本發(fā)明屬于基因工程，尤其是涉及一種響應upr信號的生物傳感器報告系統(tǒng)及其構建方法與應用。

背景技術：

1、植物在其整個生命周期中要面對各種不利外界因素的威脅，為了應對各種脅迫，植物發(fā)展出了不同的防御機制來應對這些壓力。內質網(endoplasmic?reticulum，er)是高等生物中一種重要的膜性細胞器，主要被認為是蛋白質合成和折疊的場所。許多因素如病原體、鹽堿和干旱等環(huán)境脅迫，導致內質網處理蛋白的負荷增加[1,2]，從而積累了錯誤折疊或未折疊的蛋白質，導致內質網穩(wěn)態(tài)失衡，稱為內質網應激(er?stress)[3-5]。包括植物在內的高等生物已經發(fā)展出了許多策略來應對內質網應激，其中，upr(unfolded?proteinresponse)信號途徑在此過程中發(fā)揮著重要作用[6]。

2、經典的植物upr信號通路主要有兩個分支。以模式植物擬南芥為例，第一個分支由ire1介導的對其靶標基因bzip60u等的特異性剪切，通過刪除其mrna中的23個堿基從而翻譯成一個可以進入細胞核的bzip60s，并誘導下游upr響應基因的轉錄和表達。第二個分支由兩個內質網膜定位的轉錄因子bzip17和bzip28介導，通過蛋白酶s1p和s2p在蛋白水平切除包含跨膜域的碳端，從而形成能夠進入細胞核的bzip17p和bzip28p，并誘導下游upr響應基因的轉錄和表達[7]。

3、中國專利cn110938650b公開了一種mrna可變剪切-熒光素酶報告系統(tǒng)及其應用，所述的可變剪切-熒光素酶報告系統(tǒng)，包含番茄rlpk基因的可變剪切區(qū)域序列和熒光素酶報告基因luc序列。該方案利用農桿菌介導的瞬時過表達技術，在該轉基因煙草葉片上表達外源基因；或者利用農桿菌介導的基因沉默技術，在該轉基因煙草葉片上沉默煙草的內源基因，通過檢測熒光素酶活性的變化來判斷待測基因編碼蛋白是否參與植物mrna的可變剪切過程。該方案針對的是番茄rlpk基因，沒有涉及基因bzip60u。

4、中國專利cn114045304b公開了一種基于crispr/cas9體系編輯本氏煙基因的載體及構建方法和應用，所述本氏煙基因為nbbzip60基因，針對本氏煙nbbzip60基因編碼區(qū)序列靠近5’端的pam位點設計特異性靶向nbbzip60的grna，構建pcambia1300-bkg-g1載體。將載體通過遺傳轉化的方法導入到本氏煙，獲得的編輯后代生長狀態(tài)正常，與野生型本氏煙相比沒有明顯的發(fā)育缺陷，獲得基因敲除的植物能夠有效抑制雙生病毒的侵染。該方案雖然公開了bzip60u基因，但是該方案只是介紹了一種基于crispr/cas9體系編輯本氏煙基因的載體及構建方法和應用。通過設計針對tylccnv/tylccnb研究的模式植物本氏煙的感病基因nbbzip60的grna，構建了利用編輯上述內源基因實現(xiàn)阻礙雙生病毒侵染的農桿菌侵染性克隆載體。bzip60u基因在該申請中只是待編輯的一種基因，該方案中并沒有涉及bzip60u基因作為upr信號轉導的關鍵基因的內容。

5、[1]bao?y,howell?s?h.the?unfolded?protein?response?supports?plantdevelopment?and?defense?as?well?as?responses?to?abiotic?stress[j].frontiersin?plant?science,2017,8:344.

6、[2]nawkar?g?m,lee?e?s,shelake?r?m,et?al.activation?of?the?transducersof?unfolded?protein?response?in?plants[j].frontiers?in?plant?science,2018,9:214.

7、[3]merksamer?p?i,trusina?a,papa?f?r.real-time?redox?measurementsduring?endoplasmic?reticulum?stress?reveal?interlinked?protein?foldingfunctions[j].cell,2008,135(5):933-947.

8、[4]merksamer?p?i,papa?f?r.the?upr?and?cell?fate?at?a?glance[j].journal?of?cell?science,2010,123(7):1003-1006.

9、[5]qi?z,chen?l.endoplasmic?reticulum?stress?and?autophagy[j].autophagy:biology?and?diseases:basic?science,2019:167-177.

10、[6]manghwar?h,li?j.endoplasmic?reticulum?stress?and?unfolded?proteinresponse?signaling?in?plants[j].international?journal?of?molecular?sciences,2022,23(2):828.

11、[7]liu?y,lv?y,wei?a,et?al.unfolded?protein?response?in?balancingplant?growth?and?stress?tolerance[j].frontiers?in?plant?science,2022,13:1019414.

技術實現(xiàn)思路

1、為提供一種融合基因來構建生物傳感器，以更好的研究upr信號通路的目的，本發(fā)明提供一種響應upr信號的生物傳感器報告系統(tǒng)及其構建方法與應用。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)：

3、在本發(fā)明的第一方面，提供一種融合基因，其為bzip60u基因(un-spliced?formof?bzip60)與熒光素酶基因luciferase的融合基因，命名為bzip60u-luc。

4、其中，所述bzip60u基因選自atbzip60u(基因id為at1g42990)或nbbzip60u

5、(基因id為niben101scf24096g00018.1)，此時，bzip60u-luc選自atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc，其中，基因atbzip60u-luc的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，基因nbbzip60u-luc的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

6、更具體地，融合基因bzip60u-luc中，所述atbzip60u或nbbzip60u基因的3’端與luciferase基因相連。

7、在本發(fā)明的第二方面，提供一種融合蛋白，為bzip60u基因的23個核苷酸序列ctgtgctcttgttggaatccctg被剪切后，bzip60u基因與熒光素酶基因luciferase重新融合表達出的融合蛋白，為atbzip60s-luc蛋白或nbbzip60s-luc蛋白，所述atbzip60s-luc蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，所述nbbzip60s-luc蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。而當bzip60u基因的23個核苷酸序列ctgtgctcttgttggaatccctg未被剪切時，bzip60u基因的表達發(fā)生提前終止，所以，此時基因atbzip60u表達的蛋白atbzip60u的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；此時基因nbbzip60u表達的蛋白nbbzip60u的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

8、其中，atbzip60u-luc蛋白是由基因atbzip60u-luc編輯的。nbbzip60u-luc蛋白是由基因nbbzip60u-luc編輯的。

9、在本發(fā)明的第三方面，提供一種包含所述融合基因atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc的重組載體。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述的融合基因表達載體為雙元農桿菌載體，所述雙元農桿菌載體為pcambia1300(該載體具有35s強啟動子，其中，強啟動子35s序列如seqid?no.7所示，多克隆位點，卡那霉素序列，潮霉素序列等重要結構及序列，如圖5所示)。

11、在本發(fā)明的第四方面，提供包含所述融合基因atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc的重組載體的構建方法，包括以下步驟：

12、(1)、設計并合成引物，通過pcr獲得核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示的基因片段；

13、(2)、將核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示的基因片段通過重組法構建到含有強啟動子35s(cauliflower?mosaic?virus(camv)35s?promoter，序列見seq?idno.7)的雙元表達載體pcambia1300中，利用所述載體上的篩選抗性獲得陽性克隆，得到重組表達載體。

14、在本發(fā)明的第五方面，提供包含所述融合基因atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc的轉化體，所述轉化體為將包含所述融合基因atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc的重組載體轉入gv3101農桿菌(該農桿菌是一種商業(yè)化菌株，攜帶一種無自身轉運功能的胭脂堿型ti質粒pmp90(ptic58dt-dna)，此質粒含有vir基因(vir基因是t-dna插入植物基因組必需的元件))中獲得的轉化體。

15、本發(fā)明提供的包含所述融合基因atbzip60u-luc或nbbzip60u-luc的轉化體的獲得方法為農桿菌介導轉化法，所得轉化體可以用于侵染擬南芥和煙草組織。

16、本發(fā)明的第六方面，提供一種響應upr(unfolded?protein?response)信號轉導的生物傳感器報告系統(tǒng)，所述響應upr信號轉導的生物傳感器報告系統(tǒng)為包含所述融合基因atbzip60u-luc的轉化體。

17、所述包含所述融合基因atbzip60u-luc的轉化體在擬南芥中表達，能夠得到穩(wěn)定遺傳材料。

18、本發(fā)明的第六方面，提供一種響應upr信號轉導的生物傳感器報告系統(tǒng)，所述響應upr信號轉導的生物傳感器報告系統(tǒng)為包含所述融合基因nbbzip60u-luc的轉化體。

19、包含所述融合基因nbbzip60u-luc的轉化體在本氏煙草注射進行瞬時表達，通過熱激、化學試劑或者內源蛋白進行誘導，展現(xiàn)生物傳感器功能。

20、本發(fā)明的第七方面，提供將nbbzip60u-luc基因在本氏煙草體內表達，構建穩(wěn)定遺傳材料的方法，具體包括：

21、(1)設計并合成引物，通過pcr獲得核苷酸序列如seq?id?no.2所示的基因片段；

22、(2)將所述的基因片段通過重組法構建到含有強啟動子35s的雙元表達載體pcambia1300中，利用所述載體上的篩選抗性獲得陽性克隆，得到重組表達載體；

23、(3)將所述的重組表達載體轉入gv3101農桿菌中，利用表達載體及所述農桿菌自身抗性篩選得到可以用于侵染煙草組織的陽性農桿菌菌株；

24、(4)將所述陽性農桿菌菌株侵染本氏煙草愈傷組織，在潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得陽性轉基因愈傷組織；

25、(5)將所述陽性愈傷組織進行分化、生根、移栽培養(yǎng)獲得t0代轉基因植株；

26、(6)通過熒光檢測以及煙草栽培方法獲得nbbzip60u-luc報告系統(tǒng)的t1代植株。

27、在本發(fā)明的一個實施方式中，步驟(4)中，將所述陽性農桿菌菌株侵染本氏煙草愈傷組織的方法為：將所述陽性農桿菌菌株利用含有利福平(rifampicin，終濃度0.025mg/ml)慶大霉素(gentamicin，終濃度0.04mg/ml)和卡那霉素(kanamycin，終濃度0.05mg/ml)的液體培養(yǎng)基進行搖菌，然后收集菌液，用煙草轉化液(終濃度為10mm的mgcl2和終濃度10mm的mes(2-morpholinoethanesulphonic?acid)[通過koh調整到ph5.7]混合液)重旋，通過注射的方式將農桿菌打入煙草葉片，此時得到的是煙草表達體系。經過48小時培養(yǎng)，對注射農桿菌的煙草進行處理，然后觀察luc表達情況。

28、而通過熒光檢測以及煙草栽培方法獲得nbbzip60u-luc報告系統(tǒng)的t1代植株為一種煙草轉基因體系。

29、通過注射含有nbbzip60u-luc農桿菌至本氏煙草和構建能夠穩(wěn)定遺傳的nbbzip60u-luc轉基因煙草，實現(xiàn)相關的科學實驗。

30、本發(fā)明的第七方面，提供所述生物傳感器報告系統(tǒng)在擬南芥和煙草中的應用，用于探究upr信號轉導。

31、本發(fā)明涉及煙草基因nbbzip60(基因號為niben101scf24096g00018.1)在響應內質網非折疊蛋白(unfolded?protein)信號轉導中的應用。通過將煙草基因nbbzip60u(un-spliced?form?of?nbbzip60)與熒光素酶基因luciferase融合，構建命名為nbbzip60u-luc的融合報告基因。

32、本發(fā)明提供的bzip60u-luc基因特征功能如下：

33、bzip60是upr信號中重要的轉錄因子，它能夠響應er?stress。當er?stress來臨時bzip60u的mrna通過ire1剪接形成bzip60s形式，進而形成有活性的bzip60轉錄因子，入核后發(fā)揮功能，調節(jié)相關基因表達，從而應對er?stress。這一upr響應機制在高等生物中是高度保守的，本技術利用這一特點在擬南芥和煙草中進行實驗。構建的nbbzip60u-luc融合基因正是利用bzip60發(fā)生剪接的性質，來實現(xiàn)生物傳感器的建立。

34、利用upr(unfolded?protein?response)響應中的ire1(inositol-requiringenzyme?1)在內質網脅迫后移除nbbzip60u的mrna的23個核苷酸序列(ctgtgctcttgttggaatccctg)并產生新的開放閱讀框的nbbzip60s(spliced?form?ofnbbzip60)的特點，使luciferase的熒光能夠在誘導條件(例如熱激)下被檢測到，與未誘導時產生顯著差異，從而實現(xiàn)nbbzip60u-luc生物傳感器報告系統(tǒng)的建立，能夠更準確地探究內源upr信號轉導，為科研工作者和生產應用提供新的技術及材料支持。

35、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

36、基于upr信號通路中bzip60特殊的剪接方式及其在不同物種中的高度保守性，將這一特點應用到本技術中，構建bzip60u-luc的融合基因，從而實現(xiàn)bzip60u-luc生物傳感器報告系統(tǒng)的建立，能夠更準確地探究內源upr信號轉導，為科研工作和生產應用提供新的技術與材料支持。

37、擬南芥是植物基因工程研究中的模式生物，是植物遺傳研究的重要材料，對基礎科研做出了杰出貢獻。本氏煙草(nicotiana?benthamiana)是植物病毒學中應用最廣泛的實驗寄主，本氏煙草易受多種其他植物病原體(如細菌、真菌等)的影響。本氏煙草可以高效地進行遺傳轉化和再生，并且適用于瞬時蛋白表達，在植物生物學研究中迅速受到歡迎，特別是在需要蛋白質定位、蛋白相互作用以及基于植物的蛋白質表達和純化系統(tǒng)研究方面(goodin?m?m,zaitlin?d,naidu?r?a,et?al.nicotiana?benthamiana:its?history?andfuture?as?amodel?for?plant–pathogen?interactions[j].molecular?plant-microbeinteractions,2008,21(8):1015-1026.)。所以，本技術在這兩種高效的模式生物中進行驗證，以解決某些非模式物種中探究upr信號途徑的難題，為農業(yè)生產應用提供一類高效的生物傳感器系統(tǒng)。

38、本發(fā)明通過將upr信號途徑中的相關基因bzip60u與熒光素酶基因luciferase融合，使融合基因nbbzip60u-luc在本氏煙草中過表達，得到轉基因煙草，利用植物受到內質網脅迫后bzip60u被剪切的特性，通過熒光素酶luciferase產生可視化的熒光效果，提供一種檢測upr信號轉導途徑的方法，從而能夠更深入、便捷地探究upr信號轉導途徑。