本發(fā)明涉及生物，具體涉及r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突變體與應用。

背景技術：

1、普瑞巴林（pregabalin，pgb）是一種新型γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric?acid，gaba）受體激動劑，具有良好的抗焦慮和治療神經(jīng)痛的效果，廣泛應用于癲癇以及外周神經(jīng)痛等方面的治療。其中，s構型普瑞巴林治療效果是r構型的10倍，因此獲得高光學純度的s-普瑞巴林是藥物合成的關鍵。

2、目前生產(chǎn)中以3-異丁基戊二酰亞胺（以下簡稱環(huán)亞胺）作為底物，在強堿性環(huán)境下水解獲得等比例的(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸（以下簡稱r-單酰胺）和(s)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸（以下簡稱s-單酰胺）。r-單酰胺可以直接經(jīng)過霍夫曼降解反應合成s-普瑞巴林（(s)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸）。但副產(chǎn)物s-單酰胺需要使用拆分劑r-ɑ-苯乙胺對進行消旋回收利用，此過程需要使用大量的拆分劑且周期長及收率低。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸合成蛋白及其突變體與應用。

2、第一方面，本發(fā)明要求保護一種制備r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法。

3、本發(fā)明要求保護的制備r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，可包括如下步驟：以3-異丁基戊二酰亞胺為底物，以特定蛋白或能夠表達所述特定蛋白的重組細胞作為催化劑進行催化反應，得到r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；

4、其中，所述特定蛋白可為如下任一：

5、（a1）氨基酸序列為seq?id?no.1的蛋白質；

6、（a2）將seq?id?no.1所示蛋白質進行如下單點突變后所得突變蛋白：m63a、m63v、g66c、g66f、g67t、g67v、m125e、m125i、l159y、l159h、m94a、m94h、m94n、m94r、m94w；

7、（a3）將seq?id?no.1所示蛋白質進行如下雙點突變后所得突變蛋白：m63v/l159y；

8、（a4）將seq?id?no.1所示蛋白質進行如下三點突變后所得突變蛋白：m63v/l159y/m125e；

9、（a5）在（a1）-（a4）所限定的蛋白的n端和/或c端連接標簽得到的融合蛋白。

10、在所述（a1）中，seq?id?no.1所示蛋白質為來源于嗜鐵氧化環(huán)狀芽孢桿菌（ alicyclobacillus?ferrooxydans）的二氫嘧啶酶，所述（a2）至所述（a4）中所限定的蛋白為其變體。

11、在所述（a5）中，所述標簽是指利用dna體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化。所述標簽可為flag標簽、his標簽、mbp標簽、ha標簽、myc標簽、gst標簽和/或sumo標簽等。

12、進一步地，所述重組細胞可為重組大腸桿菌。在本發(fā)明的一個實施例案例中，所述重組細胞具體為將重組載體（即將編碼所述特定蛋白的核酸分子克隆到pet28a質粒中后得到的重組質粒）導入大腸桿菌bl21(de3)后得到的重組大腸桿菌。

13、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述催化劑為能夠表達所述特定蛋白的重組細胞（即全細胞催化）。具體地，能夠表達所述特定蛋白的重組細胞為向受體細胞（如大腸桿菌）中導入所述特定蛋白的編碼基因后得到的重組細胞（如重組大腸桿菌）。進一步地，所述特定蛋白的編碼基因可以以重組載體的形式導入所述受體細胞中。相應地，所述催化反應的反應體系可為：將所述重組細胞（如重組大腸桿菌）重懸于50mm?trsi-hcl(ph7.5)中使得od600nm=10，3-異丁基戊二酰亞胺10mm。所述催化反應的反應條件可為：50℃反應2h。

14、在本發(fā)明的另一個實施案例中，所述催化劑為酶（即酶催化），具體地，所述特定蛋白以固定化酶的形式作為所述催化劑。相應地，所述催化反應的反應體系可為：將所述固定化酶、3-異丁基戊二酰亞胺和水按照20g：100g：500ml的比例混合而成。所述催化反應的反應溫度可為50℃，反應過程中控制ph為8.5，反應時間為24h。其中，所述固定化酶可按照包括如下步驟的方法制備得到：將所述重組細胞（如重組大腸桿菌）的懸浮液進行超聲破碎，得到粗酶液i；高速離心對所述粗酶液i進行離心除雜，得到上清酶液ii；將所述上清酶液ii和氨基載體按照80ml：20g的比例混合，18℃孵育18h，得到所述固定化酶。

15、第二方面，本發(fā)明要求保護一種蛋白質。

16、本發(fā)明要求保護的蛋白質，可為如下任一所示：

17、（b1）將seq?id?no.1的第63位氨基酸由m替換為v后所得蛋白質；

18、（b2）將seq?id?no.1的第63位氨基酸由m替換為v、第159位氨基酸由l替換為y后所得蛋白質；

19、（b3）將seq?id?no.1的第63位氨基酸由m替換為v、第159位氨基酸由l替換為y、第125位氨基酸由m替換為e后所得蛋白質；

20、（b4）在（b1）-（b3）所限定的蛋白的n端和/或c端連接標簽得到的融合蛋白。

21、在所述（b1）至所述（b3）中，所述蛋白質為來源于嗜鐵氧化環(huán)狀芽孢桿菌（ alicyclobacillus?ferrooxydans）的二氫嘧啶酶（seq?id?no.1）的變體。

22、在所述（b4）中，所述標簽是指利用dna體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化。所述標簽可為flag標簽、his標簽、mbp標簽、ha標簽、myc標簽、gst標簽和/或sumo標簽等。

23、第三方面，本發(fā)明要求保護編碼前文第二方面中所述蛋白質的核酸分子。

24、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna等。

25、進一步地，所述核酸分子可為如下任一所示：

26、（c1）將seq?id?no.2的第187-189位核苷酸由atg（編碼氨基酸m）替換為gtt（編碼氨基酸v）后所得dna分子；

27、（c2）將seq?id?no.2的第187-189位核苷酸由atg（編碼氨基酸m）替換為gtt（編碼氨基酸v）、第475-477位核苷酸由ctg（編碼氨基酸l）替換為tac（編碼氨基酸y）后所得dna分子；

28、（c3）將seq?id?no.2的第187-189位核苷酸由atg（編碼氨基酸m）替換為gtt（編碼氨基酸v）、第475-477位核苷酸由ctg（編碼氨基酸l）替換為tac（編碼氨基酸y）、第373-375位核苷酸由atg（編碼氨基酸m）替換為gaa（編碼氨基酸e）后所得dna分子。

29、第四方面，本發(fā)明要求保護一種生物材料。

30、本發(fā)明所要求保護的生物材料可為含有前文第三方面中所述核酸分子的表達盒或重組載體或重組細胞。

31、所述表達盒指在基因工程中，由啟動子、目的基因、終止子等元件組成的一段dna序列，能在宿主細胞中啟動目的基因的表達。

32、所述重組載體可為攜帶有所述表達盒的重組質粒。

33、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述重組載體為將所述核酸分子克隆到pet28a質粒中后得到的重組質粒。

34、所述重組細胞可為攜帶有所述重組質粒的重組細胞。

35、所述細胞可為原核細胞或真核細胞。

36、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述重組細胞為重組大腸桿菌，具體為將所述重組載體（即將所述核酸分子克隆到pet28a質粒中后得到的重組質粒）導入大腸桿菌bl21(de3)后得到的重組大腸桿菌。

37、第五方面，本發(fā)明要求保護前文第二方面中所述的蛋白質或前文第三方面中所述的核酸分子或前文第四方面中所述的生物材料在如下任一中的應用：

38、（d1）生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；

39、（d2）制備用于生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的產(chǎn)品。

40、第六方面，本發(fā)明要求保護一種用于生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的產(chǎn)品。

41、本發(fā)明要求保護的用于生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的產(chǎn)品可為產(chǎn)品1或產(chǎn)品2；

42、所述產(chǎn)品1由前文第二方面中所述的蛋白質和3-異丁基戊二酰亞胺組成；

43、所述產(chǎn)品2由前文第四方面中所述的重組細胞（如重組大腸桿菌）和3-異丁基戊二酰亞胺組成。

44、其中，3-異丁基戊二酰亞胺為生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸所用底物，所述蛋白質或所述重組細胞為生產(chǎn)r-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸所用催化劑。

45、第七方面，本發(fā)明要求保護前文第一方面中所述的方法或前文第二方面中所述的蛋白質或前文第三方面中所述的核酸分子或前文第四方面中所述的生物材料或前文第六方面中所述的產(chǎn)品在生產(chǎn)(s)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸中的應用。

46、本發(fā)明選到一個可以催化3-異丁基戊二酰亞胺生成單一手性(r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的酰胺水解酶，同時通過蛋白結構分析，利用點突變技術獲得具有可以催化合成高純度r型產(chǎn)物的突變體。本發(fā)明對于通過生物孵化法制備高純度(s)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸具有重要意義。