本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)，具體涉及一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、工業(yè)大麻（industrial?hemp）是指大麻植株干物質(zhì)中四氫大麻酚（thc）含量低于0.3％的大麻品種類型。工業(yè)大麻全身都是“寶”，莖可以制成植物纖維，花葉提取cbd，籽可以提煉食用油、蛋白粉，可以制成中藥材用在化妝品中，工業(yè)大麻在多個(gè)領(lǐng)域的廣泛的應(yīng)用正逐步被人們認(rèn)識(shí)、開(kāi)發(fā)及利用。云南是我國(guó)允許工業(yè)大麻種植的兩個(gè)省份之一，在公安的監(jiān)管下可合法推廣利用，工業(yè)大麻種植遍及13個(gè)州的38個(gè)縣，種植中發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻出現(xiàn)花葉黃化，葉片褪綠、明脈小葉、葉片矮縮、植株死亡等癥狀，給工業(yè)大麻的質(zhì)量和產(chǎn)量帶來(lái)了一定的損失，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致病害發(fā)生的是一種雙分體病毒。

2、雙分體病毒（partitiviridae）是一類具有雙鏈rna（dsrna）基因組的病毒，基因組片段長(zhǎng)度約為?1.3-2.5?kb，兩條?dsrna?每條都有且只有?1?個(gè)開(kāi)放閱讀框，dsrna1?負(fù)責(zé)編碼rna依賴的rna聚合酶（rdrp），而?dsrna2?主要負(fù)責(zé)編碼衣殼蛋白（cp）。雙分體病毒已被證明感染廣泛的宿主，包括植物、真菌和原生動(dòng)物，被侵染的植物、作物產(chǎn)量、品質(zhì)會(huì)下降，雙分體病毒通過(guò)垂直傳播將病毒從母體遺傳到子代，在無(wú)性繁殖和有性繁殖中均存在。在無(wú)性繁殖中，母體的根、莖、葉、愈傷組織等均含有病毒，采用根、莖、葉、愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)后，新生一代植株會(huì)攜帶病毒。大多數(shù)的高等植物均為有性繁殖，在此過(guò)程中如母體帶有病毒，病毒則會(huì)跟隨種子進(jìn)行傳播。病毒的防治及其困難，至今尚無(wú)完全有效的方法，因此，分離、鑒定工業(yè)大麻雙分體病毒及其基因組是對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷，加強(qiáng)病毒的早期檢測(cè)，是培育無(wú)毒工業(yè)大麻種苗，預(yù)防與控制工業(yè)大麻病毒病的重要手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，以及提供該工業(yè)大麻雙分體病毒基因的應(yīng)用，具體的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

2、一方面本發(fā)明提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?id?no:1所示，dsrna2序列如seq?id?no:2所示。

3、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)雙分體病毒基因的產(chǎn)品，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?id?no:1所示，dsrna2序列如seq?id?no:2所示。

4、進(jìn)一步的，所述產(chǎn)品為特異性引物。應(yīng)當(dāng)能理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本發(fā)明提供的病毒基因序列，根據(jù)相應(yīng)的檢測(cè)方法，利用使用在線工具如primer3、snapgene、benchling等進(jìn)行符合檢測(cè)原理的引物設(shè)計(jì)。

5、本發(fā)明的基因組全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂胮cr?擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于pcr?擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna?庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次pcr?擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

6、在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的產(chǎn)品中，檢測(cè)dsrna1的特異性引物序列如seq?idno:3、4、9或11所示；檢測(cè)dsrna2的特異性引物序列如seq?id?no:5、6、7、8、10、或12所示。

7、進(jìn)一步的，所述產(chǎn)品為試劑盒。所述試劑盒含如seq?id?no:3～12所示任一條引物序列，在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒為rt反應(yīng)試劑盒，包括引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、rt反應(yīng)緩沖液和底物等試劑，在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒為pcr反應(yīng)試劑盒，包括引物、tag?dna聚合酶、pcr反應(yīng)緩沖液和底物等試劑。

8、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供所述產(chǎn)品在培育脫毒工業(yè)大麻種苗、優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)或工業(yè)大麻病害檢測(cè)中的應(yīng)用。

9、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供雙分體病毒基因在制備檢測(cè)工業(yè)大麻雙分體病毒的引物、探針或試劑盒，或用于表達(dá)載體構(gòu)建，基因編輯，或用于制備抗工業(yè)大麻雙分體病毒抗體中的應(yīng)用，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?id?no:1所示，dsrna2序列如seq?idno:2所示。在一些具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的提供的工業(yè)大麻雙分體病毒基因即病毒抗原或其抗原性片段，可用于免疫試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)抗體水平(或相反，可用抗病毒抗體來(lái)檢測(cè)抗原水平)。根據(jù)明確的免疫試驗(yàn)，可以開(kāi)發(fā)重組抗原，以代替侵入性診斷方法。可檢測(cè)工業(yè)大麻樣品中病毒蛋白或其片段的抗體。免疫試驗(yàn)的設(shè)計(jì)可作很大變化，其各種方案均是本領(lǐng)域中已知的。免疫試驗(yàn)的方案可基于例如競(jìng)爭(zhēng)性、或直接反應(yīng)或夾心型試驗(yàn)。方案例如還可采用固體支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多數(shù)試驗(yàn)涉及采用標(biāo)記的抗體或多肽；該標(biāo)記例如可以是熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、放射活性標(biāo)記或染料分子。擴(kuò)增探針信號(hào)的試驗(yàn)也是已知的；其例子是采用生物素和親和素的試驗(yàn)，酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫試驗(yàn)，如elisa?試驗(yàn)。

10、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

11、（1）提取待測(cè)樣品總rna；

12、（2）使用逆轉(zhuǎn)錄酶將提取的rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna；繼續(xù)以cdna為模板，在dna多聚酶的作用下進(jìn)行pcr?擴(kuò)增克隆、測(cè)序，得到特異片段；

13、（3）通過(guò)電泳分析pcr產(chǎn)物，觀察是否有與預(yù)期大小相符的條帶出現(xiàn)，以此判斷樣品中是否含有目標(biāo)病毒rna；或者使用qrt-pcr，即在pcr過(guò)程中加入熒光探針或染料，通過(guò)分析熒光信號(hào)的變化來(lái)確定樣品中病毒rna的存在和相對(duì)量。

14、所述病毒基因序列如seq?id?no:1和/或如seq?id?no:2所示。

15、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子為病毒基因逆轉(zhuǎn)錄獲得的cdna,?所述病毒基因序列如seq?id?no:1和/或如seq?id?no:2所示。

16、本發(fā)明達(dá)到的技術(shù)效果：

17、工業(yè)大麻病毒在工業(yè)大麻上引起工業(yè)大麻花葉黃化，葉片褪綠、葉片矮縮、花葉發(fā)育不良致使大麻死亡等癥狀，給工業(yè)大麻種植企業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，本發(fā)明通過(guò)病害植株宏觀基因組測(cè)序，并將基因組序列比較分析，鑒定并分離獲得了引起工業(yè)大麻病害的工業(yè)大麻雙分體病毒，該病毒是發(fā)明人首次從病害工業(yè)大麻分離獲得的病毒，該病毒的基因組序列信息及功能基因國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。該病毒基因組序列的獲得對(duì)了解病毒來(lái)源、進(jìn)化過(guò)程及分子流行病學(xué)有重要意義，同時(shí)也為該病害鑒別診斷以及抗病基因的研制奠定了基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

18、本發(fā)明提供了工業(yè)大麻雙分體病毒基因序列，利用本發(fā)明提供的序列，采用現(xiàn)有技術(shù)手段，制備用于檢測(cè)該病毒的引物、試劑盒或者抗體蛋白等，可以用于培育脫毒工業(yè)大麻種苗，優(yōu)質(zhì)大麻種子檢測(cè)，大麻病害檢測(cè)等多個(gè)場(chǎng)景中，對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷和及時(shí)防控。

技術(shù)特征：

1.一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?idno:1所示，dsrna2序列如seq?id?no:2所示。

2.一種檢測(cè)雙分體病毒基因的產(chǎn)品，其特征在于，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?id?no:1所示，dsrna2序列如seq?id?no:2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為特異性引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，檢測(cè)dsrna1的特異性引物序列如seq?idno:3、4、9或11所示；檢測(cè)dsrna2的特異性引物序列如seq?id?no:5、6、7、8、10、或12所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品為試劑盒。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒含如seq?id?no:3～12所示任一條引物序列。

7.權(quán)利要求2-6任一所述產(chǎn)品在培育脫毒工業(yè)大麻種苗、優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)或工業(yè)大麻病害檢測(cè)中的應(yīng)用。

8.雙分體病毒基因在制備檢測(cè)工業(yè)大麻雙分體病毒的引物、探針或試劑盒，或用于表達(dá)載體構(gòu)建，基因編輯，或用于制備抗工業(yè)大麻雙分體病毒抗體中的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒基因有兩條dsrna，dsrna1序列如seq?id?no:1所示，dsrna2序列如seq?id?no:2所示。

9.一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

10.一種分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子為病毒基因逆轉(zhuǎn)錄獲得的cdna,所述病毒基因序列如seq?id?no:1和/或如seq?id?no:2所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種工業(yè)大麻雙分體病毒基因及其應(yīng)用，所述病毒基因有兩條dsRNA，dsRNA1序列如SEQ?ID?NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ?ID?NO:2所示，本發(fā)明提供了工業(yè)大麻雙分體病毒基因序列，利用本發(fā)明提供的序列，采用現(xiàn)有技術(shù)手段，制備的用于檢測(cè)該病毒的引物、試劑盒或者抗體蛋白等可以用于培育脫毒工業(yè)大麻種苗，優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻種子檢測(cè)，工業(yè)大麻病害檢測(cè)等多個(gè)場(chǎng)景中，對(duì)該病害進(jìn)行快速診斷和及時(shí)防控。

技術(shù)研發(fā)人員：許艷萍,鄭寬瑜,陳璇,楊明,蘇曉霞,呂品,賈永,張園,字雪靖,張慶瀅,郭蓉,楊若菡
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8