本發(fā)明屬于生物催化合成，具體而言，涉及一種酮還原酶突變體在合成孟魯司特鈉關(guān)鍵手性中間體s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、孟魯司特鈉，化學(xué)名為(+)-1-[[[(1r)-1-[3-[(1e)-2-(7-氯-2-喹啉基)-乙烯基]苯基]-3-[2-(1-羥基-1-甲基乙基)苯基]丙基]硫]甲基]環(huán)丙烷乙酸單鈉鹽，它是一種白三烯受體拮抗劑，是一種高效、低毒、安全的平喘藥和抗過敏藥。s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯是制備孟魯司特鈉的關(guān)鍵手性中間體，其結(jié)構(gòu)式如下：

2、

3、傳統(tǒng)化學(xué)合成制備此中間體主要通過二異松蒎基氯硼烷化學(xué)還原和格氏反應(yīng)，不僅需要兩步反應(yīng)，且反應(yīng)條件苛刻（零下20℃的低溫）和產(chǎn)生大量有機(jī)廢液。生物酶催化的主要特點(diǎn)是反應(yīng)溫和性和專一性，一直被用來構(gòu)建化合物手性中心的重要手段。運(yùn)用生物酶催化技術(shù)，可一步制備孟魯司特鈉手性中間體，顯著簡化中間體iv操作步驟和降低生產(chǎn)成本。

4、cn104326976b采用來自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的羰基還原酶催化制備該中間體，面臨底物濃度低、酶催化時(shí)間長（25~60?h）和工藝仍需要兩步反應(yīng)的問題。繼續(xù)尋求高催化活性的酮還原酶和更優(yōu)的反應(yīng)體系從而降低生產(chǎn)成本尚需制藥行業(yè)繼續(xù)努力。

5、cn101889081a中提供與天然存在的野生型羰基還原酶相比具有改進(jìn)性質(zhì)的人工改造的羰基還原酶。還提供了編碼人工改造的羰基還原酶的多核苷酸、能夠表達(dá)人工改造的羰基還原酶的宿主細(xì)胞和使用人工改造的羰基還原酶來合成s-(e)-?2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯的方法。催化底物濃度≥20g/l。

6、cn104293850a中提出(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羰基丙基)苯甲酸甲酯通過sigma公司的羰基還原酶催化得到s-(e)-?2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯，催化體系含66％的甲苯，并添加輔酶與雙氧水，收率可達(dá)91％-97％，催化底物濃度約33.3g/l。

7、cn118421578a?采用來源于類布氏遲緩乳桿菌改良的羰基還原酶對中間體(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羰基丙基)苯甲酸甲酯進(jìn)行催化應(yīng)用過程中，催化底物100?g/l，菌體用量100?g/l（催化劑用量為1?kg/kg），催化時(shí)長24h底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.0%以上。但是，反應(yīng)中使用了四氫呋喃和0.1?mol/l三乙醇胺溶液帶來環(huán)保壓力，且生物酶催化劑用量偏高帶來生產(chǎn)成本壓力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對目前孟魯斯特鈉化學(xué)合成工藝的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種酮還原酶突變體和三元溶劑反應(yīng)體系，與野生型酮還原酶相比，轉(zhuǎn)化率明顯提高，縮短了孟魯司特鈉工藝步驟同時(shí)提高了產(chǎn)物的手性純度，廢液產(chǎn)生少，符合“綠色化學(xué)”標(biāo)準(zhǔn)。

2、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有酮還原酶催化制備s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯的反應(yīng)時(shí)間長、轉(zhuǎn)化率低、手性純度低的缺點(diǎn)，提供一種酮還原酶突變體和三元溶劑反應(yīng)體系，可明顯提高催化活性以及產(chǎn)物手性純度。

3、技術(shù)方案

4、本發(fā)明基于 lachancea?fermentati菌株的野生型酮還原酶而進(jìn)化的酮還原酶及其編碼基因，利用酮還原酶突變體催化制備s-(e)-?2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯（中間體iv），反應(yīng)式如下：

5、

6、本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的酮還原酶，即酮還原酶突變體，該酮還原酶突變體的酶活性和立體選擇性均高于野生型酮還原酶，反應(yīng)12h轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99%以上，( r)-型產(chǎn)物光學(xué)純度可達(dá)到100%。

7、本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種酮還原酶突變體，其氨基酸序列是seq?id?no:?1所示氨基酸序列（對應(yīng)編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no:?2）的突變體，突變位點(diǎn)包括r79s/w139g/l186m/s239p。

8、本發(fā)明所述酮還原酶突變體的氨基酸序列為：seq?id?no:?1所示，對應(yīng)編碼基因的核苷酸序列分別為seq?id?no:2所示。

9、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒上含有上述任一種基因的核苷酸序列，進(jìn)一步地，質(zhì)粒為pet-28a(+)、pet-28b(+)、pet-28c(+)、pet-5b(+)、pet-15b、pet-24a(+)、pet-24c(+)、pet-24d(+)、pet-25b(+)、pet-27b(+)、pet-28c(+)、pet-29a(+)、pet-29b(+)、pet-29c(+)、pet-30b(+)、pet-30c(+)、pet-30?xa/lic、pet-30?ek/lic、pet-31b(+)、pet-32b(+)、pet-32c(+)、pet-32?ek/lic、pet-32?xa/lic、pet-33b(+)、pet-37b(+)、pet-39b(+)、pet-40b(+)、pet-41a(+)、pet-41b(+)、pet-42b(+)、pet-42c(+)、pet-43.1a(+)、pet-43.1b(+)、pet-43.1c(+)、pet-43.1?ek/lic、pet-44a(+)、pet-44b(+)、pet-44c(+)、pet-44?ek/lic、pet-45b(+)、pet-46?ek/lic、pet-47b(+)、pet-48b(+)、pet-49b(+)、pet-51b(+)、pet-52b(+)、pqe30、pqe31、pqe32、pqe40、pbv220、pbv221、pcold-gst、pcold?iv、pcold-gst或ptrchis?c等。

10、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞內(nèi)含有上述任一種重組質(zhì)粒，且所述宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，原核細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了酮還原酶突變體在制備s-(e)-?2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯中的應(yīng)用，包括：在酮還原酶突變體存在下，以(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羰基丙基)苯甲酸甲酯為底物，經(jīng)不對稱催化加氫獲得s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯。

11、具體的，上述酮還原酶突變體在制備s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯中的應(yīng)用，溫度優(yōu)先控制在35-40℃。

12、具體的，上述酮還原酶突變體在制備s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯中的應(yīng)用，不對稱催化加氫反應(yīng)溫度控制在35-45℃，優(yōu)選35-40℃。反應(yīng)溫度低于35℃或高于45℃，酶催化反應(yīng)速度會(huì)有所降低。

13、有益效果：本發(fā)明技術(shù)方案通過在野生型酮還原酶基因序列的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)突變的分子生物學(xué)方法對酮還原酶基因進(jìn)行突變，從而改變酶的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)酶結(jié)構(gòu)和功能的改變；再通過定向進(jìn)化篩選的方法，得到具有上述位點(diǎn)中的單位點(diǎn)突變體或雙位點(diǎn)突變體或三位點(diǎn)或四位點(diǎn)突變的酮還原酶突變體。通過突變、篩選、優(yōu)化，最終獲得上述四位點(diǎn)突變的酮還原酶突變體催化(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羰基丙基)苯甲酸甲酯制備s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯。相比于野生型酮還原酶母本以及單突變體或者雙突變體酮還原酶，三個(gè)氨基酸位點(diǎn)均突變的酮還原酶突變體酶活性明顯高于野生型酮還原酶（實(shí)施例5），具有很高的立體選擇性和催化活性。最優(yōu)突變體在以甲苯-異丙醇-水三元溶劑的反應(yīng)體系中，表現(xiàn)出單位產(chǎn)能（底物濃度）提高至200?g/l，酶用量降至1g酶液/g（折合0.2g濕菌體/g），反應(yīng)12?h底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.5%，所得產(chǎn)品化學(xué)純度高于99.0%且光學(xué)純度達(dá)到100%，摩爾收率不低于95%。相比于現(xiàn)有公開發(fā)表的文獻(xiàn)中所報(bào)道酶催化工藝，本發(fā)明提供了一種單位產(chǎn)能更高、底物催化效率更高的可行性綠色技術(shù)方案。

14、具體實(shí)施方式：下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

15、本發(fā)明所采用的高效液相色譜法對s-(e)-?2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯進(jìn)行定量檢測，具體條件如下：

16、【手性純度】?取本品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1ml約含1mg的溶液，作為供試品溶液。照高效液相色譜法（2015年版中國藥典四部通則0512）測定，用硅膠表面涂敷有纖維素-三[4-甲基苯甲酸酯]為填充劑（chiralcel?oj-h，4.6mm×250mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以正己烷-乙醇（70:30）為流動(dòng)相；檢測波長為238nm；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.9ml。理論板數(shù)按孟魯司特鈉中間體ⅳ峰計(jì)算不得低于3000，孟魯司特鈉中間體ⅳ峰與其對映異構(gòu)體峰（與主峰相對保留時(shí)間約為1.4）的分離度應(yīng)符合要求。精密移取供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有孟魯司特鈉中間體ⅳ對映異構(gòu)體峰，按照峰面積歸一化法計(jì)算。

17、【化學(xué)純度】?取本品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液。照高效液相色譜法（2015年版中國藥典四部通則0512）測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（welch?aq?c18，4.6×250mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；以0.15%三氟乙酸的水溶液為流動(dòng)相a，甲醇-乙腈（20:80）為流動(dòng)相b，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為238nm；柱溫為30℃；流速為每分鐘1.0ml。理論板數(shù)按孟魯司特鈉中間體ⅳ峰計(jì)算不得低于5000，孟魯司特鈉中間體ⅳ峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。精密移取供試品溶液與對照品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，按照峰面積歸一化法計(jì)算。

18、

19、實(shí)施例1：獲得 laceancea?fermentati菌株的野生型酮還原酶母本重組質(zhì)粒

20、通過ncbi?genbank核酸數(shù)據(jù)庫獲得 l.?fermentati菌株的酮還原酶母本編碼基因，經(jīng)密碼子優(yōu)化并委托服務(wù)商人工合成全長基因至pet28a(+)表達(dá)質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50?mg/l?卡那霉素的lb瓊脂平皿中，37°c培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個(gè)單菌落至lb培養(yǎng)基（含50?mg/l卡那霉素），37°c培養(yǎng)過夜后使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行pcr和測序驗(yàn)證，獲得野生型酮還原酶母本的重組質(zhì)粒。

21、實(shí)施例2：對野生型酮還原酶母本基因進(jìn)行隨機(jī)突變

22、根據(jù)實(shí)施例1所述，以含 lachancea?fermentati菌株的酮還原酶母本基因重組質(zhì)粒為模板，根據(jù) lachancea?fermentati菌株的酮還原酶母本編碼基因用primer?5.0設(shè)計(jì)并合成兩端引物（表1），使用易錯(cuò)pcr技術(shù)（物料及濃度見表2，反應(yīng)條件見表3）獲得含有大量堿基突變的線性基因片段，將上述pcr產(chǎn)物和pet28a(+)表達(dá)質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切、切膠回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50?mg/l?卡那霉素的lb瓊脂平皿中，37°c培養(yǎng)過夜。

23、

24、實(shí)施例3：酮還原酶突變體的克隆與表達(dá)

25、為了便于酮還原酶突變體的克隆、表達(dá)及鑒定，在其基因的5’和3’末端設(shè)計(jì)了兼容的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以采用 nde?i和 xho?i限制性內(nèi)切酶分別將目的基因和pet28a(+)（其它可以在大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒也可使用）同時(shí)進(jìn)行酶切和dna切膠回收，回收后的目的基因和質(zhì)粒用t4?dna連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有50?mg/l?卡那霉素的lb瓊脂平皿中，37°c培養(yǎng)過夜。

26、挑取上述培養(yǎng)皿上長出的單菌落接種于含有50?mg/l?卡那霉素的lb?液體培養(yǎng)基中，37°c振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌體進(jìn)行質(zhì)粒提取、pcr?鑒定和雙酶切鑒定后，將正確的重組質(zhì)粒命名為pet28a(+)-a-n，并將含有正確的重組質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)。將上述菌液轉(zhuǎn)接于500?ml含100?mg/l?卡那霉素的lb?液體培養(yǎng)基中，37°c振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8?時(shí)，加入iptg?至終濃度分別為0.05～0.5?mm（優(yōu)選0.2?mm），在22～28°c（優(yōu)選25℃）下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12～16?h（優(yōu)選15?h）后，取出菌液，6000?×g?離心20?min收集菌體。

27、實(shí)施例4：酮還原酶突變體的初篩

28、根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3所述內(nèi)容，挑取上述lb瓊脂培養(yǎng)基上的單克隆菌落接種于96深孔板中，每孔預(yù)先加入1?ml含有50?mg/l?硫酸卡那霉素的lb培養(yǎng)基，于37°c，220?rpm振蕩培養(yǎng)3?h后，加入一定量的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg，終濃度為0.2?mm），25°c?，220?rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)15?h，6000?×g離心20?min收集菌細(xì)胞，倒掉離心上清液后使用0.1?mol/l的磷酸鈉緩沖液（ph?7.5）重懸菌體，加入0.1g底物、0.2g異丙醇、3mg的nad，總反應(yīng)體積為1.0?ml，37℃反應(yīng)12h，加入1ml的甲醇終止反應(yīng)，震蕩離心后，取出上清液送hplc檢測轉(zhuǎn)化率。

29、實(shí)施例5：酮還原酶突變體的復(fù)篩

30、（1）酮還原酶突變體全細(xì)胞的制備

31、將實(shí)施例4中酶活高于母本的突變體菌株分別以0.1%接種量接種于500?ml含有50mg/l?卡納霉素的lb培養(yǎng)基，于37℃，220?rpm振蕩培養(yǎng)5~6?h，加入一定量的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg，終濃度為0.2?mm），25℃，220?rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)15?h，6000?×g離心收集菌體。

32、（2）酮還原酶的催化反應(yīng)

33、50?ml反應(yīng)瓶中加入底物4.0?g，異丙醇16.3?g，甲苯3.8?g，0.1?mol/l磷酸鈉緩沖液（ph?7.5）12?g、nadp輔酶?5?mg和酮還原酶突變體全細(xì)胞（濕重）4?g。并于37℃反應(yīng)12?h后，hplc分析其轉(zhuǎn)化率及粗品手性純度。

34、（3）酮還原酶加氫反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率以及手型純度測定

35、?。?）所述的反應(yīng)體系經(jīng)甲醇處理，膜過濾后hplc直接進(jìn)樣分析；將（2）所述的反應(yīng)體系通過后處理得到白色粉末狀固體，乙醇溶解后經(jīng)流動(dòng)相稀釋，膜過濾后hplc直接進(jìn)樣分析。選取催化活性優(yōu)于母本的突變體進(jìn)行測序，分析突變位點(diǎn)，r79s/w139g/l186m/s239p（seq?id?no:?1，對應(yīng)編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no:?2）的催化活性及立體選擇性均比本方案母本以及雙突變體的活性顯著提高，反應(yīng)結(jié)果如表4所示。

36、

37、上述結(jié)果說明：r79s/w139g/l186m/s239p突變體為最優(yōu)酶突變體，其對底物催化效率明顯高于野生型酮還原酶母本，且產(chǎn)物有更高的手性純度和催化活性。

38、實(shí)施例6：r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液的制備

39、將甘油菌以0.1%接種量轉(zhuǎn)接于50?ml含100mg/l硫酸卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；將上述菌液轉(zhuǎn)接于多瓶500?ml含100?mg/l?卡那霉素的lb?液體培養(yǎng)基中，37°c振蕩培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8?時(shí)，加入iptg?至終濃度分別為0.05～0.5?mm（優(yōu)選0.2mm），在22～28°c（優(yōu)選25℃）下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12～16?h（優(yōu)選15?h）后，取出菌液，6000×g離心20?min收集菌體。按照菌體濃度（200g/l）重懸于0.1?mol/l磷酸鈉緩沖液（ph?7.5），用高壓勻漿機(jī)破碎菌體。破碎后將粗酶液離心（10000×g，20min）后取上清，即為r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液。

40、實(shí)施例7：r79s/w139g/l186m/s239p突變體在孟魯司特鈉中間體中的應(yīng)用

41、向五個(gè)250?ml反應(yīng)瓶中分別加入主原料（中間體iii）10.0?g、異丙醇?25?ml和甲苯0.5?ml，攪拌至溶清。繼續(xù)加入飲用水10?ml、r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液?10g、nadp輔酶?10?mg。分別設(shè)置反應(yīng)溫度為25~30℃、30~35℃、35~40℃、40~45℃、45~50℃五個(gè)反應(yīng)梯度，控溫?cái)嚢璺磻?yīng)15h，底物轉(zhuǎn)化率分別為88.52%、92.51%、99.78%、98.87%、和94.52%，確定反應(yīng)溫度為35~45℃，尤以35~40℃最佳。

42、實(shí)施例8：r79s/w139g/l186m/s239p突變體在孟魯司特鈉中間體中的應(yīng)用

43、在200?ml反應(yīng)瓶中加入主原料（中間體iii）10.0?g、異丙醇?25?ml和甲苯0.5?ml，攪拌至溶清。繼續(xù)加入飲用水10?ml、r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液?10?g、nadp輔酶10?mg。升溫至35-40℃，控溫?cái)嚢璺磻?yīng)12-15h，底物轉(zhuǎn)化率為99.72%，粗品手性純度99.97%。

44、實(shí)施例9：r79s/w139g/l186m/s239p突變體在孟魯司特鈉中間體中的應(yīng)用

45、在500?ml反應(yīng)瓶中加入主原料（中間體iii）20.0?g、異丙醇?50?ml和甲苯1?ml，攪拌至溶清。繼續(xù)加入飲用水20?ml、r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液?20?g、nadp輔酶15?mg。升溫至35-40℃，控溫?cái)嚢璺磻?yīng)12-15h，隨反應(yīng)進(jìn)行大量固體析出，最終底物轉(zhuǎn)化率為99.67%，粗品手性純度99.98%。

46、實(shí)施例10：r79s/w139g/l186m/s239p突變體在孟魯司特鈉中間體中的應(yīng)用

47、在1000?ml反應(yīng)瓶中加入主原料（中間體iii）50.0?g、異丙醇?125?ml和甲苯25ml，攪拌至溶清。繼續(xù)加入飲用水50?ml、r79s/w139g/l186m/s239p突變體酶液?50?g、nadp輔酶?30?mg。升溫至35~40℃，控溫?cái)嚢璺磻?yīng)12-13h，隨反應(yīng)進(jìn)行大量固體析出，最終底物轉(zhuǎn)化率為99.52%。

48、粗品制備：反應(yīng)結(jié)束，降溫至25-30℃。抽濾并用異丙醇50?ml淋洗濾餅。濾餅控溫40℃~45℃真空干燥4~6h（真空度≥0.09mpa），取樣測水分≤5.0%?即可收料，得孟魯司特鈉中間體粗品，粗品手性純度（光學(xué)純度）達(dá)到100%。

49、精制：將異丙醇250?ml投入1000?ml三口瓶中，開啟攪拌，加入甲苯50?ml，將孟魯司特鈉中間體iv粗品加入到瓶中，升溫至75-80℃，攪拌10-20min。趁熱將料液抽濾。將料液升溫至70-75℃，將飲用水200?ml滴入；滴加完畢，1-1.5h降溫至15-20℃，保溫?cái)嚢?0-70min。離心，用異丙醇50?ml淋洗濾餅?？販?0℃~45℃真空干燥3~6?h（真空度≥0.09mpa），取樣測水分≤4.0%?即可收料，得產(chǎn)品47.25?g，摩爾收率94.5%，有關(guān)純度（化學(xué)純度）99.43%，。

50、結(jié)果表明，seq?id?no:1所示的酮還原酶突變體在酶催化過程中，即200?g/l底物反應(yīng)體系中，反應(yīng)12h，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.52%以上，產(chǎn)物手性純度達(dá)100%，篩選出的酮還原酶突變體在酶法制備s-(e)-2-(3-(3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基)苯基)-3-羥基丙基)苯甲酸甲酯中表現(xiàn)出了極高的立體選擇性和高效性。

51、上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。