本發(fā)明涉及生物，具體而言，涉及一種腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體是指體液中尺寸為30～150nm的細(xì)胞外囊泡。在腫瘤領(lǐng)域，作為細(xì)胞間通訊的天然載體，腫瘤來(lái)源外泌體(tumor-derived?extracellular?vesicles,tdevs)具備高度穩(wěn)定的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，它的形成和分泌具有極強(qiáng)時(shí)效性，其數(shù)量能有效反映原位腫瘤的進(jìn)展和活性水平，有利于實(shí)現(xiàn)腫瘤狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)控。因此，tdevs被認(rèn)為是理想的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于腫瘤診斷和早期篩查具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

2、tdevs攜帶多種親代細(xì)胞特征分子，其表面具有復(fù)雜多樣的膜蛋白，針對(duì)特異性tdevs膜蛋白的檢測(cè)在腫瘤診斷中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。具體來(lái)說(shuō)，tdevs膜蛋白在外泌體中能夠穩(wěn)定存在，具有半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)，同時(shí)還可通過(guò)提供豐富、穩(wěn)定、敏感和獨(dú)特的信息，進(jìn)一步明確腫瘤的特異性，從而更準(zhǔn)確、靈敏地反映腫瘤的實(shí)時(shí)狀態(tài)。因此，實(shí)現(xiàn)tdevs多種膜蛋白的精準(zhǔn)檢測(cè)，并用作腫瘤類型、進(jìn)展程度等特征的評(píng)估依據(jù)，有利于提升腫瘤診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。

3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked?immunosorbent?assays,elisa)、免疫印記(western?blot,wb)、質(zhì)譜分析(mass?spectrometry,ms)和免疫熒光(immunofluorescence,if)是現(xiàn)有常用的特異性蛋白檢測(cè)方法。elisa利用特異性抗體識(shí)別目標(biāo)蛋白，并通過(guò)檢測(cè)與酶底物反應(yīng)的產(chǎn)物信號(hào)來(lái)定量蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。wb依靠蛋白質(zhì)提取、分離、轉(zhuǎn)移等操作，通過(guò)檢測(cè)抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合來(lái)確定蛋白質(zhì)的存在。ms通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)量和電荷比來(lái)識(shí)別和定量蛋白質(zhì)，具有高靈敏度和高通量的特點(diǎn)。if使用熒光標(biāo)記的二抗來(lái)檢測(cè)，可以顯示蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位及其相對(duì)表達(dá)水平。

4、盡管上述技術(shù)方法可以特異性檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)，但它們均無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)tdevs多種膜蛋白的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象也大多局限于某些特定的蛋白種類。而且tdevs表面的多種膜蛋白往往是互相關(guān)聯(lián)的，只有實(shí)現(xiàn)多種膜蛋白的同時(shí)檢測(cè)，才能從多方位、多維度構(gòu)建基于腫瘤信息的檢測(cè)模型。同時(shí)患者體內(nèi)，尤其是早期腫瘤患者體內(nèi)tdevs極為稀少，相關(guān)膜蛋白含量更低，tedvs多種膜蛋白同時(shí)檢測(cè)對(duì)特異性和靈敏度都有極高要求。雖然使用epcam抗體和適配體雙重精準(zhǔn)識(shí)別的crispr/cas9技術(shù)，可以利用cas9的靶向切割特性增加可檢測(cè)的膜蛋白數(shù)量，但是crispr/cas系統(tǒng)剪切產(chǎn)生的dna產(chǎn)物濃度極低，要依賴擴(kuò)增等放大手段進(jìn)行信號(hào)識(shí)別，其中非特異性擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降和假陽(yáng)性升高。并且，擴(kuò)增后的dna多采用標(biāo)記熒光基團(tuán)來(lái)進(jìn)行最終的信號(hào)讀出，而多色熒光光譜重疊也限制了可同時(shí)檢測(cè)蛋白的數(shù)量。

5、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法和應(yīng)用，所述的腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)在低濃度下對(duì)多種外泌體膜蛋白進(jìn)行檢測(cè)和識(shí)別，具有較高的靈敏度和特異性。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法，包括以下步驟：

4、(a)在腫瘤來(lái)源外泌體樣本中捕獲目標(biāo)蛋白，根據(jù)目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)制備對(duì)應(yīng)的目標(biāo)dna序列；

5、(b)根據(jù)所述目標(biāo)dna序列設(shè)計(jì)dna探針，將所述dna探針固定在二維材料傳感器的傳感區(qū)表面；

6、(c)將含有所述目標(biāo)dna序列的清液滴入所述二維材料傳感器的傳感區(qū)后進(jìn)行檢測(cè)。

7、所述的腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法，在二維材料傳感器的不同區(qū)域修飾目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的dna鏈捕獲探針，實(shí)現(xiàn)在低濃度下對(duì)tdevs多種膜蛋白的同時(shí)檢測(cè)，具有高靈敏度和強(qiáng)特異性的優(yōu)點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)核酸檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的靈敏度下降和假陽(yáng)性升高問(wèn)題，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、廉價(jià)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，這一技術(shù)能夠避免多色熒光光譜的重疊問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)多通道互相獨(dú)立的特異性傳感。

8、本發(fā)明所提及的腫瘤來(lái)源外泌體樣本通常來(lái)自臨床癌癥患者，根據(jù)不同的癌癥類型，取樣部位進(jìn)行調(diào)整，例如肺癌患者的腫瘤來(lái)源外泌體樣本通常取自肺癌患者胸腔積液。

9、本發(fā)明對(duì)于如何捕獲目標(biāo)蛋白的方法不做具體限定，本領(lǐng)域常規(guī)的捕獲方法均可用于實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案。在一些具體的實(shí)施方式中，采用磁吸附法，在腫瘤來(lái)源外泌體樣本中捕獲所述目標(biāo)蛋白。

10、在一些具體的實(shí)施方式中，利用羧基磁珠分離捕獲腫瘤來(lái)源外泌體樣本中的tdevs，利用核酸適配體標(biāo)記磁珠分離捕獲目標(biāo)蛋白。通過(guò)在羧基磁珠上修飾腫瘤來(lái)源外泌體相關(guān)的靶向結(jié)合物實(shí)現(xiàn)羧基磁珠對(duì)腫瘤來(lái)源外泌體的捕獲。每種目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)制備對(duì)應(yīng)的核酸適配體標(biāo)記磁珠，核酸適配體可與目標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。

11、本發(fā)明所提及的目標(biāo)dna序列，基于中心法則根據(jù)目標(biāo)蛋白的序列反推而獲得的dna序列。

12、進(jìn)一步地，對(duì)sgrna進(jìn)行編程，引導(dǎo)crispr/cas9蛋白切割雙鏈核酸底物產(chǎn)生所述目標(biāo)dna序列。crispr/cas蛋白剪切產(chǎn)生的dna產(chǎn)物濃度極低，要依賴擴(kuò)增等放大手段進(jìn)行信號(hào)識(shí)別，其中非特異性擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致靈敏度下降和假陽(yáng)性升高。并且，擴(kuò)增后的dna多采用標(biāo)記熒光基團(tuán)來(lái)進(jìn)行最終的信號(hào)讀出，而多色熒光光譜重疊也限制了可同時(shí)檢測(cè)蛋白的數(shù)量。將crispr/cas技術(shù)與二維材料傳感器結(jié)合后，可以克服crispr/cas技術(shù)存在的靈敏度低、假陽(yáng)性高以及不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)膜蛋白的技術(shù)問(wèn)題。

13、本發(fā)明對(duì)于如何將dna探針固定在二維材料傳感器表面的方法不做具體限定，本領(lǐng)域常規(guī)的dna探針連接方法均可用于實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案。在一些具體的實(shí)施方式中，通過(guò)表面氨基修飾的方式將所述dna探針固定在所述二維材料傳感器的傳感區(qū)表面。

14、在一些具體的實(shí)施方式中，表面氨基修飾具體包括以下步驟：

15、1.使傳感區(qū)表面的羥基變?yōu)榘被簩os2-tft浸潤(rùn)到體積分?jǐn)?shù)為5％的aptes溶液，放入搖床中在25℃下180r/min孵育1h。

16、2.使用無(wú)水乙醇浸潤(rùn)并反復(fù)沖洗mos2-tft傳感器表面以洗去高濃度的溶液殘留。在沖洗完畢后使用氮?dú)饪焖俅蹈?，防止殘留的aptes在器件表面形成白色結(jié)晶，影響器件的靈敏度以及檢測(cè)結(jié)果。

17、3.將吹干的器件放入110℃的烘箱內(nèi)烘30min進(jìn)行表面硅烷化，使剛剛生長(zhǎng)在mos2-tft傳感區(qū)表面的氨基更加牢固。

18、4.使用10mmol/l(ph為7.4)的pbs溶液將4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺鹽鈉鹽(sulfo-smcc)配置成1mg/ml的溶液。將器件浸潤(rùn)在配置好的溶液中并在搖床中180r/mim孵育2h。使器件傳感區(qū)的氨基與sulfo-smcc形成穩(wěn)定的酰胺鍵。

19、5.將器件取出后使用10mmol/l(ph為7.4)的pbs溶液將其沖洗干凈，并用氮?dú)獯蹈伞?/p>

20、6.使用10mmol/l(ph為7.4)的pbs溶解三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽顆粒，將其配置成10mmol/l的溶液溶解dna探針?lè)勰?，并放在搖床中孵育1h。

21、7.將dna探針溶液滴入器件的傳感區(qū)，放入濕盒在4℃孵育12h。dna探針5’端的巰基可以和sulfo-smcc形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而將dna探針牢固的連接在器件的傳感區(qū)。

22、8.探針?lè)跤Y(jié)束后將器件取出，使用10mmol/l(ph為7.4)的pbs溶液將未結(jié)合的探針沖洗干凈，并用氮?dú)獯蹈?。至此dna探針已經(jīng)通過(guò)穩(wěn)定的化學(xué)鍵牢固的連接在了傳感區(qū)表面，滴入dna液體樣本后即可進(jìn)行檢測(cè)。

23、在生物傳感技術(shù)中，dna探針是一種關(guān)鍵的分子識(shí)別元件，用于檢測(cè)特定的dna序列或目標(biāo)分子。dna探針能夠與特定的目標(biāo)dna序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)堿基互補(bǔ)原則，精確地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)分子。這種高特異性的識(shí)別能力使得dna探針成為生物傳感器中理想的識(shí)別元件。本發(fā)明在二維材料傳感器的傳感區(qū)表面固定連接有dna探針，dna探針可特異性識(shí)別目標(biāo)dna序列。

24、進(jìn)一步地，所述二維材料傳感器包括：二硫化鉬薄膜場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器和/或石墨烯薄膜場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器。

25、二維材料傳感器具備高靈敏特征，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)非擴(kuò)增性核酸的檢測(cè)，避免傳統(tǒng)核酸檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中非特異性擴(kuò)增問(wèn)題；二維材料傳感器易于組成陣列，通過(guò)對(duì)每個(gè)檢測(cè)單元修飾不同dna探針，可實(shí)現(xiàn)多種dna片段的同時(shí)檢測(cè)，且相互間不易干擾。

26、以mos2為代表的二維材料具有比表面積高的特點(diǎn)，能夠在單位面積內(nèi)修飾更多的識(shí)別分子，并通過(guò)特異性結(jié)合特性，將生物分子捕獲到二維材料表面，易于實(shí)現(xiàn)對(duì)濃度樣本的檢測(cè)。

27、進(jìn)一步地，所述含有所述目標(biāo)dna序列的清液中，所述目標(biāo)dna序列的濃度為≥10-20mol/l。本發(fā)明提供的腫瘤來(lái)源外泌體的膜蛋白的檢測(cè)方法，最低檢出限為10-20mol/l，能夠直接對(duì)crispr/cas技術(shù)獲得的dna產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，既提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，又簡(jiǎn)化了檢測(cè)方法。

28、進(jìn)一步地，步驟(c)，含有所述目標(biāo)dna序列的清液的滴加量為2～3μl。該膜蛋白檢測(cè)方法，僅需要較少量的液體樣本即可完成檢測(cè)。

29、進(jìn)一步地，利用半導(dǎo)體分析儀對(duì)步驟(c)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。半導(dǎo)體分析儀是集多種測(cè)量和分析功能于一體的測(cè)試儀器，可準(zhǔn)確執(zhí)行電流-電壓測(cè)量、電容測(cè)量等，并快速、輕松地對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行分析，完成半導(dǎo)體參數(shù)測(cè)試。本發(fā)明可直接利用半導(dǎo)體分析儀對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，分析過(guò)程不再受多色熒光光譜重疊的限制，從而可分析檢測(cè)多種膜蛋白，分析過(guò)程用時(shí)短且準(zhǔn)確。

30、進(jìn)一步地，所述目標(biāo)蛋白包括：若干種腫瘤來(lái)源外泌體膜蛋白。本發(fā)明可同時(shí)針對(duì)多種腫瘤來(lái)源外泌體膜蛋白進(jìn)行檢測(cè)，提高檢測(cè)效率。

31、本發(fā)明對(duì)于腫瘤類型不做具體限定，常見(jiàn)腫瘤來(lái)源外泌體膜蛋白均可通過(guò)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。在一些具體的實(shí)施方式中，所述腫瘤包括：肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌或前列腺癌中的至少一種。

32、本發(fā)明的另一個(gè)方面，還涉及一種腫瘤進(jìn)展的評(píng)估方法，包括所述的腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法。

33、對(duì)tdevs多種膜蛋白進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可作為判斷腫瘤類型、進(jìn)展程度等特征的評(píng)估依據(jù)，有利于提升腫瘤診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

35、(1)本發(fā)明提供的腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法，在二維材料傳感器的不同區(qū)域修飾目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的dna鏈捕獲探針，實(shí)現(xiàn)在低濃度下對(duì)tdevs多種膜蛋白的同時(shí)檢測(cè)，具有高靈敏度和強(qiáng)特異性的優(yōu)點(diǎn)，避免了傳統(tǒng)核酸檢測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的靈敏度下降和假陽(yáng)性升高問(wèn)題，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、廉價(jià)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

36、(2)本發(fā)明提供的腫瘤來(lái)源外泌體多種膜蛋白檢測(cè)方法，能夠避免多色熒光光譜的重疊問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)多通道互相獨(dú)立的特異性傳感。