本發(fā)明涉及生物檢測(cè)，具體涉及一種檢測(cè)氨死亡標(biāo)志物溶酶體堿化度的化合物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、氨基酸代謝產(chǎn)生氨作為一種副產(chǎn)品，對(duì)細(xì)胞有毒。為了解毒氨，尿素循環(huán)已經(jīng)進(jìn)化并發(fā)生在肝細(xì)胞中。因此，在肝功能衰竭中，不可避免地會(huì)形成高氨血癥，通過(guò)未知的機(jī)制損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致肝性腦病。肝外組織中氨基酸氨基被認(rèn)為是通過(guò)轉(zhuǎn)氨并入谷氨酰胺。這種谷氨酰胺通過(guò)循環(huán)傳遞到肝臟，在那里它釋放氨并允許它進(jìn)入肝細(xì)胞的尿素循環(huán)。然而，某些肝外細(xì)胞也可能通過(guò)谷氨酰胺分解產(chǎn)生氨。雖然肝外細(xì)胞可以利用嘌呤和多胺合成途徑來(lái)處理氨，但這些途徑不能實(shí)現(xiàn)完全清除，殘余的氨可能在細(xì)胞中積累。快速增殖的細(xì)胞需要乙酰輔酶a作為脂肪生成的組成部分，它們必須使用谷氨酰胺分解，通過(guò)補(bǔ)充α-酮戊二酸來(lái)補(bǔ)救三羧酸循環(huán)，從而產(chǎn)生氨作為副產(chǎn)物。

2、t細(xì)胞為其生存而清除了氨，而效應(yīng)細(xì)胞則允許氨的積累來(lái)介導(dǎo)它們的死亡。谷氨酰胺分解衍生的氨沉積在溶酶體中，過(guò)量的氨積累增加溶酶體ph值，并通過(guò)分解線粒體觸發(fā)cd8+?teff細(xì)胞的死亡。這種形式的細(xì)胞死亡的特征是溶酶體堿化和線粒體腫脹，與已知的其他形式細(xì)胞死亡機(jī)制不同。

3、然而，氨對(duì)其他組織細(xì)胞的有害影響尚未被探索。特別是，氨是否由肝外細(xì)胞在生理上產(chǎn)生并發(fā)揮其作用仍在很大程度上是未知的。因此，開(kāi)發(fā)基于氨死亡的溶酶體堿化度相關(guān)試劑和方法對(duì)相關(guān)研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于背景技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)氨死亡標(biāo)志物溶酶體堿化度的化合物、試劑盒及方法，旨在解決現(xiàn)有市面上沒(méi)有溶酶體堿化度相關(guān)的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法的問(wèn)題。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種化合物，具體為一種5-（（4-溴-1-乙氧基-8-羥基-6-甲氧基-3甲基-9,10-二氧-9,10-雙氫蒽-2-基）（乙基）氨基）-8-甲氧基萘-1-磺酸鈉類新化合物，簡(jiǎn)稱為eknoh，其分子式為c31h27brnnao9s，分子量為691.05，且結(jié)構(gòu)式如下所示：

3、。

4、第二方面，本發(fā)明提供了一種化合物eknoh的制備方法，包括以下步驟：

5、s1、使5-（4-溴-1-乙氧基-8-羥基-6-甲氧基-3-甲基-9,10-二氧-9,10-雙氫蒽-2-基）胺與溴乙烷在堿催化下反應(yīng)，得到化合物a，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

6、；

7、s2、將化合物a與8-甲氧基-5-溴萘-1-磺酸鈉在堿催化下反應(yīng)，得到eknoh。

8、優(yōu)選的，在上述制備方法中，步驟s1的反應(yīng)溫度為60-80℃。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟s1所用反應(yīng)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺（dmf），所用堿為na2co3，反應(yīng)產(chǎn)物可用乙酸乙酯先行萃取后，再用石油醚和乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行柱層析，以對(duì)化合物a進(jìn)行純化。

9、優(yōu)選的，在上述制備方法中，步驟s2的反應(yīng)溫度為60-80℃。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟s2所用反應(yīng)溶劑為二甲基亞砜（dmso），所用堿為碳酸鉀，反應(yīng)產(chǎn)物可直接以石油醚和乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行柱層析以得到純化eknoh。

10、第三方面，本發(fā)明提供了化合物eknoh在氨檢測(cè)中的應(yīng)用，且該應(yīng)用不以疾病的診斷和治療為目的。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，化合物eknoh能夠與氨生成熒光物質(zhì)（可用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)光波長(zhǎng)486?nm，發(fā)射光波長(zhǎng)535?nm測(cè)其熒光強(qiáng)度），且對(duì)氨具有專一性，熒光強(qiáng)度與氨含量呈正比，故可用于氨的特異性定量檢測(cè)。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，利用化合物eknoh檢測(cè)了細(xì)胞溶酶體中的氨含量，并根據(jù)待測(cè)樣本中氨含量和對(duì)照樣本中氨含量的差值與對(duì)照樣本中氨含量的比值衡量了待測(cè)樣本中溶酶體的堿化度。

12、第四方面，本發(fā)明提供了一種氨死亡標(biāo)志物溶酶體堿化度檢測(cè)試劑盒，其包含化合物eknoh。

13、優(yōu)選的，上述試劑盒至少包括以下試劑：

14、樣本提取液a，包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、海藻糖、曲拉通x-100、聚乙烯吡咯烷酮k30（pvp30）和牛血清白蛋白（bsa）；

15、樣本提取液b，包含4-羥乙基哌嗪乙磺酸（hepes）、氯化鈉、蔗糖、bsa和聚乙烯吡咯烷酮k40（pvp40）；

16、樣本緩沖液，包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、曲拉通x-100、edta、蔗糖、海藻糖、β-環(huán)糊精、甘露醇、己糖、甲基纖維素、硫酸鈉、葡聚糖和peg6000；

17、蛋白沉淀劑，包含三氯乙酸和十二烷基硫酸鈉（sds）；

18、底物儲(chǔ)備液，包含eknoh和α-環(huán)糊精；

19、顯色輔助試劑，包含次溴酸。

20、更為優(yōu)選的，在樣本提取液a中，ph為7.1-7.6，磷酸二氫鉀含量為12-16?g/l，磷酸氫二鈉含量為2.65-3.85?g/l，海藻糖含量為1.5-2.2?g/l，曲拉通x-100含量為0.6-0.8ml/l，pvp30含量為1.35-1.65?g/l，bsa含量為2.8-5.6?g/l；

21、在樣本提取液b中，ph為7.2-8.0，hepes含量為9.5-16?g/l，氯化鈉含量為10-15g/l，蔗糖含量為0.8-3.6?g/l，bsa含量為3.5-5.7?g/l，pvp40含量為0.8-1.8?g/l；

22、在樣本緩沖液中，ph為7.2-7.6，磷酸二氫鉀含量為9.5-16?g/l，磷酸氫二鈉含量為2.65-3.85?g/l，氯化鈉含量為7-12?g/l，曲拉通x-100含量為0.5-0.8?ml/l，edta含量為0.1-0.5?g/l，蔗糖含量為0.8-1.6?g/l，海藻糖含量為3.5-5.7?g/l，β-環(huán)糊精含量為0.8-1.8?g/l，甘露醇含量為2-5.8?g/l，己糖含量為2.4-3.8?g/l，甲基纖維素含量為0.2-0.8g/l，硫酸鈉含量為0.1-0.6?g/l，葡聚糖含量為0.1-0.6?g/l，peg6000含量為0.1-0.5?g/l；

23、在蛋白沉淀劑中，三氯乙酸含量為100-200?g/l，sds含量為50-100?g/l；

24、在底物儲(chǔ)備液中，使用磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液，ph為7.2-7.6，eknoh的含量為346.3-460.2?mg/l，α-環(huán)糊精的含量為50-100?mg/l；

25、在顯色輔助試劑中，使用磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液，ph為7.6-8.0，次溴酸的含量為8.8-12.2?mg/ml。

26、更為優(yōu)選的，上述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液為100?μmol/l氯化銨水溶液。

27、第五方面，本發(fā)明提供了一種氨死亡標(biāo)志物溶酶體堿化度檢測(cè)方法，包括以下步驟：

28、s1、提取待測(cè)細(xì)胞樣本中溶酶體中的氨，得到待測(cè)樣本溶液；

29、s2、配制空白組、標(biāo)準(zhǔn)組和測(cè)定組，并于25-37?℃、孵育10-30?min后檢測(cè)熒光強(qiáng)度；其中，空白組的反應(yīng)體系中含有eknoh和次溴酸，標(biāo)準(zhǔn)組的反應(yīng)體系中含有eknoh、次溴酸和氯化銨（標(biāo)準(zhǔn)品），測(cè)定組的反應(yīng)體系中含有eknoh、次溴酸和待測(cè)樣本溶液；

30、s3、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算溶酶體堿化度。

31、在上述檢測(cè)方法中，化合物eknoh與氨反應(yīng)所得有熒光物質(zhì)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為486?nm和535nm，故步驟s2可在相應(yīng)條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。優(yōu)選的，在上述檢測(cè)方法中，步驟s2的反應(yīng)條件為：37?℃下孵育10?min。

32、優(yōu)選的，在上述檢測(cè)方法中，步驟s1利用本發(fā)明第四方面提供的試劑盒獲取待測(cè)樣本溶液，具體包括以下操作：

33、s11、向收集的細(xì)胞中加入樣本提取液a，勻漿后離心取上清，再對(duì)上清離心得沉淀；

34、s12、向s11所得沉淀中加入樣本提取液b，混勻后離心收集沉淀；

35、s13、向s12所得沉淀中加入樣本緩沖液和蛋白沉淀劑，離心所得上清即為待測(cè)樣本溶液。

36、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，步驟s11的離心操作為：先于500×g條件下離心收集上清，再將上清于5000×g條件下棄沉淀，最后對(duì)所得上清于30000×g條件下離心收集沉淀；步驟s12的離心操作為：于30000×g條件下離心收集沉淀；步驟s12的離心操作為：于5000×g條件下離心。

37、利用本發(fā)明提供的提取試劑和提取操作，能夠針對(duì)性且有效地獲取溶酶體亞細(xì)胞器，進(jìn)而獲取對(duì)應(yīng)的待測(cè)樣本，使得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

38、優(yōu)選的，在上述檢測(cè)方法中，步驟s3包括以下：

39、s31、根據(jù)公式（1）計(jì)算待測(cè)樣本中的氨含量；

40、（1）；

41、式中，=樣本of（熒光強(qiáng)度）值-空白o(hù)f值，=標(biāo)準(zhǔn)品of值-空白o(hù)f值，c為標(biāo)準(zhǔn)組中加入的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，f為樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)；

42、s32、根據(jù)公式（2）計(jì)算待測(cè)細(xì)胞樣本中的溶酶體堿化度；

43、（2）；

44、所述對(duì)照樣本為未發(fā)生氨死亡的正常細(xì)胞樣本，且對(duì)照樣本的提取及氨含量檢測(cè)同待測(cè)樣本一致。

45、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

46、本發(fā)明成功開(kāi)發(fā)了一種顯色底物即化合物eknoh，該顯色底物與氨反應(yīng)能夠生成有熒光物質(zhì)，且對(duì)氨具有專一性，故在氨特異性檢測(cè)中具有前景?；诨衔飁knoh，本發(fā)明進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)細(xì)胞樣本中溶酶體堿化的試劑盒和方法，填補(bǔ)了市場(chǎng)空白，且具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度更高、樣本用量少等優(yōu)點(diǎn)，為科研工作者在研究氨死亡的機(jī)理、氨死亡相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)等方面提供了檢測(cè)工具和手段。