本發(fā)明涉及生物，特別是涉及xvii型膠原蛋白、重組菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白一般為白色、透明、無分支的原纖維，是皮膚和骨骼的基礎(chǔ)支撐物，可以占到蛋白質(zhì)總量的25％-35％，主要分布于人體的皮膚、血管、骨骼、筋腱、牙齒和軟骨等處，是這些組織的主要基質(zhì)和支架，保護(hù)并連結(jié)各種組織，在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能。因此，膠原蛋白可以廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)中。

2、人xvii型膠原蛋白是一種含有1497個(gè)氨基酸的跨膜型非成纖維膠原蛋白，是細(xì)胞中半橋粒的一種組成成分，在上皮細(xì)胞基底膜的作用中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控上皮細(xì)胞的黏附、分離和發(fā)育分化，對(duì)角化細(xì)胞的分化和再生有重要作用。有研究表明xvii型膠原蛋白的表達(dá)可有助于抑制毛囊干細(xì)胞的老化，進(jìn)而延緩脫發(fā)。不僅如此，在抗衰方面，有研究發(fā)現(xiàn)xvii型膠原蛋白可促進(jìn)清除衰老細(xì)胞，從而延緩機(jī)體的衰老。2023年正式對(duì)外發(fā)布了由創(chuàng)健醫(yī)療和弗若斯特沙利文咨詢公司聯(lián)合撰寫的《重組人xvii型膠原蛋白白皮書》。該報(bào)告闡釋了xvii型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、機(jī)理，以及重組人xvii型膠原蛋白技術(shù)優(yōu)勢(shì)、作用價(jià)值和應(yīng)用場(chǎng)景。這預(yù)示著重組人xvii型膠原蛋白將成為未來膠原蛋白市場(chǎng)的研究熱點(diǎn)。

3、由于xvii型膠原蛋白在人和動(dòng)物體內(nèi)含量極低，利用傳統(tǒng)的膠原蛋白分離提取工藝顯然無法滿足市場(chǎng)的需求，并且在以大腸桿菌為底盤菌株并沒有相關(guān)產(chǎn)量報(bào)道。因此，開發(fā)以大腸桿菌為底盤菌大批量生產(chǎn)重組xvii型膠原蛋白對(duì)推進(jìn)稀有膠原蛋白在日化、護(hù)膚等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，有必要提供一種xvii型膠原蛋白、基于xvii型膠原蛋白的重組工程菌制備方法及應(yīng)用。該xvii型膠原蛋白易于表達(dá)，且產(chǎn)量較高。

2、一種xvii型膠原蛋白，所述xvii型膠原蛋白包括：

3、氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽；或者，氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽。

4、上述xvii型膠原蛋白中，氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽，或者，氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高，易于表達(dá)，且產(chǎn)量較高。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，以大腸桿菌為底盤菌株，在載體插入mlcr25序列重組xvii膠原蛋白c17rm1最高產(chǎn)量為14.0g/l；以大腸桿菌為底盤菌株，在載體插入h1-30序列重組xvii膠原蛋白c17rm2最高產(chǎn)量為11.8g/l。

5、在其中一些實(shí)施例中，所述xvii型膠原蛋白的編碼序列如seq?id?no.2或者seqid?no.4所示。

6、一種重組菌，所述重組菌攜帶有上述所述的xvii型膠原蛋白的編碼序列。

7、在其中一些實(shí)施例中，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽，所述重組菌還攜帶有mlcr25基因；

8、進(jìn)一步地，所述mlcr25基因的編碼序列如seq?id?no.5所示。

9、在其中一些實(shí)施例中，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽，所述重組菌還攜帶有h1-30基因；

10、進(jìn)一步地，所述h1-30基因的編碼序列如seq?id?no.6所示。

11、一種重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

12、構(gòu)建重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體攜帶有xvii型膠原蛋白的編碼序列，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽；或者，氨基酸序列如seq?idno.3所示的多肽；

13、將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌。

14、在其中一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化有所述重組表達(dá)載體的所述感受態(tài)細(xì)胞記為第一重組菌，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽；所述將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中得到所述第一重組菌的步驟之后，還包括如下步驟：

15、以所述第一重組菌為模板，以堿基序列如seq?id?no.7-seq?id?no.8所示的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到mlcr25-trxa片段；

16、以所述第一重組菌為模板，以堿基序列如seq?id?no.9-seq?id?no.10所示的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到c17rm1片段；

17、以表達(dá)載體為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到載體骨架；

18、將mlcr25-trxa片段、c17rm1片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到第二重組菌。

19、在其中一些實(shí)施例中，所述將mlcr25-trxa片段、c17rm1片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中的步驟之后，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組菌進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr驗(yàn)證所用的引物對(duì)如seq?id?no.13-seq?id?no.14所示。

20、在其中一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化有所述重組表達(dá)載體的所述感受態(tài)細(xì)胞記為第一重組菌，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽；所述將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中得到所述第一重組菌的步驟之后，還包括如下步驟：

21、以所述第一重組菌為模板，以堿基序列如seq?id?no.15-seq?id?no.16所示的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到h1-30-trxa片段；

22、以所述第一重組菌為模板，以堿基序列如seq?id?no.17-seq?id?no.18所示的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到c17rm2片段；

23、以表達(dá)載體為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到載體骨架；

24、將h1-30-trxa片段、c17rm2片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到第二重組菌。

25、在其中一些實(shí)施例中，所述將h1-30-trxa片段、c17rm2片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中的步驟之后，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組菌進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr驗(yàn)證所用的引物對(duì)如seq?id?no.21-seq?id?no.22所示。

26、上述所述的重組菌，或者上述所述的重組菌的構(gòu)建方法得到的重組菌在制備xvii型膠原蛋白中的應(yīng)用。

27、一種xvii型膠原蛋白的制備方法，包括如下步驟：

28、擴(kuò)大培養(yǎng)重組菌，再加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)，得到xvii型膠原蛋白，所述重組菌選自上述所述的重組菌上述所述的重組菌的構(gòu)建方法得到的重組菌中的一種。

技術(shù)特征：

1.一種xvii型膠原蛋白，其特征在于，所述xvii型膠原蛋白包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的xvii型膠原蛋白，其特征在于，所述xvii型膠原蛋白的編碼序列如seq?id?no.2或者seq?id?no.4所示。

3.一種重組菌，其特征在于，所述重組菌攜帶有權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的xvii型膠原蛋白的編碼序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽，所述重組菌還攜帶有mlcr25基因；

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽，所述重組菌還攜帶有h1-30基因；

6.一種重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化有所述重組表達(dá)載體的所述感受態(tài)細(xì)胞記為第一重組菌，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.1所示的多肽；所述將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中得到所述第一重組菌的步驟之后，還包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述將mlcr25-trxa片段、c17rm1片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中的步驟之后，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組菌進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr驗(yàn)證所用的引物對(duì)如seq?id?no.13-seq?id?no.14所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化有所述重組表達(dá)載體的所述感受態(tài)細(xì)胞記為第一重組菌，所述xvii型膠原蛋白包括：氨基酸序列如seq?id?no.3所示的多肽；所述將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中得到所述第一重組菌的步驟之后，還包括如下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述將h1-30-trxa片段、c17rm2片段和載體骨架連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中的步驟之后，還包括對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組菌進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr驗(yàn)證所用的引物對(duì)如seq?id?no.21-seq?id?no.22所示。

11.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的重組菌，或者權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的重組菌的構(gòu)建方法得到的重組菌在制備xvii型膠原蛋白中的應(yīng)用。

12.一種xvii型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及XVII型膠原蛋白、基于XVII型膠原蛋白的重組工程菌制備方法及應(yīng)用。該XVII型膠原蛋白包括：氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的多肽；或者，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的多肽。氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的多肽，或者，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的多肽，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較高，易于表達(dá)，且產(chǎn)量較高。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，以大腸桿菌為底盤菌株，在載體插入mlcR25序列重組XVII膠原蛋白C17RM1最高產(chǎn)量為14.0g/L；以大腸桿菌為底盤菌株，在載體插入H1?30序列重組XVII膠原蛋白C17RM2最高產(chǎn)量為11.8g/L，以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。

技術(shù)研發(fā)人員：吳榮杰,甘志偉,刁文文,朱凌峰,羅小舟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8