本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種特異性靶向c-met的單域抗體及其在腫瘤的靶向治療與成像中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、c-met，也稱為酪氨酸蛋白激酶met或肝細(xì)胞生長因子受體(hgfr)，是人類中由met基因編碼的蛋白，具有酪氨酸激酶活性。初級單鏈前體蛋白在翻譯后被切割以產(chǎn)生α和β亞基，其被二硫鍵連接以形成成熟受體。癌癥中的異常met活化與預(yù)后差相關(guān)，其中異?；钴S的met引發(fā)腫瘤生長，形成新的血管為腫瘤提供營養(yǎng)物并有助于癌癥轉(zhuǎn)移。met在許多惡性腫瘤中失調(diào)，包括腎癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和腦癌。通常情況下，僅干細(xì)胞和祖細(xì)胞中表達(dá)met，允許這些細(xì)胞生長，在胚胎中產(chǎn)生新的組織或在成人中再生受損組織。然而，癌癥干細(xì)胞被認(rèn)為劫持了正常干細(xì)胞來表達(dá)met，因此成為癌癥持續(xù)存在并轉(zhuǎn)移的原因。無論是met/hgfr的過表達(dá)，還是其肝細(xì)胞生長因子配體的共同表達(dá)，都與腫瘤發(fā)生有關(guān)。

2、met基因位于人類7號染色體長臂(7q21-31)，長度約125kb，同時(shí)含有21個(gè)外顯子。c-met是met基因編碼產(chǎn)生的具有自主磷酸化活性的跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體(receptor?tyrosine?kinases，rtks)超家族，由膜外sema域、psi域、ipt域和膜內(nèi)jm域、催化tk域、c末端組成，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞。hgf是目前發(fā)現(xiàn)的c-met的唯一配體，屬于纖維蛋白溶酶原家族，由n末端、kringle域、c末端組成，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，亦可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而通過自分泌機(jī)制發(fā)揮作用。hgf與c-met的sema域結(jié)合使c-met發(fā)生二聚、酪氨酸磷酸化，激活眾多下游信號通路，如pi3k-akt、ras-mapk、stat和wnt/β-catenin等，從而發(fā)揮其促細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移、侵襲血管及血管生成等效應(yīng)，在組織正常發(fā)育和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。c-met通路正常表達(dá)時(shí)促進(jìn)組織的分化與修復(fù)，當(dāng)調(diào)節(jié)異常時(shí)則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。c-met通路異常激活主要包括met14外顯子跳躍突變、met擴(kuò)增和met蛋白過表達(dá)3種類型。

3、c-met的細(xì)胞外部分包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)n端sema結(jié)構(gòu)域、一個(gè)富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和四個(gè)ipt結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)部分包括酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域、膜旁結(jié)構(gòu)域和羧基末端序列。hgf包含兩個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)：一個(gè)對c-met的ipt3和ipt4結(jié)構(gòu)域具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)對sema結(jié)構(gòu)域具有低親和力的結(jié)合位點(diǎn)。

4、c-met被認(rèn)為是繼表皮生長因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，egfr)基因突變和間變性淋巴瘤激酶(anaplastic?lymphoma?kinase，alk)基因融合之后，非小細(xì)胞肺癌(non-small?cell?lung?cancer，nsclc)又一個(gè)重要的驅(qū)動基因。met的激活包括突變、擴(kuò)增和蛋白質(zhì)過表達(dá)，是nsclc潛在的治療靶點(diǎn)，并提示與預(yù)后相關(guān)。臨床證據(jù)表明，met既可以作為肺癌的原發(fā)致癌驅(qū)動基因，也是egfr靶向治療獲得性耐藥的原因之一。

5、在正常生理?xiàng)l件下，hgf/c-met在胚胎發(fā)生、組織再生、傷口愈合以及神經(jīng)和肌肉的形成中起作用，由腫瘤抑制因子p53介導(dǎo)。越來越多的證據(jù)表明，hgf/c-met調(diào)控異常和c-met基因突變、擴(kuò)增和過表達(dá)導(dǎo)致了大量人類疾病，尤其是癌癥。目前已在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胃癌以及其他癌癥等多種惡性腫瘤中觀察到c-met失調(diào)。c-met的過表達(dá)或突變導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異?；钴S，促進(jìn)腫瘤生長、血管生成和癌癥轉(zhuǎn)移。c-met/hgf軸在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，因此是一個(gè)引人關(guān)注的治療靶點(diǎn)。

6、目前有超過40種c-met靶向藥物正處于臨床試驗(yàn)階段。其中，雙特異性抗體(bsab)、抗體藥物偶聯(lián)物(adc)以及car-t細(xì)胞和小分子等方法在晚期臨床試驗(yàn)階段和臨床前研究中顯示出突出的結(jié)果。單域抗體是保留抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小單元，具備高抗原親和力、高特異性、高溶解性、高穩(wěn)定性、高清除率、低免疫原性、且能通過微生物實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)等優(yōu)勢。研究人員通過篩選出高親和力的抗c-met單域抗體為抗體研究提供了新的突破口。相比傳統(tǒng)的單克隆抗體藥物，單域抗體在腫瘤成像領(lǐng)域具備先天的優(yōu)勢，單域抗體的半衰期短，非常適用于分子顯影，可作為腫瘤發(fā)現(xiàn)的新方法，作為藥物治療，由于其半衰期短的屬性，可能會導(dǎo)致其過早的被系統(tǒng)代謝，可以將c-met為靶點(diǎn)的單體(15kda)和sdab-fc作為靶點(diǎn)構(gòu)建雙特異性抗體。

7、核醫(yī)學(xué)具有分子影像的先天優(yōu)勢，對特定探針進(jìn)行放射性核素標(biāo)記后，用單光子計(jì)算機(jī)斷層掃描(spect)或正電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(pet/ct)能夠檢測特定靶標(biāo)分子的活體分布。免疫pet顯像(immunopet)是近年來新興發(fā)展起來的特異性活體顯像方法，結(jié)合正電子發(fā)射斷層掃描(pet/ct)的高靈敏度和單克隆抗體的特異性，能夠無創(chuàng)地對靶向標(biāo)志物的表達(dá)及活體生物分布進(jìn)行活體評價(jià)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種特異性靶向c-met的單域抗體及其在腫瘤的靶向治療與成像中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種單域抗體(抗c-met單域抗體)，名稱為pfh-cm01，所述單域抗體pfh-cm01由重鏈可變區(qū)(vhh)組成，所述重鏈可變區(qū)可包含氨基酸序列分別是seq?id?no.1的第27-35位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr1、seq?idno.1的第49-59位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr2和seq?id?no.1的第97-109位的互補(bǔ)決定區(qū)cdr3。所述單域抗體pfh-cm01為特異性結(jié)合c-met蛋白的單域抗體。

3、進(jìn)一步地，所述單域抗體pfh-cm01為如下b1)-b4)中的任一種：

4、b1)氨基酸序列是seq?id?no.1所示的蛋白質(zhì)；

5、b2)在seq?id?no.1所示的氨基酸序列的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)；

6、b3)將seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

7、b4)與seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

8、所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的抗體一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白質(zhì)，以便于目的抗體的表達(dá)、檢測、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽蛋白、his6標(biāo)簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、gfp(綠色熒光蛋白)、cfp(青色熒光蛋白)、yfp(黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標(biāo)簽蛋白。

9、所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。在某些實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明所述單域抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)和/或框架區(qū)內(nèi)發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，只要此類變化不實(shí)質(zhì)性降低抗體結(jié)合抗原的能力。例如，可以對互補(bǔ)決定區(qū)和/或框架區(qū)做出保守變化(例如，保守替代，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，氨基酸的保守性取代不改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能)，其不實(shí)質(zhì)性降低結(jié)合親和力。

10、所述同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索一對氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。所述同一性包括與本發(fā)明的seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有80％或更高，或具有85％或更高，或具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

11、在本發(fā)明中，所述單域抗體pfh-cm01依次由框架區(qū)fr1、互補(bǔ)決定區(qū)cdr1、框架區(qū)fr2、互補(bǔ)決定區(qū)cdr2、框架區(qū)fr3、互補(bǔ)決定區(qū)cdr3和框架區(qū)fr4組成。其中，seq?id?no.1第1-26位為框架區(qū)fr1，第27-35位為互補(bǔ)決定區(qū)cdr1，第36-48位為框架區(qū)fr2，第49-59位為互補(bǔ)決定區(qū)cdr2，第60-96位為框架區(qū)fr3，第97-109位為互補(bǔ)決定區(qū)cdr3，第110-120位為框架區(qū)fr4。編碼單域抗體pfh-cm01的核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。所述互補(bǔ)決定區(qū)的序列根據(jù)kabat編號系統(tǒng)定義。

12、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明又提供了與上述單域抗體pfh-cm01相關(guān)的生物材料。

13、本發(fā)明提供的與上述單域抗體pfh-cm01相關(guān)的生物材料可為下述c1)至c4)中的任一種：

14、c1)編碼上述單域抗體pfh-cm01的核酸分子；

15、c2)含有c1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

16、c3)含有c1)所述核酸分子的重組載體、或含有c2)所述表達(dá)盒的重組載體；

17、c4)含有c1)所述核酸分子的重組宿主細(xì)胞、或含有c2)所述表達(dá)盒的重組宿主細(xì)胞、或含有c3)所述重組載體的重組宿主細(xì)胞。

18、其中，c4)所述的重組宿主細(xì)胞可表達(dá)上述單域抗體pfh-cm01。

19、上述生物材料中，所述核酸分子可為下述任一種：

20、d1)核苷酸序列或編碼序列是seq?id?no.2的dna分子；

21、d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子。

22、seq?id?no.2所示的dna分子編碼氨基酸序列為seq?id?no.1的單域抗體。

23、上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可為至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可為至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

24、上述生物材料中，所述載體是指能夠把編碼上述單域抗體pfh-cm01的核酸分子運(yùn)載進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的載體，所述載體可以是克隆載體也可以是表達(dá)載體，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體(如λ噬菌體或m13絲狀噬菌體等)、黏粒(即柯斯質(zhì)粒)、人工染色體(如酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)、p1人工染色體(pac)或ti質(zhì)粒人工染色體(tac)等)、病毒載體(如桿狀病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒或皰疹病毒(如單純皰疹病毒)等)。

25、在一些實(shí)施方案中，所述載體為pet-28a(+)載體。

26、所述重組載體是指將編碼上述單域抗體pfh-cm01的核酸分子與載體在體外連接構(gòu)建而成的重組dna分子，該重組載體可以任何合適的方式構(gòu)建，只要構(gòu)建的重組載體可攜帶編碼上述單域抗體pfh-cm01的核酸分子進(jìn)入受體細(xì)胞、并為其提供在受體細(xì)胞的復(fù)制、整合、擴(kuò)增和/或表達(dá)能力即可。

27、在一些實(shí)施方案中，所述重組載體為pet-28a(+)-pfh-cm01。所述pet-28a(+)-pfh-cm01為將pet-28a(+)載體的ncoi和hindiii限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間的dna片段替換為seq?id?no.2所示的pfh-cm01基因，且保持pet-28a(+)載體的其他序列不變后得到的載體。

28、上述生物材料中，所述宿主細(xì)胞(也稱為受體細(xì)胞)是指可用于導(dǎo)入載體的任何類型的細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞(例如植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、真菌或藻類)，或者可以是原核細(xì)胞(例如細(xì)菌或原生動物)。合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域已知，其中，所述植物細(xì)胞可為擬南芥arabidopsis?thaliana、煙草nicotiana?tabacum、玉米zea?mays、水稻oryzasativa、小麥triticum?aestivum等植物細(xì)胞但不限于此。所述動物細(xì)胞可為哺乳動物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho細(xì)胞)、非洲綠猴腎細(xì)胞(vero細(xì)胞)、幼倉鼠腎細(xì)胞(bhk細(xì)胞)、小鼠乳腺癌細(xì)胞(c127細(xì)胞)、人胚胎腎細(xì)胞(hek293細(xì)胞)、人hela細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞系、t細(xì)胞或nk細(xì)胞等)、禽類細(xì)胞(例如雞或鴨細(xì)胞)、兩棲類細(xì)胞(例如非洲爪蟾xenopus?laevis細(xì)胞或大鯢andrias?davidianus細(xì)胞)、魚類細(xì)胞(例如草魚、鯉魚、虹鱒魚或鯰魚細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞(例如sf21細(xì)胞或sf9細(xì)胞)等但不限于此。所述真菌可為酵母，所述酵母可來自酵母屬(如釀酒酵母saccharomyces?cerevisiae)、克魯維酵母屬(如乳酸克魯維酵母kluyveromyces?lactis)、畢赤酵母屬(如巴斯德畢赤酵母pichia?pastoris)、裂殖酵母屬(如非洲粟酒裂殖酵母schizosaccharomyces?pombe)、漢遜酵母屬(如多態(tài)漢遜酵母hansenula?polymorpha)等但不限于此。所述真菌還可來自鐮刀菌屬fusarium、絲核菌屬rhizoctonia、輪枝菌屬verticillium、青霉屬penicillium、曲霉屬aspergillus、頭孢霉cephalosporium等但不限于此。所述藻類可來自墨角藻屬fucus、曲殼藻屬achnanthes、繭形藻屬amphiprora、雙眉藻屬amphora、纖維藻屬ankistrodesmus、星胞藻屬asteromonas、黃金色藻屬boekelovia等但不限于此。所述細(xì)菌可來自埃希氏菌屬escherichia、歐文氏菌屬erwinia、土壤桿菌屬agrobacterium、黃桿菌屬flavobacterium、產(chǎn)堿菌屬alcaligenes、假單胞菌屬pseudomonas、芽胞桿菌屬bacillus等但不限于此。所述細(xì)菌可為大腸桿菌escherichia?coli、枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis或短小芽孢桿菌bacillus?pumilus。

29、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞。

30、所述重組宿主細(xì)胞是指對目的宿主細(xì)胞的基因進(jìn)行操作和修飾，從而得到功能發(fā)生變化的重組宿主細(xì)胞。如將外源目的基因或重組載體導(dǎo)入目的宿主細(xì)胞后得到的重組宿主細(xì)胞，或直接對目的宿主細(xì)胞的內(nèi)源基因進(jìn)行基因編輯后得到的重組宿主細(xì)胞。所述重組宿主細(xì)胞可理解為不僅是指特定的重組宿主細(xì)胞，而且也指這種細(xì)胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細(xì)胞完全一致，但仍包括在重組宿主細(xì)胞的范圍中。

31、在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞是將所述重組載體pet-28a(+)-pfh-cm01導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞得到的重組宿主細(xì)胞。

32、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種組合物，所述組合物可含有上述單域抗體pfh-cm01。

33、在一些實(shí)施方案中，所述組合物還可含有藥物，如抗癌藥物。當(dāng)所述組合物包含單域抗體pfh-cm01和藥物時(shí)，所述單域抗體pfh-cm01可用于介導(dǎo)藥物特異性地識別表達(dá)c-met抗原的腫瘤，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)預(yù)防或治療腫瘤。

34、進(jìn)一步地，所述組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體可為稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、吸附載體、表面活性劑或潤滑劑。

35、在一些實(shí)施方案中，所述組合物還可含有顯像劑，如放射性核素。當(dāng)所述組合物包含單域抗體pfh-cm01和顯像劑時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)c-met抗原腫瘤部位精準(zhǔn)顯像，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷、篩查以及治療效果的監(jiān)測。

36、進(jìn)一步地，所述組合物還包括雙功能螯合劑，所述放射性核素可通過所述雙功能螯合劑標(biāo)記于所述單域抗體pfh-cm01上。

37、更進(jìn)一步地，所述雙功能螯合劑為nota。所述放射性核素為68ga。

38、在一些具體實(shí)施方案中，所述組合物為放射性核素68ga標(biāo)記的單域抗體pfh-cm01。所述放射性核素通過所述雙功能螯合劑nota標(biāo)記于所述單域抗體pfh-cm01上。所述單域抗體pfh-cm01與所述nota的摩爾比可為1:(10-20)。所述放射性核素68ga標(biāo)記的單域抗體pfh-cm01的具體制備方法可包括如下步驟：將單域抗體pfh-cm01與nota在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(ph?9.2)中綴合(2小時(shí))，得到pfh-cm01-nota；然后使用高純鹽酸(0.05m)淋洗68ge-68ga鍺鎵發(fā)生器，得到gacl3溶液；將所述gacl3溶液與醋酸鈉溶液(1m)混勻，得到ph為4-4.5的溶液；將所述pfh-cm01-nota加入所述ph為4-4.5的溶液中，加熱(37℃加熱15min)后進(jìn)行洗脫，冷卻后進(jìn)行活化(pbs活化)，得到所述放射性核素68ga標(biāo)記的單域抗體pfh-cm01。

39、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒可含有上述單域抗體pfh-cm01或上述生物材料或上述組合物，所述試劑盒的功能為如下任一種：

40、f1)c-met腫瘤的體內(nèi)顯像；

41、f2)診斷或輔助診斷c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾??；

42、f3)篩查或輔助篩查c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病；

43、f4)治療或輔助治療c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾??；

44、f5)監(jiān)測或輔助監(jiān)測c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的治療效果；

45、f6)評估或輔助評估c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的預(yù)后；

46、f7)檢測或輔助檢測c-met蛋白。

47、在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可為化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、膠體金免疫試劑盒或熒光免疫試劑盒。

48、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了上述單域抗體pfh-cm01或上述生物材料或上述組合物或上述試劑盒的新用途。

49、本發(fā)明提供了上述單域抗體pfh-cm01或上述生物材料或上述組合物或上述試劑盒在下述任一種中的應(yīng)用：

50、e1)制備用于c-met腫瘤體內(nèi)顯像的產(chǎn)品；

51、e2)制備用于診斷或輔助診斷c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的產(chǎn)品；

52、e3)制備用于篩查或輔助篩查c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的產(chǎn)品；

53、e4)制備用于治療或輔助治療c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的產(chǎn)品；

54、e5)制備監(jiān)測或輔助監(jiān)測c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的治療效果的產(chǎn)品；

55、e6)制備評估或輔助評估c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的預(yù)后的產(chǎn)品；

56、e7)制備用于檢測或輔助檢測c-met蛋白的產(chǎn)品；

57、e8)c-met腫瘤的體內(nèi)顯像；

58、e9)診斷或輔助診斷c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾??；

59、e10)篩查或輔助篩查c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病；

60、e11)治療或輔助治療c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾??；

61、e12)監(jiān)測或輔助監(jiān)測c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的治療效果；

62、e13)評估或輔助評估c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病的預(yù)后；

63、e14)檢測或輔助檢測c-met蛋白。

64、上述應(yīng)用中，所述c-met腫瘤為c-met陽性腫瘤(c-met陽性表達(dá)的腫瘤)。

65、上述應(yīng)用中，所述c-met靶點(diǎn)相關(guān)疾病可為c-met陽性腫瘤(c-met陽性表達(dá)的腫瘤)。所述c-met陽性腫瘤包括但不限于腦癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等。

66、在一些實(shí)施方案中，所述c-met陽性腫瘤為胰腺癌。

67、上述應(yīng)用中，所述檢測c-met蛋白可為檢測待測樣品中是否含有c-met蛋白和/或檢測待測樣品中c-met蛋白的含量。

68、所述待測樣品可為細(xì)胞或組織樣品。

69、所述用于檢測或輔助檢測c-met蛋白的產(chǎn)品包括利用酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光檢測法、放射免疫法、發(fā)光免疫測定法、膠體金免疫層析法、凝集法或免疫比濁法等檢測抗原抗體結(jié)合的產(chǎn)品。

70、上述任一所述產(chǎn)品可為試劑、試劑盒、芯片或試紙。

71、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明最后還提供了上述單域抗體pfh-cm01的制備方法。

72、本發(fā)明提供的上述單域抗體pfh-cm01的制備方法可包括如下步驟：構(gòu)建含有編碼所述單域抗體pfh-cm01的核酸分子的重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得表達(dá)所述單域抗體pfh-cm01的重組細(xì)胞；培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，獲得所述單域抗體。

73、上述方法中，編碼所述單域抗體pfh-cm01的核酸分子的核苷酸序列如seq?idno.2所示。

74、上述方法中，所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌細(xì)胞。具體地，所述大腸桿菌細(xì)胞為大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞。

75、上述方法中，所述導(dǎo)入可為通過磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電穿孔法或病毒載體法等任何已知的轉(zhuǎn)染方法將攜帶本發(fā)明單域抗體pfh-cm01基因的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。

76、上述任一所述應(yīng)用和方法的目的可以是疾病診斷目的、疾病治療目的和/或疾病預(yù)后目的，也可以是非疾病診斷目的、非疾病治療目的和/或非疾病預(yù)后目的。

77、上述任一所述c-met蛋白或c-met抗原的氨基酸序列在ncbi中的genbank號為aai30421.1(提交日為04-01-2007)。

78、本發(fā)明首先利用c-met抗原免疫羊駝得到單域抗體基因，并構(gòu)建得到單域抗體庫，然后從單域抗體庫中篩選得到高親和力的抗c-met單域抗體pfh-cm01。測序得到抗體基因序列后，采用基因工程的方法制備得到單域抗體pfh-cm01，并進(jìn)一步對獲得的單域抗體pfh-cm01進(jìn)行了親和力檢測實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，本發(fā)明的單域抗體pfh-cm01親和力高，能夠很好地特異性靶向c-met蛋白和c-met陽性細(xì)胞，并可以成功應(yīng)用于荷瘤小鼠模型的pet顯像及生物分布分析。

79、本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明的單域抗體pfh-cm01可結(jié)合顯像劑，實(shí)現(xiàn)腫瘤部位精準(zhǔn)顯像，為腫瘤的早期診斷，免疫治療的動態(tài)監(jiān)測以及腫瘤的預(yù)后評估提供了可能。與此同時(shí)，本發(fā)明的單域抗體pfh-cm01還可以結(jié)合有抗癌效果的小分子藥物，形成單域抗體偶聯(lián)藥物(nb?drug?conjugates，ndc)，提高腫瘤滲透性，為腫瘤的靶向治療提供了新思路。本發(fā)明的單域抗體pfh-cm01在藥物應(yīng)用以及腫瘤診斷、治療與預(yù)后等領(lǐng)域具有十分廣闊的前景和重要的意義。