疾病或病癥的治療。

28.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的疫苗組合物，或根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述用途的修飾菌株，其中所述修飾菌株被配制為用于口服施用、瘤內(nèi)施用、瘤周施用、皮內(nèi)施用、皮下施用或腹膜內(nèi)施用。

29.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的疫苗組合物，或根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述用途的修飾菌株，其中所述修飾菌株與免疫療法、化學(xué)療法、放射療法、抗病毒療法、抗細(xì)菌療法、抗真菌療法或抗寄生蟲療法組合施用。

30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的疫苗組合物，或根據(jù)權(quán)利要求29所述用途的修飾菌株，其中所述免疫療法是檢查點(diǎn)抑制劑、抗原特異性t細(xì)胞、治療性抗體或癌癥疫苗。

31.一種治療、抑制或控制對(duì)象的腫瘤性疾病或感染性疾病的方法，其中所述方法包括向所述對(duì)象施用修飾的減毒活沙門氏菌菌株，所述菌株包含插入預(yù)先確定的假基因組位置中的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列所定義。

33.根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述修飾的減毒活菌株根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所定義，或用于根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所定義的用途。

34.一種修飾減毒活沙門氏菌菌株的方法，所述方法包括將合成多核苷酸序列插入所述減毒活沙門氏菌菌株的預(yù)先確定的假基因組位置，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。

35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由seq?id?no:1-30中任一個(gè)或與seq?id?no:1-30中任一個(gè)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列所定義。

36.根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的方法，其中修飾的減毒活菌株根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)定義。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及修飾的減毒活沙門氏菌菌株，所述菌株包含插入預(yù)先確定的假基因組位置中的至少一個(gè)染色體整合合成多核苷酸序列，所述序列包含至少一個(gè)限定重組位點(diǎn)以用于導(dǎo)入編碼多肽的異源多核苷酸序列，其中所述染色體整合合成多核苷酸序列位于至少一個(gè)基因組位點(diǎn)內(nèi)，所述基因組位點(diǎn)由SEQ?ID?NO:1?30中任一個(gè)或與SEQ?ID?NO:1?30中任一個(gè)具有至少70％同一性的序列所定義。本發(fā)明還涉及包含修飾菌株的疫苗組合物及其各種用途和方法。

技術(shù)研發(fā)人員：馬克·比亞內(nèi)斯·卡雷拉,保拉·薩萊諾
受保護(hù)的技術(shù)使用者：波羅卡里恩有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8