本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)，涉及一種明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法及產(chǎn)品。

背景技術：

1、干細胞作為生物工程領域中組織修復的新工具，在各種疾病模型研究中具有眾多進展。但是對于腦出血，顱骨缺損，脊髓損傷等局部大量正常組織缺失的疾病，液體懸浮狀態(tài)的細胞不易停留于病灶部位并持續(xù)發(fā)揮作用，因此3d細胞培養(yǎng)技術的興起旨在解決該問題。而且3d細胞培養(yǎng)在細胞衍生的上清，細胞外囊泡及外泌體制備上也具有良好的應用。

2、目前已知的3d細胞培養(yǎng)方案眾多，其中純細胞類型的干細胞球體，細胞量大，隨著球體增大，位于球體中心部位的細胞由于缺少營養(yǎng)物質(zhì)交換容易壞死，并且在工藝上不便于控制細胞大小。另一種采用干細胞微載體技術，通過生物微載體與細胞結(jié)合，形成3d微球，該方法穩(wěn)定性好，細胞之間存在間隙，有營養(yǎng)物質(zhì)交換的通道，細胞活率高。該方案已經(jīng)成功商用，但是其專用的微載體成本高，不利于細胞的提取與大批量制備3d微球。

3、明膠海綿其主要成分為明膠，呈白色或微黃色、質(zhì)輕軟而多孔的海綿狀物，主要用于止血，在外科手術尤其是大腦以及脊髓的手術中廣泛應用。明膠海綿顆粒由于其膨脹特性，目前被主要應用于介入手術，起到栓塞血管的作用。目前已有明膠海綿種植各類型間充質(zhì)干細胞，以研究其生物相容性及應用，但該方法獲得的海綿深層細胞少，而海綿表面細胞過于密集，明膠海綿上細胞不均勻的特性導致細胞活性降低。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明屬于干細胞微載體的技術，采用成本低廉并具有良好生物材料的明膠海綿顆粒作為微載體，并與嗅黏膜間充質(zhì)干細胞結(jié)合，制備成3d細胞微球。細胞與明膠海綿可以相互交聯(lián)，密度均一，可以更好的維持干細胞活性。該制備方法原料來源廣泛，成本低，工藝流程簡單，制備的3d微球具有通透性高，細胞毒性低以及良好的生物相容性特點。并且該3d微球在制備后用于細胞外囊泡及外泌體等衍生物的提取具有廣泛前景。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、一種明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，包括以下步驟：

4、①稱取明膠海綿顆粒，與培養(yǎng)基混合均勻，并接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于萬向搖床上于濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、利用搖床的溫和晃動，使明膠海綿顆粒與周圍的培養(yǎng)基充分接觸，更利于后續(xù)細胞的接種以及細胞在其表面和孔隙內(nèi)均勻分布。

6、②收集om-msc單細胞懸液，調(diào)整細胞懸液密度；

7、調(diào)整細胞懸液密度至合適范圍(如本發(fā)明中特定的密度值)，是為了確保在接種到含有明膠海綿顆粒的培養(yǎng)瓶后，細胞與載體之間能形成合理的結(jié)合比例，既不會因細胞數(shù)量過少導致微球內(nèi)細胞稀疏影響其功能發(fā)揮，也不會因細胞過多造成局部營養(yǎng)競爭過于激烈而影響細胞活性，從而保障制得的3d微球內(nèi)細胞分布均勻且活性良好。

8、③將細胞接種于步驟①含有明膠海綿顆粒的培養(yǎng)瓶中；

9、此步驟是將經(jīng)過處理、密度調(diào)整好的嗅黏膜間充質(zhì)干細胞接種到已預處理的明膠海綿顆粒上，使得細胞能夠附著在明膠海綿顆粒的表面以及孔隙之中，利用明膠海綿顆粒多孔、疏松的結(jié)構(gòu)特點，為細胞提供物理支撐以及與外界進行營養(yǎng)物質(zhì)交換的通道，開啟細胞在特定載體上生長并逐步形成3d微球的過程，是整個制備流程的關鍵銜接步驟，直接關系到后續(xù)3d微球能否成功構(gòu)建以及細胞能否在其中良好生長。

10、④每天向培養(yǎng)瓶中添加5～10ml培養(yǎng)基，在萬向搖床上連續(xù)培養(yǎng)。

11、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基由dmem/f12培養(yǎng)基和10v/v％胎牛血清組成。該培養(yǎng)基配方能夠為嗅黏膜間充質(zhì)干細胞提供全面且適宜的營養(yǎng)成分，包括各種氨基酸、維生素、無機鹽以及生長因子等，滿足細胞在體外培養(yǎng)過程中的生長、增殖和代謝需求。

12、優(yōu)選的，所述明膠海綿顆粒粒徑為700～1000μm。該粒徑范圍的選擇是綜合考慮了細胞的附著、營養(yǎng)物質(zhì)交換以及后續(xù)3d微球的整體大小和性能等因素，此粒徑大小的顆粒具有合適的孔隙結(jié)構(gòu)和比表面積，利于細胞的均勻分布以及與外界環(huán)境的物質(zhì)交換。

13、優(yōu)選的，步驟①所述搖床轉(zhuǎn)速為40rpm勻速旋轉(zhuǎn)，持續(xù)12小時。該轉(zhuǎn)速和時間設置能夠在初始培養(yǎng)階段為明膠海綿顆粒與細胞的結(jié)合以及細胞在其表面的初步附著提供適度的動態(tài)環(huán)境，既不會因轉(zhuǎn)速過快破壞細胞或載體結(jié)構(gòu)，也不會因轉(zhuǎn)速過慢導致混合不充分、細胞附著不均勻等問題，12小時的持續(xù)時間則是經(jīng)過多次實驗驗證，能夠使細胞較好地完成初始的附著過程，為后續(xù)連續(xù)培養(yǎng)奠定良好基礎。

14、優(yōu)選的，所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，包括以下步驟：

15、①稱取明膠海綿顆粒30mg，與30ml培養(yǎng)基混合均勻，并接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)速40rpm搖床上，于濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時；

16、②對提取的om-msc用胰酶消化，以1000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上清，收集沉淀并分離成單細胞懸液，調(diào)整細胞懸液的細胞密度為4×107/ml；

17、③將細胞接種于步驟①含有明膠海綿顆粒的培養(yǎng)瓶中；

18、④每天向錐形瓶中添加5～10ml培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)7天。

19、優(yōu)選的，步驟④中萬向搖床的參數(shù)設置為第一天采用30rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘和停轉(zhuǎn)25分鐘，循環(huán)24小時；第2天后，予以40rpm勻速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。第一天采用間歇性低速旋轉(zhuǎn)模式既能給予細胞一定的動態(tài)刺激，促進其更好地附著和適應新環(huán)境，又能避免因持續(xù)的機械力作用導致細胞脫落或受損。經(jīng)過第一天的適應后，從第2天開始采用40rpm勻速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，此時細胞已相對穩(wěn)定附著，勻速旋轉(zhuǎn)可以更有效地維持細胞所處環(huán)境的均勻性，保障細胞持續(xù)穩(wěn)定地生長、增殖以及細胞間相互作用，促進3d微球在這7天的培養(yǎng)過程中逐步發(fā)育成熟，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細胞活性良好的3d微球，使其具備更好的應用潛力。

20、進一步的，本發(fā)明涉及由所述的方法制得的3d細胞微球。

21、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

22、本發(fā)明制作了一種含干細胞的3d微球，結(jié)合了om-mscs的治療潛力和明膠海綿顆粒的支架功能。與現(xiàn)有的技術相比，該制備方法原料來源廣泛，成本低，工藝流程簡單，制備的3d微球具有通透性高，細胞毒性低以及良好的生物相容性特點。該方法相比于傳統(tǒng)直接在明膠海綿上種植細胞，更能維持細胞活力。3d微球在制備后用于細胞外囊泡及外泌體等衍生物的提取具有廣泛前景。在實際應用中，這種細胞載體系統(tǒng)可能需要根據(jù)特定的臨床需求進行定制和優(yōu)化。

技術特征：

1.一種明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基由dmem/f12培養(yǎng)基和10v/v％胎牛血清組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，所述明膠海綿顆粒粒徑為700～1000μm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，步驟①所述搖床轉(zhuǎn)速為40rpm勻速旋轉(zhuǎn)，持續(xù)12小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3d微球的方法，其特征在于，步驟④中萬向搖床的參數(shù)設置為第一天采用30rpm轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘和停轉(zhuǎn)25分鐘，循環(huán)24小時；第2天后，予以40rpm勻速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

7.權(quán)利要求1～6任一項所述的方法制得的3d細胞微球。

技術總結(jié)
本發(fā)明公開了一種明膠海綿顆粒結(jié)合嗅黏膜間充質(zhì)干細胞制備3D微球的方法及產(chǎn)品，屬于生物組織工程技術領域。本發(fā)明通過明膠海綿顆粒與嗅黏膜間充質(zhì)干細胞混合，并將其接種到3D懸浮搖床中，材料與細胞通過細胞外基質(zhì)及電化學吸附力作用形成3D明膠海綿細胞微球。制備的細胞化生物材料，具有通透性高，細胞毒性低以及良好的生物相容性特點，并且其制備原料來源廣泛，成本低，工藝流程簡單，在制備用于細胞培養(yǎng)、細胞外囊泡及外泌體提取等應用具有廣泛前景。

技術研發(fā)人員：盧明,李文水,盧碩
受保護的技術使用者：盧明
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/8