本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于快速檢測五種犬蜱蟲病原體的lamp引物組、微流控芯片、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、隨著現(xiàn)代人生活壓力加快和生活水平的提高，越來越多的寵物成為人們生活中的伙伴。其中寵物犬備受人們喜愛且適宜家庭飼養(yǎng)，寵物犬喜歡在草地等糞便聚集區(qū)逗留，容易被蜱蟲（又稱狗豆子或壁虱）叮咬，從而引起蜱蟲病。常見的蜱傳性血液原蟲病有巴貝斯蟲病、埃利希氏體病、片狀邊蟲病和肝簇蟲病等，這些犬血液感染病的主要感染病原體有犬肝簇蟲（ hepatozoon?canis）、犬巴貝斯蟲（ babesia?canis）、犬吉氏巴貝斯蟲（ babesia? gibsoni）、犬埃里克體（ ehrlichia?canis）、扁平無漿體（ anaplasma?platys）。以上幾種蜱傳性血液原蟲病具有傳染性強和發(fā)病率高等特點，且感染血液原蟲病后，犬的抵抗力下降可能繼發(fā)感染了其他病毒病。因此，對這些犬類病原體的同時檢測有利于快速獲得診斷結(jié)果，對防止疾病的擴散蔓延至關(guān)重要。

2、目前，這對于蜱傳性血液原蟲病的檢測主要有血涂片鏡檢法、免疫法和分子生物學方法。其中，血涂片鏡檢法是從形態(tài)學角度鑒別種類，但是對具體蟲種的鑒別非常困難，且涂片的制作和染色的質(zhì)量也會影響實驗結(jié)果的檢出限和準確率。免疫法是通過抗原抗體的特異性結(jié)合來檢測目的蛋白，免疫法檢測試劑主要是通過一定方法檢測被病原感染后產(chǎn)生的抗體或直接檢測病原體的特異性抗原，此檢測方法的窗口期較長，對于疾病的早起篩查作用有限，同時其靈敏度及檢測特異性都相對較低，容易產(chǎn)生結(jié)果錯判。分子生物學方法包括pcr、實時熒光定量pcr（quantitative?real-time?pcr）等，其中pcr方法主要是通過對目標病原的特異性基因進行擴增，通過檢測片段長度，或者通過在反應中加入熒光物質(zhì)來實現(xiàn)病原體的實時檢測，但是該方法對于設備和場地的要求高，需要專業(yè)的操作人員，操作步驟繁瑣，如果未做好消毒通風的措施，容易造成核酸污染，從而影響檢測結(jié)果的準確性。

3、環(huán)介導等溫擴增（lamp）是一種新型的體外等溫擴增特異性核酸片段的技術(shù)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4-6種特異引物，在鏈置換dna聚合酶的作用下，在60-65℃進行恒溫擴增，可在15-30分鐘內(nèi)實現(xiàn)結(jié)果的判定，具有操作簡單、特異性強、產(chǎn)物易檢測、對設備要求低等特點。

4、微流控技術(shù)是將生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離、檢測等基本操作單元集成于芯片中，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產(chǎn)物進行分析，具有“樣本進、結(jié)果出”的特點。其中，微控流技術(shù)中使用較為普遍的方式是離心式微流控，其可通過轉(zhuǎn)動離心微流控芯片來使離心力在亞毫米尺度上操控液體。與傳統(tǒng)的人工或者利用核酸提取儀提取核酸方式相比，利用離心式微流控提取核酸能夠使所有反應過程均在芯片腔室和管道中完成，有效防止了擴增產(chǎn)物或樣本外泄的可能，大大降低了核酸污染的可能性，同時具有液體流動可控性好、分析速度快、消耗樣本和試劑極少等特點，也能顯著降低實驗場所的空間要求。因此，通過微流控技術(shù)在微流控芯片上自動完成擴增及檢測等核酸分析過程，已成為一種經(jīng)濟實惠且快速的分子診斷方法。

5、綜上所述，基于當前犬類蜱傳性血液原蟲病感染現(xiàn)狀，如何將環(huán)介導等溫擴增技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合、尋求一種能夠同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體且具有較高的檢測靈敏度和特異性的檢測方法已經(jīng)成為亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于快速檢測五種犬蜱蟲病原體的lamp引物組，用于檢測犬肝簇蟲、犬巴貝斯蟲、犬吉氏巴貝斯蟲、犬埃里克體和扁平無漿體。

2、為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、用于同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體的lamp引物組合物，其包括用于檢測犬肝簇蟲的引物組、用于檢測犬巴貝斯蟲的引物組、用于檢測犬吉氏巴貝斯蟲的引物組、用于檢測犬埃里克體的引物組、以及用于檢測扁平無漿體的引物組；其中，

4、用于檢測犬肝簇蟲的引物組包括：外引物hepca-f3和hepca-b3，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?1和2所示；內(nèi)引物hepca-fip和?hepca-bip，其核苷酸序列分別如seq?idno.?3和4所示；環(huán)引物hepca-lb，其核苷酸序列如seq?id?no.?5所示；

5、用于檢測犬巴貝斯蟲的引物組包括：外引物babeca-f3和babeca-b3，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?6和7所示；內(nèi)引物babeca-fip和?babeca-bip，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?8和9所示；環(huán)引物babeca-lf和babeca-bf，其核苷酸序列分別如seq?id?no.10和11所示；

6、用于檢測犬吉氏巴貝斯蟲的引物組包括：外引物babegi-f3和babegi-b3，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?12和13所示；內(nèi)引物babegi-fip和?babegi-bip，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?14和15所示；環(huán)引物babegi-lb，其核苷酸序列如seq?id?no.?16所示；

7、用于檢測犬埃里克體的引物組包括：外引物ehrca-f3和ehrca-b3，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?17和18所示；內(nèi)引物ehrca-fip和ehrca-bip，其核苷酸序列分別如seqid?no.?19和20所示；環(huán)引物ehrca-lf，其核苷酸序列如seq?id?no.?21所示；

8、用于檢測扁平無漿體的引物組包括：外引物anap-f3和anap-b3，其核苷酸序列分別如seq?id?no.?22和23所示；內(nèi)引物anap-fip和anap-bip，其核苷酸序列分別如seq?idno.?24和25所示；環(huán)引物anap-lb，其核苷酸序列如seq?id?no.?26所示。

9、作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述用于檢測犬肝簇蟲的引物組是針對犬肝簇蟲18s?rrna基因序列保守區(qū)域設計；所述用于檢測犬巴貝斯蟲的引物組是針對犬巴貝斯蟲18s?rrna基因序列保守區(qū)域設計；所述用于檢測犬吉氏巴貝斯蟲的引物組是針對犬吉氏巴貝斯蟲18s?rna基因序列保守區(qū)域設計；所述用于檢測犬埃里克體的引物組是針對犬埃里克體16s?rrna基因序列保守區(qū)域設計；所述用于檢測扁平無漿體的引物組是針對扁平無漿體 glta基因序列保守區(qū)域設計。

10、本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體的lamp凍干微球，所述lamp凍干微球含有如上所述的引物組合物中的一種引物組。

11、作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述lamp凍干微球包括4x?lamp?buffer、bst?dna聚合酶、mgso4、5xsyto9熒光染料、25xlamp?primer?mix、甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白和peg20000；所述25xlamp?primer?mix是犬肝簇蟲的引物組、犬巴貝斯蟲的引物組、犬吉氏巴貝斯蟲的引物組、犬埃里克體的引物組、扁平無漿體的引物組以及犬的內(nèi)參基因（actb基因）引物組中的任意一種按使用時引物終濃度的10倍濃度混合而成的引物mix；每種所述引物組中內(nèi)引物fip/bip的終濃度為0.8-1.6μm，環(huán)引物的終濃度為lf/lb為0.2-0.4μm、外引物f3/b3的終濃度為0.1-0.2μm。

12、本發(fā)明的目的之三在于提供一種用于同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體的微流控芯片，所述微流控芯片的不同反應腔中包含有如上所述的lamp凍干微球。

13、作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述微流控芯片上設置有包括連通的試劑槽、樣品處理槽、核酸提取區(qū)、核酸稀釋區(qū)、定量分裝區(qū)和反應檢測區(qū)，所述核酸提取區(qū)和定量分裝區(qū)分別通過微流道連接有廢液槽；所述核酸稀釋區(qū)、定量分裝區(qū)和廢液槽分別通過微流道與大氣相通，所述反應檢測區(qū)的反應腔具有用于熒光檢測的透明區(qū)域。

14、作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述試劑槽包括第一清洗液槽、第二清洗液槽、洗脫液槽和稀釋液槽，每個所述試劑槽內(nèi)均在同一離心半徑上設置有開孔，所述開孔內(nèi)填充有石蠟。

15、本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的微流控芯片。

16、本發(fā)明的目的之五在于提供一種同時快速檢測五種犬蜱蟲病原體的非疾病診斷目的的方法，所述方法包括采用如上所述的微流控芯片或如上所述的試劑盒對待測樣品進行環(huán)介導等溫擴增反應，并根據(jù)產(chǎn)生的熒光曲線確定待測樣品的犬蜱蟲病原體感染情況。

17、作為本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，所述方法具體包括以下步驟：

18、s1、將100-200μl犬血加入到裂解液與蛋白酶k的混合液中，混合均勻后加入到微流控芯片的樣品處理槽中，54-58℃加熱10-15min后在2500-3000rpm下離心60-90s，使裂解后的樣本通過核酸提取區(qū)內(nèi)的核酸提取柱，隨后廢液進入廢液區(qū)中；

19、s2、采用激光照射第一清洗液槽開孔內(nèi)的石蠟，使其熔化釋放第一清洗液，在2500-3000rpm下離心60-90s，第一清洗液經(jīng)由核酸提取柱進入廢液區(qū)中；采用激光照射第二清洗液槽開孔內(nèi)的石蠟，使其熔化釋放第二清洗液，在2500-3000rpm下離心120-180s，第二清洗液經(jīng)由核酸提取柱進入廢液區(qū)中，完成核酸純化；

20、s3、采用激光照射洗脫液槽開孔內(nèi)的石蠟，使其熔化釋放洗脫液，在2500-3000rpm離心30-60s，使洗脫液將核酸提取柱上吸附的核酸洗脫下來并在離心作用下進入核酸提取區(qū)中；采用激光照射稀釋液槽開孔內(nèi)的石蠟，使其熔化釋放稀釋液，在2500-3000rpm離心30-60s，使稀釋后的核酸樣本液進入反應檢測區(qū)中的反應腔中；

21、s4、核酸樣本液進入反應腔中，使預置的lamp凍干微球復溶，形成lamp反應體系，lamp反應體系在62-67℃溫度下進行恒溫擴增，隨著反應的進行，根據(jù)熒光信號判斷樣本中是否含有犬蜱蟲病原體。

22、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

23、本發(fā)明提供的引物組合物特異性強，lamp擴增所需時間短，進一步縮短了檢測的時間，簡化了操作，由其制成的試劑盒能夠快速準確檢測到樣品中是否含有犬肝簇蟲、犬巴貝斯蟲、犬吉氏巴貝斯蟲、犬埃里克體、扁平無漿體五種犬蜱蟲病原體。本發(fā)明通過將每種病原體的引物組與lamp熒光檢測試劑制備成lamp凍干微球，lamp凍干微球可以常溫儲存，這樣可以大大降低試劑的運輸和儲存成本。同時本發(fā)明基于lamp技術(shù)將檢測五種病原體的lamp凍干微球與微流控芯片結(jié)合使用，可以通過單次加樣實現(xiàn)犬血樣本的核酸提取到完成犬五種常見的蜱蟲傳染病原體同時快速檢測的目的，全過程均無需人工干預，整個檢測過程僅需1個小時，具有較高的檢測靈敏度和特異性，能夠很好滿足市場上對于寵物病原體快速檢測的需求，為犬類病原感染的早期診斷和監(jiān)測提供了強有力的技術(shù)支持，同時也能有效預防跨物種傳播的可能。

24、本發(fā)明的檢測方法所需設備簡單，占據(jù)空間小，高度自動化，不需要專業(yè)的操作和分析人員，在普通實驗室即可完成整個檢測流程。基于以上特點，本發(fā)明可用于沒有專業(yè)核酸檢測實驗室的普通實驗室、基礎條件較差的寵物診所等，對于減少樣本轉(zhuǎn)運成本，減少檢測時間和檢測成本等方面具有明顯優(yōu)勢，具有廣闊的應用前景。