本發(fā)明屬于基因檢測，具體涉及一種lamp聯(lián)合crispr/cas12b一步法檢測新型布尼亞病毒的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、新型布尼亞病毒(severe?fever?with?thrombocytopenia?syndrome?virus，sftsv)于2009年在中國首次發(fā)現(xiàn)，感染者臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、血小板減少、白細胞減少及多器官功能損害，稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe?fever?with?thrombocytopeniasyndrome，sfts)。sftsv主要通過蜱蟲叮咬傳播，多發(fā)于醫(yī)療條件較為匱乏的山地丘陵地區(qū)；早期臨床表現(xiàn)類似流感癥狀，導(dǎo)致很多感染者漏診誤診，延誤治療，從而增加了重癥發(fā)生率，病死率高達12％～50％，世界衛(wèi)生組織于2017年將sfts歸為十大烈性傳染病之一。

2、sftsv感染的實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)：①血清病毒分離陽性；或②血清抗體滴度升高4倍；或③sftsv病毒rna檢測陽性，涉及的檢測技術(shù)包括病毒分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測和熒光定量pcr(qpcr)，這些方法均存在一定的不足：如病毒分離培養(yǎng)周期長、操作技術(shù)要求高，免疫學(xué)檢測準(zhǔn)確性和靈敏度不夠高、窗口期較長，qpcr方法對設(shè)備、實驗場所和技術(shù)人員要求較高，難以在sftsv流行地區(qū)的基層醫(yī)院廣泛開展。核酸診斷技術(shù)具有快速、靈敏的優(yōu)勢，能夠檢測處于潛伏期的病原體。目前大多數(shù)實驗室采用qpcr的方法對sftsv的核酸進行檢測，其靈敏度特異性均較好，但是耗時較長、對操作人員的技術(shù)要求較高并且儀器設(shè)備昂貴，難以在基層醫(yī)院普及，并且無法實現(xiàn)即時檢測(point-of-care?testing，poct)。因此，迫切需要開發(fā)針對sftsv感染早期的快速、靈敏、便捷的檢測新方法。

3、近年來出現(xiàn)了多種等溫擴增技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermal?amplification，lamp)作為具有代表性的一種等溫擴增技術(shù)，可以同時擴增核酸鏈的數(shù)量和長度，因此可在短時間內(nèi)實現(xiàn)核酸的大量擴增，使得檢測時間縮短，且靈敏度較高。因為在一個溫度下即可對核酸進行擴增，使得該方法可以不借助復(fù)雜貴重的儀器，簡單的水浴鍋即可實現(xiàn)核酸擴增的目的，操作簡單，適用于poct。但由于等溫擴增方法缺乏溫度變化的矯正作用，因此容易產(chǎn)生非特異擴增，導(dǎo)致該方法存在較高的假陽性，而crispr/cas檢測技術(shù)的加入可以有效地解決這個問題。

4、2019年，李偉、周琪研究團隊在genome?biology上發(fā)表了一篇文章(cdetection:crispr-cas12b-based?dna?detection?with?sub-attomolar?sensitivity?and?single-base?specificity)，他們開發(fā)了一種cas12b介導(dǎo)的dna檢測方法(cdetection)，將重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)(recombinase?polymerase?amplification，rpa)與cas12b相結(jié)合，擴增產(chǎn)物激活cas12b的反式切割活性，非特異性地切割體系中的單鏈dna，產(chǎn)生熒光信號，為核酸檢測提供了一個高效且高度實用的平臺。2020年，張峰團隊在nejm期刊發(fā)布了一篇文章(detection?of?sars-cov-2with?sherlock?one-pot?testing)，該文章中介紹了一種針對sars-cov-2的檢測方法：基于crispr/cas12b核酸檢測方法stopcovid(sherlocktesting?in?one?pot)，把rt-lamp和crispr/cas12b相結(jié)合來檢測sars-cov-2，特別適用于poct場景。crispr系統(tǒng)在單核苷酸多態(tài)性分析、癌癥篩查、細菌和病毒感染檢測以及耐藥性篩查等方面有廣泛的應(yīng)用潛力。由于cas12b的靶標(biāo)及底物均為dna，穩(wěn)定性較強，因此該系統(tǒng)對實驗操作環(huán)境要求低，可應(yīng)用于現(xiàn)場的快速檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種lamp聯(lián)合crispr/cas12b一步法檢測新型布尼亞病毒(sftsv)的試劑盒，使用該試劑盒可以更加便捷、快速高效且特異性地檢測sftsv。本發(fā)明可用于現(xiàn)場的快速檢測，將為不同層次的醫(yī)院提供sftsv的適宜檢測新方法，充分解決醫(yī)療條件匱乏地區(qū)由于延遲確診導(dǎo)致的高死亡率，實現(xiàn)疾病的早診早治、防止疾病傳播。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、一種lamp聯(lián)合crispr/cas12b一步法檢測新型布尼亞病毒的試劑盒，包含sgrna和lamp引物。

4、所述的sgrna的設(shè)計為：通過多序列比對，尋找多種sftsv毒株的保守區(qū)域作為待檢測靶標(biāo)分子區(qū)域，在此選定5’-ttn-3’序列后選取其下游20bp的堿基，同時在這段20bp堿基序列的5’端接上aapcas12b的scaffold序列，即構(gòu)建出sgrna序列。

5、所述的lamp引物的設(shè)計為：使用primerexplorer?v.5(https://primerexplorer.jp/e/)軟件，在待檢測靶標(biāo)分子區(qū)域的5’-ttn-3’序列的近5’區(qū)域0-200bp內(nèi)設(shè)計f3、fip和loop-f，在其近3’區(qū)域20-200bp內(nèi)設(shè)計b3、bip和loop-b。

6、所述的lamp引物中包含兼并堿基，可以對不同地區(qū)的多種sftsv毒株同時進行檢測。

7、優(yōu)選的，所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒中，所述的lamp引物序列為：

8、s1-f3：gccacttyacccgaacatca(seq?id?no.1)；

9、s1-b3：gccttyggrtccctrattcc(seq?id?no.2)；

10、s1-fip：yggagccagcaagacagaagttgacagagttcacagcagcat(seq?id?no.3)；

11、s1-bip：cttgccayaragagtargcctcaactrcrggggtatctgaa(seq?id?no.4)；s1-loop-f：actccttcagggaycctct(seq?id?no.5)；

12、s1-loop-b：catmagggtcttggtygtgg(seq?id?no.6)。

13、所述sgrna序列為：

14、s1-sgrna：gucuagaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuc?cagguggcaaagcccguugagcuucucaaaucugagaaguggcacaccaagacuau?caaugugaa(seq?id?no.7)。

15、所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒還包含cas12b蛋白，所述的cas12b蛋白包括aap?cas12b、aaccas12b等。優(yōu)選的，所述的cas12b蛋白是具有g(shù)478a/k396a雙突變的aapcas12b蛋白(cas12b-2m)，其能減少cas蛋白對核酸模板鏈的順式切割，同時不影響對分子信標(biāo)的反式切割，更適用于一步法。所述的cas12b-2m的氨基酸序列為：mavksmkvklr?ldnmpeiraglwklhtevnagvryytewlsllrqenlyrrspngdgeqecyktaeeckaellerlrarqvenghcgpagsddellqlarqlyellvpqaigakgdaqqiarkflspladkdavgglgiakagnkprwvrmreagepgweeekakaearkstdrtadvlraladfglkplmrvytdsdmssvqwkplrkgqavrtwdrdmfqqaiermmsweswnqrvgeayaklveqksrfeqknfvgqehlvqlvnqlqqdmkeashgleskeqtahyltgralrgsdkvfekwekldpdapfdlydteiknvqrrntrrfgshdlfaklaepkyqalwredasfltryavynsivrklnhakmfatftlpdatahpiwtrfdalggnlhqytflfnefgegrhairfqklltvedgvakevddvtvpismsaqlddllprdphelvalyfqdygaeqhlagefgaakiqyrrdqlnhlharrgardvylnlsvrvqsqseargerrppyaavfrlvgdnhrafvhfdklsdylaehpddgklgsegllsglrvmsvdlglrtsasisvfrvarkdelkpnsegrvpfcfpiegnenlvavhersqllklpgeteskdlraireerqrtlrqlrtqlaylrllvrcgsedvgrrerswaklieqpmdanqmtpdwreafedelqklkslygicgdrewteavyesvrrvwrhmgkqvrdwrkdvrsgerpkirgyqkdvvggnsieqieylerqykflkswsffgkvsgqviraekgsrfaitlrehidhakedrlkkladriimealgyvyalddergkgkwvakyppcqlilleelseyqfnndrppsennqlmqwshrgvfqellnqaqvhdllvgtmyaafssrfdartgapgircrrvparcareqnpepfpwwlnkfvaehkldgcplraddliptgegeffvspfsaeegdfhqihadlnaaqnlqrrlwsdfdisqirlrcdwgevdgepvliprttgkrtadsygnkvfytktgvtyyerergkkrrkvfaqeelseeeaellveadeareksvvlmrdpsgiinrgdwtrqkefwsmvnqriegylvkqirsrvrlqesacentgdi*(seq?id?no.8)。

16、所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒還包含單鏈dna報告分子。所述的單鏈dna報告分子的分別帶有fam和bhq1基團。優(yōu)選的，所述的單鏈dna報告分子序列為：fam-tt?att-bhq1。

17、所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒還包含酶和緩沖體系。所述的酶包括：bstdna聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶，所述的緩沖體系包括tris-hcl、硫酸銨、硫酸鎂、tween?20。

18、優(yōu)選的，所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒，在檢測新型布尼亞病毒的體系中，反應(yīng)體系為25～50μl，其包含：1×reaction?buffer，1×s1-lamp引物，25～100mm牛磺酸，1m?m～1.8mm?dntp，0.8u/μl～3.2u/μl?bst?dna聚合酶，5mm～10mm硫酸鎂，20mm～50mm氯化鉀，1u/μl～5u/μl逆轉(zhuǎn)錄酶，200～1000ng?cas12b蛋白，50～250ng?sgrna，0.2μm～0.5μm單鏈dna報告分子，待檢rna和余量的水。其中，1×reaction?buffer的組成優(yōu)選為：10mm～40mm?tris-hcl、5mm～20mm硫酸銨、1mm～4mm硫酸鎂、0.01％～1％?t?ween?20；1×s1-lamp引物的組成優(yōu)選為：0.1μm～0.4μm?s1-f3引物、0.1μm～0.4μm?s1-b3引物、0.8μm～3.2μms1-fip引物、0.8μm～3.2μm?s1-bip引物、0.2μm～0.8μm?s1-loo?p-f引物、0.2μm～0.8μms1-loop-b引物。

19、優(yōu)選的，所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒，在檢測新型布尼亞病毒的體系中，反應(yīng)體系為25μl，其包含：1×reaction?buffer，1×s1-lamp引物，50mm?；撬?，1.4mmdntp，1.6u/μl?bst?dna聚合酶，8mm硫酸鎂，40mm氯化鉀，4u/μl逆轉(zhuǎn)錄酶，800ng?cas12b蛋白，200ng?sgrna，0.25μm單鏈dna報告分子，待檢rna和余量的水。其中，1×reacti?onbuffer的組成為：20mm?tris-hcl、10mm硫酸銨、2mm硫酸鎂、0.1％?tween?20；1×s1-lamp引物的組成為：0.2μm?s1-f3引物、0.2μm?s1-b3引物、1.6μm?s1-fip引物、1.6μm?s1-bip引物、0.4μm?s1-loop-f引物、0.4μm?s1-loop-b引物。

20、所述的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒還包含陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。所述的陽性質(zhì)控品包括強陽性質(zhì)控品、中陽性質(zhì)控品和弱陽性質(zhì)控品。所述的強陽性質(zhì)控品的基因拷貝數(shù)為10000copies/μl，所述的中陽性質(zhì)控品的基因拷貝數(shù)為100copies/μl，所述的弱陽性質(zhì)控品的基因拷貝數(shù)為1copy/μl。所述的陽性質(zhì)控品為新型布尼亞病毒臨床培養(yǎng)分離株；所述的陰性質(zhì)控品為生理鹽水。

21、上述檢測新型布尼亞病毒的試劑盒在檢測新型布尼亞病毒中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為非疾病診斷目的。

22、上述檢測新型布尼亞病毒的試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

23、(1)提取待測樣本病毒rna。

24、(2)配制包含待測樣本病毒rna、lamp引物、sgrna、cas蛋白和單鏈dna報告分子、酶和緩沖體系的反應(yīng)混合物，置于透明ep管中。

25、(3)將反應(yīng)混合物于恒溫下進行反應(yīng)；所述的反應(yīng)條件優(yōu)選為60～63℃反應(yīng)30～40min，進一步優(yōu)選為61℃反應(yīng)30min。

26、(4)使用紫外光照射反應(yīng)產(chǎn)物，進行檢測結(jié)果判讀。該步驟中，使用紫外光照射反應(yīng)產(chǎn)物后，還可以進一步使用顏色設(shè)別設(shè)備(如手機“palette?cam”app)輔助，進行檢測結(jié)果判讀。

27、相比于市面上現(xiàn)有的核酸檢測技術(shù)的新型布尼亞病毒檢測試劑盒，本發(fā)明的檢測新型布尼亞病毒的試劑盒具有如下優(yōu)點：

28、(1)檢測速度更快：目前對sftsv的檢測多采用qpcr技術(shù)，此方法檢測時間約2個小時，本發(fā)明新型布尼亞病毒檢測試劑盒的整個檢測過程只需30分鐘，提高了檢測速度。

29、(2)操作更為便捷：qpcr技術(shù)需要使用熒光定量pcr儀，對操作人員的技術(shù)要求較高并且儀器設(shè)備昂貴，難以在基層醫(yī)院普及。本發(fā)明試劑盒可在簡單的恒溫裝置中實現(xiàn)核酸擴增，之后在紫外燈下或借助手機app進行結(jié)果判讀。操作簡單，所需要的設(shè)備也更為廉價，更易在基層醫(yī)院普及。

30、(3)特異性更高：本發(fā)明基于crispr系統(tǒng)建立，sgrna引導(dǎo)cas蛋白特異性識別目的序列并對分子信標(biāo)進行反式切割來產(chǎn)生熒光，避免了lamp中非特異性擴增的影響，提高了方法的特異性。此外，整個檢測過程在一管中進行，全程無開蓋操作，減少了氣溶膠污染造成的結(jié)果假陽性，特異性更高。

31、(4)靈敏度更高：相較于其他的crispr/cas核酸檢測系統(tǒng)，本發(fā)明使用了突變的aapcas12b蛋白cas12b-2m，可以在不影響對分子信標(biāo)反式切割的同時減少cas蛋白對模板鏈的順式切割，避免了一步法中由順式切割導(dǎo)致的模板鏈濃度下降，保證了檢測的效率和靈敏度。