本發(fā)明涉及基因型鑒別，尤其是涉及一種鑒別日本甜柿基因型的方法及其應用。

背景技術：

1、柿(diospyros?kaki?thunb.，2n＝6x＝90；少數(shù)品種2n＝9x＝135)原產(chǎn)我國，是柿屬植物中作為果樹栽培的代表種，其傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)在中國、韓國和日本等東亞地區(qū)。根據(jù)柿成熟期果實能否自然脫澀及其性狀遺傳特點，柿品種分為甜澀性狀表現(xiàn)質(zhì)量性狀遺傳的完全甜柿(pollination-constant?and?non-astringent,pcna)和數(shù)量性狀遺傳的非完全甜柿(non-pcna)。

2、完全甜柿成熟時可在樹上自然脫澀，不需脫澀處理即可脆食，其質(zhì)地類似于蘋果。非完全甜柿則在成熟后仍需經(jīng)人工脫澀處理后才可鮮食。人工脫澀不僅會增加生產(chǎn)成本，且脫澀后的果實易軟化、運輸不便，脫澀不完全更影響產(chǎn)品的商品性。因此，完全甜柿更受消費者青睞，具有較高的育種價值。完全甜柿可細分為自然脫澀性狀受顯性基因(cpcna)控制的中國原產(chǎn)完全甜柿(簡稱“中國甜柿”或“c-pcna”)和受隱性基因(ast)控制的日本原產(chǎn)完全甜柿(簡稱“日本甜柿”或“j-pcna”)。

3、鑒別日本甜柿的基因型，能為雜交親本的選擇提供參考，而且將基因型用于幼株的胚拯救、嫩枝高接和標記輔助選擇的雜交組合，將大大提高日本甜柿育種的效率，對育成具知識產(chǎn)權的完全甜柿新品種具有重要意義。

4、目前，在實際應用中，日本甜柿自然脫澀基因的數(shù)量鑒別，依賴于sybr?green?i熒光染料能與雙鏈dna非特異性結合，結合后發(fā)出熒光，可以通過檢測反應體系中sybr?greeni的熒光強度，達到檢測qpcr產(chǎn)物擴增量的目的，但在實際應用中，引物存在非特異性結合，qpcr反應中非特異性擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)會增加熒光值，進而影響定量結果的準確性，使不同標準曲線得出的結果存在一定差距，對于部分材料沒辦法得出完全準確的結果；此外，這種方法必須利用三條參考基因的標準曲線才能確定待測材料的基因型，試劑、材料耗費較大；原程序需要經(jīng)過完整的pcr反應結合雙鏈后檢測熒光信號，時間耗費較長，資金和時間成本均較高。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種鑒別日本甜柿基因型的方法及其應用，以解決目前日本甜柿基因型鑒別方法具有偏好性，對于部分柿材料的檢測結果穩(wěn)定性差、可靠性低，且耗時長、工作量大的問題，提供一種新的、高效的鑒別方法，為選育以日本甜柿為親本的雜交后代提供準確的基因型參考。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒定日本甜柿基因型的方法，包括以下步驟：

3、s1、提取日本甜柿標準樣品的基因組dna，根據(jù)日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間、參考基因設計特異性引物和taqman特異探針，將特異性引物和taqman特異探針送公司合成；

4、s2、將獲得的日本甜柿標準樣品的基因組dna倍比稀釋成不同的濃度，然后分別與日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間、參考基因特異性引物和taqman特異探針混合進行實時熒光定量pcr反應，得到不同dna濃度下的ct值；

5、s3、利用得到的日本甜柿標準樣品不同dna濃度、不同特異性引物和taqman特異探針下的ct值，建立標準曲線；

6、s4、提取待測柿材料的基因組dna，并稀釋成確定濃度，分別與日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間、參考基因特異性引物和taqman特異探針混合后進行實時熒光定量pcr反應，獲得不同特異性引物和taqman特異探針下的ct值，將獲得的ct值分別代入s3建立的標準曲線中，即可計算得到待測柿材料的基因型。

7、優(yōu)選的，所述s1中日本甜柿標準樣品為‘太秋’，參考基因為dkact、l5r；日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間特異性引物的上游引物序列如seq?id?no.1所示，下游引物序列如seq?id?no.2所示，taqman特異探針的序列如seq?id?no.3所示。

8、優(yōu)選的，所述s1中dkact基因的特異性引物的上游引物序列如seq?id?no.4所示，下游引物序列如seq?id?no.5所示，taqman特異探針序列如seq?id?no.6所示；l5r基因的特異性引物的上游序列如seq?id?no.7所示，下游引物序列如seq?id?no.8所示，taqman特異探針序列如seq?id?no.9所示。

9、優(yōu)選的，所述s2中基因組dna倍比稀釋成不同的濃度指：最大濃度為120ng·μl-1，依次進行兩倍稀釋，共設置八個dna濃度梯度；s3中建立的標準曲線包括日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間和參考基因的標準曲線。

10、優(yōu)選的，所述s4中計算待測柿材料基因型，采用以下公式進行：

11、ast相對等位基因劑量＝ast的相對dna用量/參考基因的相對dna用量×6；

12、式中，ast的相對dna用量為：將待測柿材料利用日本甜柿自然脫澀位點ast特異性引物、taqman特異探針，進行實時熒光定量pcr得到的ct值，代入日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間標準曲線計算得到的數(shù)值；

13、參考基因的相對dna用量為：將待測柿材料利用參考基因特異引物與taqman特異探針，進行實時熒光定量pcr得到的ct值，代入?yún)⒖蓟驑藴是€計算得到的數(shù)值。

14、優(yōu)選的，當ast相對等位基因劑量小于0.5時，待測柿材料的基因型為aaaaaa；當ast相對等位基因劑量大于等于0.5小于1.5時，待測柿材料的基因型為aaaaaa；當ast相對等位基因劑量大于等于1.5小于2.5時，待測柿材料的基因型為aaaaaa；當ast相對等位基因劑量大于等于2.5小于3.5時，待測柿材料的基因型為aaaaaa；依此類推，當ast相對等位基因劑量大于等于5.5小于6.5時，待測柿材料的基因型為aaaaaa。

15、優(yōu)選的，所述s4中待測柿材料基因組dna的濃度為60ng·μl-1，日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間、參考基因特異性引物和taqman特異探針的濃度與s2中的濃度相同。

16、優(yōu)選的，所述s2和s4中進行實時熒光定量pcr的體系為：5μl?probe?qpcr?mixmultiplus、0.1μl的rox?reference?dyeⅱfor?rr393、10μm/l的上游引物和下游引物各0.2μl、0.1μm/lprobe?0.25μl、基因組dna模板1μl，ddh2o補至10μl。

17、優(yōu)選的，所述s2和s4中先將基因組dna于95℃變性10min，再與日本甜柿自然脫澀位點ast區(qū)間、參考基因特異性引物和taqman特異探針混合，進行實時熒光定量pcr的程序為：25℃2min，95℃預變性20s為第一步，一個循環(huán)；95℃1s，60℃20s，為第二步，40個循環(huán)，第二步中每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測。

18、一種如上所述的鑒別日本甜柿基因型的方法在日本甜柿基因型鑒別中的應用。

19、因此，本發(fā)明提供的一種鑒別日本甜柿基因型的方法及其應用，其具體技術效果如下：

20、(1)本發(fā)明提供的鑒別日本甜柿基因型的方法，通過探針與目標分子之間發(fā)生特異性的水解反應方可生成熒光信號，誤差更小，鑒別結果更準確，結果穩(wěn)定性更高；

21、(2)本發(fā)明提供的鑒別日本甜柿基因型的方法，只需要兩個參考基因組，鑒定易操作，可以大幅降低日本甜柿基因型鑒別的工作量，試劑耗材等的消耗更少，鑒別成本更低；

22、(3)本發(fā)明提供的鑒別日本甜柿基因型的方法，可以大幅縮短鑒別所需時間，提高鑒別效率，對日本甜柿種質(zhì)資源及雜交后代的基因型鑒定具有重要意義，可以為甜柿品種改良和育種提供有力的技術支持。

23、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。