本發(fā)明屬于甲酚曲唑含量測(cè)定，具體涉及一種甲酚曲唑半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、日光中的紫外線是造成人體皮膚損傷的一個(gè)主要因素，長(zhǎng)時(shí)間的紫外線照射會(huì)使皮膚出現(xiàn)紅斑、瘙癢、色素沉著及皮膚癌等問(wèn)題。因此，為抑制或減弱紫外線對(duì)人類皮膚的損傷，常常在化妝品中添加一些防曬劑。防曬劑是防曬化妝品配方核心所在，且防曬化妝品中的防曬功效與配方中所添加的防曬劑含量有關(guān)。由于大多數(shù)紫外線吸收劑穩(wěn)定性較差，為獲得較高防曬性能的化妝品，某些廠商在產(chǎn)品配方中加入高劑量防曬劑或禁止使用的防曬劑。防曬劑添加過(guò)量時(shí)會(huì)對(duì)人體健康造成一定的危害，如使皮膚粗糙、引起皮膚和眼部刺激性、產(chǎn)生光敏性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至可能會(huì)致癌。近些年來(lái)在防曬化妝品的監(jiān)督抽檢中，防曬劑實(shí)測(cè)含量及種類與標(biāo)簽標(biāo)識(shí)不符的質(zhì)量問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，且不合格率較高。因此，建立專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確高、操作簡(jiǎn)便的防曬劑分析方法以完善防曬產(chǎn)品中紫外線吸收劑的定量檢測(cè)是非常有必要的。

2、苯并三唑類物質(zhì)因?qū)Χ滩ɑ蛘咧胁ㄗ贤饩€具有很好的吸收效果，常常添加于化妝品中用于防曬。為此，我國(guó)2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》對(duì)允許使用的防曬劑做了說(shuō)明，規(guī)定只有甲酚曲唑三硅氧烷（dttso）和亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚（uv-360）兩種紫外線吸收劑能用于防曬化妝品中，并對(duì)其最大使用量作了限定，其余的苯并三唑類紫外線吸收劑均禁止使用。但是調(diào)查發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上防曬化妝品依然存在禁用的苯并三唑類紫外線吸收劑濫用的現(xiàn)象，如甲酚曲唑等。

3、甲酚曲唑（分子式c13h11n3o，相對(duì)分子質(zhì)量255.3）是一種紫外線吸收劑，能吸收陽(yáng)光及熒光光源中的紫外線部分。在化妝品、個(gè)護(hù)產(chǎn)品領(lǐng)域，甲酚曲唑既可以作為一種防曬成分，也可以作為紫外線吸收劑防止化妝品和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品變質(zhì)；在塑料、聚酯、染料、橡膠合成中也常被用作紫外線吸收劑和穩(wěn)定劑，用于高分子材料的聚合及生產(chǎn)制造，避免因紫外線過(guò)度輻射而引起高分子材料老化。因此，對(duì)甲酚曲唑的檢測(cè)可以為含甲酚曲唑產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

4、當(dāng)前，針對(duì)甲酚曲唑的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。如專利文獻(xiàn)cn?119125375?a公開(kāi)一種紡織品中甲酚曲唑的測(cè)定方法，所述方法包括加入萃取溶劑對(duì)待檢紡織品中的甲酚曲唑進(jìn)行提取，利用高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器lc-dad進(jìn)行檢測(cè)分析。該方法在甲酚曲唑的質(zhì)量濃度在10-50μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限21.2mg/kg，回收率為94.1-97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4-5.9%。如非專利文獻(xiàn)《高效液相色譜法測(cè)定防曬化妝品中甲酚曲唑和加分曲唑三硅氧烷》中公開(kāi)一種使用反相高效液相色譜分析甲酚曲唑的方法，首先使用水-四氫呋喃-甲醇溶劑對(duì)化妝品中的甲酚曲唑進(jìn)行提取，用c18柱分離，hplc-dad進(jìn)行定性定量分析。該方法在甲酚曲唑質(zhì)量濃度為5.0-500?mg/l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限為5.0mg/kg，回收率達(dá)到90-110%。

5、上述現(xiàn)有方法均存在儀器價(jià)格昂貴、操作繁雜等缺陷，只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，應(yīng)用不方便，無(wú)法做到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。基于此，本發(fā)明提供一種基于酶聯(lián)免疫分析技術(shù)檢測(cè)甲酚曲唑的方法，所述方法能快速對(duì)待檢物中的甲酚曲唑含量進(jìn)行測(cè)定，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、影響免疫分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與靈敏度，抗體的性質(zhì)取決于免疫半抗原的分子結(jié)構(gòu)，免疫半抗原的設(shè)計(jì)與合成是產(chǎn)生特異性抗體和建立快速檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟?；诖?，本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種甲酚曲唑半抗原，所述半抗原通過(guò)對(duì)甲酚曲唑進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到，所述半抗原結(jié)構(gòu)本身含有羧基端，可直接通過(guò)交聯(lián)劑與載體蛋白偶聯(lián)，偶聯(lián)比高，且與載體蛋白連接后更容易暴露出特異性結(jié)合位點(diǎn)，免疫原性更好。本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種基于所述半抗原獲得的全抗原及抗體。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)甲酚曲唑的試劑盒和檢測(cè)方法。

2、本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種甲酚曲唑半抗原，其特征在于，所述甲酚曲唑半抗原具有式ⅰ所示的結(jié)構(gòu)，或其藥學(xué)上可接受的鹽：

4、（?。?。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種甲酚曲唑半抗原的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

6、（1）將甲酚曲唑和4-溴丁酸乙酯按照摩爾比（0.8-1.6）:1混合，在30-50℃條件下反應(yīng)3-5小時(shí)，獲得中間產(chǎn)物；

7、（2）將中間產(chǎn)物加入甲醇溶解，加入2m?naoh溶液在30-50℃條件下水解反應(yīng)1-3小時(shí)；

8、（3）水解完成后加入2m?hcl調(diào)節(jié)ph至3.5-4.5，析出白色固體，過(guò)濾，洗滌，干燥，得到式ⅰ所示的甲酚曲唑半抗原。

9、優(yōu)選的，所述步驟（1）中甲酚曲唑和4-溴丁酸乙酯的摩爾比為1.2:1，在40℃條件下反應(yīng)4小時(shí)，獲得中間產(chǎn)物。

10、優(yōu)選的，所述步驟（2）中水解條件為40℃條件下水解反應(yīng)2小時(shí)。

11、優(yōu)選的，所述步驟（3）中使用2m?hcl調(diào)節(jié)ph至4.0。

12、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述甲酚曲唑半抗原的制備方法包括如下步驟：

13、s1：將50?ml圓底燒瓶沖洗干凈，用乙醇吹干，將其固定在攪拌器上，加入攪拌子；

14、s2：稱取甲酚曲唑原料225?mg加入到s1步驟準(zhǔn)備好的容器中，加入n,n-二甲基甲酰胺（dmf）2.5ml溶解，攪拌，加入氫化鈉48?mg，室溫反應(yīng)30?min；

15、s3：反應(yīng)完成后，加入172?μl?4-溴丁酸乙酯，40℃反應(yīng)4小時(shí)，蒸干后稱重，加入5ml甲醇將殘留物溶解，加入?2?m?naoh溶液1000?μl，40℃下加熱反應(yīng)2小時(shí)進(jìn)行水解；

16、s4：水解反應(yīng)完全后，用2m的hcl調(diào)節(jié)ph到4，析出白色固體，過(guò)濾，蒸餾水洗滌濾餅，40℃鼓風(fēng)干燥箱干燥，即得到式ⅰ所示的半抗原。

17、在上述制備過(guò)程中，發(fā)明人將上述4-溴丁酸乙酯替換為相同摩爾質(zhì)量的4-溴丁酸甲酯、4-溴丁酸叔丁酯和4-溴丁酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以4-溴丁酸乙酯為原料即能獲得目標(biāo)半抗原，且產(chǎn)率較高。雖然以4-溴丁酸叔丁酯為原料制備得到的中間產(chǎn)物在后續(xù)水解步驟中水解效率更高，但產(chǎn)率和純度數(shù)據(jù)顯示其與4-溴丁酸乙酯為原料制備的目標(biāo)半抗原無(wú)顯著性差異，且本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，4-溴丁酸乙酯的價(jià)格遠(yuǎn)低于4-溴丁酸叔丁酯，所以本發(fā)明優(yōu)選以4-溴丁酸乙酯為原料進(jìn)行制備。

18、本發(fā)明提供的制備方法各合成步驟中所述的固定值僅是優(yōu)化后數(shù)值，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，只要能夠合成相應(yīng)的甲酚曲唑半抗原和全抗原化合物，應(yīng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

19、第三方面，本發(fā)明提供一種甲酚曲唑全抗原，其特征在于，所述全抗原由本發(fā)明第一方面所述的甲酚曲唑半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。

20、所述偶聯(lián)方法選自活潑酯法（即生物偶聯(lián)法）或混合酸酐法；優(yōu)選活潑酯法。

21、所述載體蛋白選自甲狀腺球蛋白（btg）、牛血清白蛋白（bsa）、鑰孔血藍(lán)蛋白（klh）、卵清蛋白（ova）、白喉類毒素、白喉毒素的無(wú)毒突變體、破傷風(fēng)類毒素和細(xì)菌表達(dá)的蛋白中的任意一種或兩種以上的組合。

22、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白，甲酚曲唑半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到甲酚曲唑免疫原。

23、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述載體蛋白為卵清蛋白，甲酚曲唑半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到甲酚曲唑包被原。

24、第四方面，本發(fā)明提供一種甲酚曲唑抗體，其特征在于，所述抗體由本發(fā)明第三方面所述的甲酚曲唑免疫原免疫動(dòng)物獲得。

25、本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本發(fā)明第三方面所述的甲酚曲唑免疫原通過(guò)常規(guī)技術(shù)手段免疫動(dòng)物后獲得所述抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述動(dòng)物為小鼠。

26、第五方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明第一方面所述的甲酚曲唑半抗原、本發(fā)明第三方面所述的甲酚曲唑全抗原、本發(fā)明第四方面所述的甲酚曲唑抗體在如下至少一項(xiàng)中的應(yīng)用：

27、（1）在甲酚曲唑檢測(cè)中的應(yīng)用；

28、（2）在制備用于檢測(cè)甲酚曲唑的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

29、所述產(chǎn)品包括但不限于試紙條、膜條、試劑盒、芯片、模型或檢測(cè)平臺(tái)。

30、在本發(fā)明的一些可實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品為酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（elisa）試劑盒。

31、第六方面，本發(fā)明提供一種酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（elisa）試劑盒，所述試劑盒用于檢測(cè)甲酚曲唑，所述試劑盒包括抗體工作液，所述抗體工作液由本發(fā)明第四方面所述的甲酚曲唑抗體通過(guò)稀釋制備得到。

32、進(jìn)一步，所述試劑盒中還包括由本發(fā)明第三方面所述的甲酚曲唑包被原包被得到的酶標(biāo)板和辣根過(guò)氧化物酶（hrp）標(biāo)記的羊抗鼠抗體（酶標(biāo)二抗）。

33、進(jìn)一步，所述試劑盒中還包括甲酚曲唑標(biāo)準(zhǔn)品工作液，所述甲酚曲唑標(biāo)準(zhǔn)品工作液是甲酚曲唑濃度為0ng/ml、0.003ng/ml、0.01ng/ml、0.03ng/ml、0.09ng/ml、0.27ng/ml、0.81ng/ml和2.43ng/ml的pbs溶液。

34、第七方面，本發(fā)明提供一種甲酚曲唑的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括：利用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa法，使用本發(fā)明第三方面所述的甲酚曲唑包被原包被酶標(biāo)板，加入待檢樣品溶液，同時(shí)加入本發(fā)明第四方面所述的甲酚曲唑抗體，孵育，洗滌拍干，加入酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，經(jīng)底物顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值；繪制elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所述吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品中甲酚曲唑濃度。

35、本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

36、（1）現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)甲酚曲唑的檢測(cè)方法樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)，本發(fā)明提供的基于酶聯(lián)免疫分析的甲酚曲唑檢測(cè)方法在抗原抗體的定性定量方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了儀器分析的不足，為快速檢測(cè)甲酚曲唑的殘留奠定研發(fā)基礎(chǔ)。

37、（2）本發(fā)明的甲酚曲唑半抗原相較于現(xiàn)有技術(shù)中的半抗原，本身含有羧基端，可直接通過(guò)交聯(lián)劑與載體偶聯(lián)，且與載體蛋白連接后更容易暴露出特異性結(jié)合位點(diǎn)，靈敏度更高；在制備特異性抗體時(shí)，半抗原和蛋白質(zhì)偶聯(lián)之后使甲酚曲唑半抗原能夠很好的與b淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，并產(chǎn)生很好的免疫應(yīng)答效果。

38、（3）本發(fā)明的半抗原合成方法簡(jiǎn)單，制成的半抗原產(chǎn)品純度達(dá)到99％，產(chǎn)率高達(dá)90％，可以直接與蛋白偶聯(lián)后免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)甲酚曲唑的特異性抗體。

39、（4）本發(fā)明所提供的抗體可以用于檢測(cè)甲酚曲唑，尤其是多克隆抗體對(duì)甲酚曲唑具有高特異性識(shí)別性能；抗血清效價(jià)為1:12000，最佳小鼠多抗血清ic50為0.216?ng/ml。