背景技術：

1、自然殺傷(nk)細胞是一種細胞毒性固有淋巴樣細胞，通常被鑒定為細胞表面蛋白cd56(cd56+)及其他標志物陽性，并且具有細胞毒性活性。

2、用于免疫治療的nk細胞可從原始來源例如外周血或臍帶血獲得。nk細胞的人工來源包括多能干細胞，其包括誘導性多能干細胞(ipsc)，其是來源于體細胞(通常是成纖維細胞或外周血單核細胞(pbmc))的細胞，以及人胚胎干細胞(hesc)，兩者中的任一者經(jīng)誘導變得能夠無限增殖并且當經(jīng)受適當?shù)姆只瘲l件時分化為其他細胞類型。通過將ipsc順序分化為造血祖細胞(hpc)(也稱為造血干細胞(hsc))，可從ipsc衍生nk細胞。

3、一旦獲得，原代nk或ipsc-nk細胞可在施用至患者之前進行離體擴增。將ipsc分化為nk細胞的方法通常包括使用飼養(yǎng)細胞或含有血清的培養(yǎng)基。為了提供適合于體內(nèi)施用的細胞，仍然需要與產(chǎn)生nk細胞有關的組合物和方法，而不使用異源基因因子，例如動物來源的原料，如胎牛血清(fbs)和/或飼養(yǎng)細胞，并且允許擴大生產(chǎn)規(guī)模。

技術實現(xiàn)思路

1、本公開至少部分地基于發(fā)現(xiàn)將干細胞在懸浮液中分化為造血祖細胞和nk細胞的方法。如本文所提供的，相對于用于分化的二維培養(yǎng)系統(tǒng)，在三維懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的造血祖細胞和nk細胞具有更高的純度，并且表現(xiàn)出更高頻率的所需細胞標志物。不希望受理論的束縛，本文所述的懸浮培養(yǎng)方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)造血祖細胞和/或nk細胞。此外，如本文所證明的，懸浮培養(yǎng)方法是無異種的。不希望受理論的束縛，本文所述的無異種的方法產(chǎn)生適于體內(nèi)施用的細胞。

2、在一些實施方案中，本公開提供了用于產(chǎn)生cd34+/cd43+/cd45+細胞群體的方法，所述方法包括：

3、(i)將祖細胞群體在二維(2d)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)足以形成祖細胞聚集體的時間段；

4、(ii)將所述祖細胞聚集體從2d培養(yǎng)系統(tǒng)傳代至三維(3d)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)；

5、(iii)將所述祖細胞聚集體在所述3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中與分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生所述cd34+/cd43+/cd45+細胞群體的時間段。

6、在一些實施方案中，本公開提供了用于將干細胞群體分化為造血祖細胞群體的方法，所述方法包括：

7、(i)將所述干細胞群體在2d培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)足以形成干細胞聚集體的時間段；

8、(ii)將所述干細胞聚集體從所述2d培養(yǎng)系統(tǒng)傳代至3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)；

9、(iii)使所述3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的干細胞聚集體與分化培養(yǎng)基接觸足以使所述干細胞群體分化為所述造血祖細胞群體的時間段，所述分化培養(yǎng)基包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)途徑激活劑、成纖維細胞生長因子(fgf)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)。

10、在一些實施方案中，所述3d懸浮培養(yǎng)物具有50-50,000ml之間的體積。

11、在一些實施方案中，攪拌所述3d懸浮培養(yǎng)物。在一些實施方案中，以10轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)至100rpm的速率攪拌所述3d懸浮培養(yǎng)物。在一些實施方案中，以70rpm的速率攪拌所述3d懸浮培養(yǎng)物。

12、在一些實施方案中，所述造血祖細胞群體包含cd34+/cd43+/cd45+細胞。

13、在一些實施方案中，所述bmp途徑激活劑是bmp4。在一些實施方案中，所述fgf是fgf2。在一些實施方案中，所述vegf是vegf-165。在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含rho相關的卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(rock)抑制劑。在一些實施方案中，其中所述rock抑制劑是y27632。

14、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含干細胞因子(scf)。在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含促血小板生成素(tpo)。在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含低密度脂蛋白(ldl)。

15、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含所述bmp途徑激活劑、所述fgf、所述vegf和所述rock抑制劑。在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含所述bmp途徑激活劑、所述fgf、所述vegf、scf、tpo和所述ldl。

16、在一些實施方案中，(iii)包括將干細胞聚集體的群體與分化培養(yǎng)基接觸1-5天，其中分化培養(yǎng)基包含所述bmp途徑激活劑、所述fgf、所述vegf和任選的所述rock抑制劑。

17、在一些實施方案中，(iii)包括(a)將干細胞聚集體與包含所述bmp途徑激活劑、所述fgf、所述vegf和所述rock抑制劑的分化培養(yǎng)基接觸1-5天，以產(chǎn)生擬胚體或中胚層細胞，和(b)將擬胚體或中胚層細胞與包含所述bmp途徑激活劑、所述fgf、所述vegf、scf、tpo和所述ldl的分化培養(yǎng)基接觸1-15天。

18、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含1-50ng/ml?bmp、1-50ng/ml?fgf、5-100ng/ml?vegf、0.1-20μm?rock抑制劑、1-200ng/ml?scf、1-100ng/ml?tpo和1-50μg/mlldl或其任意組合。

19、在一些實施方案中，所述祖細胞或干細胞是誘導性多能干細胞(ipsc)。在一些實施方案中，所述祖細胞或干細胞是人胚胎干細胞(hesc)。

20、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基是無血清的。在一些實施方案中，所述方法是無異種的。

21、在一些實施方案中，本公開提供了產(chǎn)生nk細胞群體的方法，所述方法包括：

22、(a)將干細胞群體在2d培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)足以形成干細胞聚集體的時間段；

23、(b)將所述干細胞聚集體從所述2d培養(yǎng)系統(tǒng)傳代至3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)；

24、(c)將所述3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的干細胞聚集體與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和任選的rock抑制劑的第一培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生擬胚體的時間段；

25、(d)將所述擬胚體與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf、scf、tpo和ldl的第一分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生造血祖細胞群體的時間段；

26、(e)將所述造血祖細胞群體與第二分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生所述nk細胞群體的時間段。

27、在一些實施方案中，所述第二分化培養(yǎng)基包含scf、il-7、il-12、il-15、flt3l、嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物和ahr抑制劑。

28、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包含1-100ng/ml?scf、1-50ng/ml?il-7、1-100ng/ml?il-12、1-100ng/ml?il-15、1-100ng/ml?flt3l、0.1-10μm嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物、0.1-10μm?ahr拮抗劑及其任意組合。

29、在一些實施方案中，所述嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物是um729，并且所述ahr抑制劑是sr1。

30、在一些實施方案中，所述bmp途徑激活劑是bmp4，所述fgf是fgf2，所述vegf是vegf-165，并且所述rock抑制劑是y27632。

31、在一些實施方案中，步驟(b)-(e)的每種培養(yǎng)基是無血清的。在一些實施方案中，所述方法是無異種的。

32、在一些實施方案中，所述第一培養(yǎng)基、所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含相同的基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含不同的基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含相同的基礎培養(yǎng)基，并且所述第一培養(yǎng)基包含不同于所述第一和第二分化培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含基礎培養(yǎng)基，所述基礎培養(yǎng)基包含iscove改良的dulbecco培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、重組人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和2-巰基乙醇。

33、在一些實施方案中，步驟(b)的時間段是2-8天，步驟(c)的時間段是1-5天，步驟(d)的時間段是3-15天，并且步驟(e)的時間段是11-25天。在一些實施方案中，步驟(a)-(e)在40-50天內(nèi)發(fā)生。

34、在一些實施方案中，所述干細胞是誘導性多能干細胞(ipsc)或人胚胎干細胞(hesc)。

35、在一些實施方案中，所述造血祖細胞群體包含約50％至約100％的cd34+/cd43+/cd45+細胞。在一些實施方案中，所述nk細胞群體包含約60％至約100％的cd43+/cd45+/cd56+/lfa1+細胞。在一些實施方案中，所述nk細胞群體擴增約1,000至約10,000倍。

36、在一些實施方案中，所述干細胞群體是經(jīng)基因工程化或編輯的。在一些實施方案中，所述nk細胞群體是經(jīng)基因工程化或編輯的。

37、在一些實施方案中，本公開提供了包含通過本文所述方法產(chǎn)生的造血祖細胞的細胞群體。在一些實施方案中，所述造血祖細胞是cd34+/cd43+/cd45+。在一些實施方案中，所述細胞群體包含30-50％的造血祖細胞。

38、在一些實施方案中，本公開提供了包含通過本文所述方法產(chǎn)生的nk細胞的細胞群體。在一些實施方案中，所述nk細胞是cd45+/cd56+/lfa1+。在一些實施方案中，所述細胞群體包含60-100％的nk細胞。

39、在一些實施方案中，本公開提供了包含本公開的細胞群體的藥物組合物。

40、在一些實施方案中，本公開提供了產(chǎn)生造血祖細胞群體的方法，所述方法包括：

41、(a)對干細胞群體進行基因工程化以表達針對非生理學配體的合成細胞因子受體，

42、其中所述細胞因子受體包括：

43、合成的γ鏈多肽，其包含第一二聚化結(jié)構(gòu)域、第一跨膜結(jié)構(gòu)域和白介素-2受體亞單位γ(il-2rg)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，和

44、合成的β鏈多肽，其包含第二二聚化結(jié)構(gòu)域、第二跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；

45、(b)將所述干細胞群體在2d培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)足以形成干細胞聚集體的時間段；

46、(c)將所述干細胞聚集體從所述2d培養(yǎng)系統(tǒng)傳代至3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)；和

47、(d)將所述3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的干細胞聚集體與分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生造血祖細胞的時間段。

48、在一些實施方案中，本公開提供了產(chǎn)生nk細胞群體的方法，所述方法包括：

49、(a)對干細胞群體進行基因工程化以表達針對非生理學配體的合成細胞因子受體，

50、其中所述細胞因子受體包括：

51、合成的γ鏈多肽，其包含第一二聚化結(jié)構(gòu)域、第一跨膜結(jié)構(gòu)域和白介素-2受體亞單位γ(il-2rg)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，和

52、合成的β鏈多肽，其包含第二二聚化結(jié)構(gòu)域、第二跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；

53、(b)將所述干細胞群體在2d培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)足以形成干細胞聚集體的時間段；

54、(c)將所述干細胞聚集體從所述2d培養(yǎng)系統(tǒng)傳代至3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)；

55、(d)將所述3d懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的干細胞聚集體與第一分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生造血祖細胞的時間段；和

56、(e)將所述造血祖細胞群體與第二分化培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生所述nk細胞群體的時間段。

57、在一些實施方案中，所述合成β鏈多肽的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域選自白介素-2受體亞單位β(il-2rb)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、白介素-7受體亞單位β(il-7rb)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或白介素-21受體亞單位β(il-21rb)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

58、在一些實施方案中，通過同源定向修復(hdr)插入核苷酸序列。

59、在一些實施方案中，所述載體包含核酸，所述核酸從5'到3'包含(a)與位于靶位點上游的區(qū)域同源的核苷酸序列，(b)編碼針對非生理學配體的合成細胞因子受體的核苷酸序列，和(c)與位于下游的區(qū)域同源的核苷酸序列，其中雙鏈斷裂發(fā)生在內(nèi)源性基因的靶位點，并且所述核酸與所述內(nèi)源性基因的同源核苷酸序列交換。

60、在一些實施方案中，所述核苷酸序列通過非同源末端連接(nhej)插入。

61、在一些實施方案中，用rna引導的核酸內(nèi)切酶對細胞進行工程化。在一些實施方案中，所述rna引導的核酸內(nèi)切酶選自cas核酸內(nèi)切酶、mad核酸內(nèi)切酶和cpf1核酸內(nèi)切酶。在一些實施方案中，所述rna引導的核酸內(nèi)切酶是cas9或mad7。

62、在一些實施方案中，所述方法包括破壞靶基因并將核苷酸序列插入破壞的靶基因中，其中破壞靶基因包括將干細胞群體與(i)靶向靶基因中靶位點的grna和(ii)rna引導的核酸內(nèi)切酶接觸。在一些實施方案中，靶基因選自b2m、trac和sirpa。

63、在一些實施方案中，所述干細胞群體被工程化為對雷帕霉素具有抗性。在一些實施方案中，工程化干細胞群體使其對雷帕霉素具有抗性包括敲除fkbp12基因。

64、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和任選的rock抑制劑。在一些實施方案中，所述bmp途徑激活劑是bmp4，所述fgf是fgf2，所述vegf是vegf-165，并且所述rock抑制劑是y27632。

65、在一些實施方案中，所述分化培養(yǎng)基包含scf、tpo和ldl。

66、在一些實施方案中，(d)包括將干細胞聚集體的群體與分化培養(yǎng)基接觸1-5天，其中所述分化培養(yǎng)基包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和任選的rock抑制劑。

67、在一些實施方案中，(d)包括(i)將干細胞聚集體與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和rock抑制劑的分化培養(yǎng)基接觸1-5天，以產(chǎn)生擬胚體或中胚層細胞，和(ii)將擬胚體或中胚層細胞與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf、scf、tpo和ldl的分化培養(yǎng)基接觸1-15天。

68、在一些實施方案中，分化培養(yǎng)基包含1-50ng/ml?bmp、1-50ng/ml?fgf、5-100ng/mlvegf、0.1-20μm?rock抑制劑、1-200ng/ml?scf、1-100ng/ml?tpo和1-50μg/ml?ldl或其任意組合。

69、在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和任選的rock抑制劑。

70、在一些實施方案中，(d)包括將干細胞聚集體的群體與第一分化培養(yǎng)基接觸1-5天，其中所述第一分化培養(yǎng)基包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和任選的rock抑制劑。

71、在一些實施方案中，(d)包括(i)將干細胞聚集體與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf和rock抑制劑的培養(yǎng)基接觸1-5天，以產(chǎn)生擬胚體或中胚層細胞，和(ii)將擬胚體或中胚層細胞與包含bmp途徑激活劑、fgf、vegf、scf、tpo和ldl的第一分化培養(yǎng)基接觸1-15天。

72、在一些實施方案中，所述bmp途徑激活劑是bmp4，所述fgf是fgf2，所述vegf是vegf-165，并且所述rock抑制劑是y27632。

73、在一些實施方案中，所述第二分化培養(yǎng)基包含scf、il-7、il-12、il-15、flt3l、嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物和ahr抑制劑。

74、在一些實施方案中，所述第二分化培養(yǎng)基包含1-100ng/ml?scf、1-50ng/ml?il-7、1-100ng/ml?il-12、1-100ng/ml?il-15、1-100ng/ml?flt3l、0.1-10μm嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物、0.1-10μm?ahr拮抗劑及其任意組合。

75、在一些實施方案中，所述嘧啶并-[4,5-b]-吲哚衍生物是um729，并且所述ahr抑制劑是sr1。

76、在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基是無血清的。

77、在一些實施方案中，所述方法是無異種的。

78、在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含相同的基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含不同的基礎培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述第一分化培養(yǎng)基和所述第二分化培養(yǎng)基各自包含基礎培養(yǎng)基，所述基礎培養(yǎng)基包含iscove改良的dulbecco培養(yǎng)基、牛血清白蛋白、重組人胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和2-巰基乙醇。

79、在一些實施方案中，步驟(b)的時間段是2-8天，步驟(c)的時間段是1-5天，步驟(d)的時間段是3-15天，步驟(e)的時間段是11-25天。在一些實施方案中，步驟(a)-(e)在40-50天內(nèi)發(fā)生。

80、在一些實施方案中，所述干細胞是誘導性多能干細胞(ipsc)或人胚胎干細胞(hesc)。

81、在一些實施方案中，所述造血祖細胞群體包含約50％至約100％的cd34+/cd43+/cd45+細胞。

82、在一些實施方案中，所述nk細胞群體包含約60％至約100％的cd43+/cd45+/cd56+/lfa1+細胞。

83、在一些實施方案中，所述方法包括擴增nk細胞群體，其中所述nk細胞群體擴增約1,000至約10,000倍。

84、在一些實施方案中，所述干細胞群體是經(jīng)基因工程化或編輯的。在一些實施方案中，所述nk細胞群體是經(jīng)基因工程化或編輯的。

85、在一些實施方案中，所述干細胞是ipsc。

86、在一些實施方案中，本公開提供了通過本公開的方法產(chǎn)生的細胞群體。在一些實施方案中，本公開提供了包含本公開的細胞群體的藥物組合物。

87、在一些實施方案中，包括向受試者施用有效量的細胞群體或藥物組合物。

88、在一些實施方案中，本公開提供了試劑盒，其包含所述細胞群體和用于將所述細胞群體施用于有此需要的受試者的使用說明。

89、在一些實施方案中，所述受試者患有癌癥。