異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測 試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著鮮食生魚的飲食時(shí)尚的興起，異尖線蟲病已成為重要的食源性人獸共患寄 生蟲病。為了解海產(chǎn)品異尖線蟲感染狀況，有必要對市面上流通的海產(chǎn)品進(jìn)行異尖線蟲的 檢測。但傳統(tǒng)的檢測方法主要通過形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)，操作繁瑣，比較耗時(shí)，檢出率低。
[0003] 相比傳統(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)，現(xiàn)有采用的生物分子檢測方法，多通過對待側(cè)樣本的 前處理、核酸提取、凝膠電泳等步驟進(jìn)行，但該方法實(shí)施過程中凝膠電泳的操作，容易出現(xiàn) 假陽性結(jié)果，同時(shí)過程也比較繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種光學(xué)系統(tǒng)檢測熒光 信號減少了假陽性、縮短了檢測時(shí)間的異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，包括PCR特異性引物和熒光探針；其 中，
[0007] 所述PCR特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的異尖線蟲核糖體 18s上游引物和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；
[0008] 所述熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且所述熒光探針5'端標(biāo)記熒光 報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記焚光淬滅基團(tuán)。
[0009] 本發(fā)明的試劑盒，使用時(shí)對從待測標(biāo)樣提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增過程中 的熒光變化，即可實(shí)現(xiàn)異尖線蟲的檢測；檢測過程是實(shí)時(shí)反映靶基因擴(kuò)增的過程，并根據(jù)內(nèi) 參或外參直接反映出靶基因的拷貝數(shù)；相比現(xiàn)有的方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、周期短、 高通量等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過光學(xué)系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，既減少了 假陽性的發(fā)生率和對人、環(huán)境的潛在危害，同時(shí)縮短了檢測時(shí)間。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：
[0011] 提取待測樣本DNA ;
[0012] 以提取的待測樣本DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR ;其中所述實(shí)時(shí)熒光PCR過程中 采用的引物為具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上游引物和具有序 列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；所述實(shí)時(shí)熒光PCR過程中采 用的焚光探針為具有序列表SEQ. ID. No. 3喊基序列的焚光探針，且所述焚光探針5'端標(biāo)記 熒光報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)；
[0013] 檢測PCR過程中的熒光信號。
[0014] 本發(fā)明的檢測方法，通過特異性設(shè)計(jì)的靈敏性引物和探針，對從待測標(biāo)樣提取的 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增過程中的熒光變化，即可實(shí)現(xiàn)異尖線蟲的檢測；檢測精度高、結(jié) 果準(zhǔn)確，且過程快速簡便。
【附圖說明】
[0015] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0016] 圖1為本發(fā)明以華支睪吸蟲、廣州管圓線蟲、弓形體、日本血吸蟲、異尖線蟲、衛(wèi)氏 并殖吸蟲為待測標(biāo)樣進(jìn)行檢測的熒光變化圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明的以華支睪吸蟲、廣州管圓線蟲、弓形體、日本血吸蟲、異尖線蟲、衛(wèi) 氏并殖吸蟲為待測標(biāo)樣擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；
[0018] 圖3為靈敏性實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證本發(fā)明方法的靈敏性過程中的熒光變化圖；
[0019] 圖4為靈敏性實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證本發(fā)明方法的靈敏性結(jié)果的線性曲線；
[0020] 圖5為靈敏性實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證本發(fā)明方法的靈敏性結(jié)果的數(shù)據(jù)表。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，包括如下步驟：
[0023] S10,獲取待測樣本，并提取待測樣本DNA ;
[0024] S20,以提取的待測樣本DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR ;
[0025] S30,檢測PCR過程中的熒光信號。
[0026] 本發(fā)明上述過程通過對待測的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并通過擴(kuò)增過程中熒光探針產(chǎn) 生的熒光信號變化，從而便可以得知待測樣本是否含有目標(biāo)病原體；其中，在步驟S20的實(shí) 時(shí)熒光PCR中采用的特異性引物和熒光探針如下：
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括PCR特異性引物和熒光 探針；其中， 所述PCR特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上 游引物和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物； 所述熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且所述熒光探針5'端標(biāo)記熒光報(bào)告 基團(tuán)、3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。
2. 如權(quán)利要求1所述的異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光報(bào) 告基團(tuán)為FAM。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒還包括有陽性對照；所述陽性對照為帶有異尖線蟲核糖體18s基因的重組質(zhì)粒。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒還包括有陰性對照；所述陰性對照為RNase free dH20。
5. -種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 提取待測樣本DNA ; 以提取的待測樣本DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR ;其中所述實(shí)時(shí)熒光PCR過程中采用 的引物為具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上游引物和具有序列表 SEQ. ID. No. 2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；所述實(shí)時(shí)熒光PCR過程中采用的 熒光探針為具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列的熒光探針，且所述熒光探針5'端標(biāo)記熒光 報(bào)告基團(tuán)、3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)； 檢測PCR過程中的熒光信號。
6. 如權(quán)利要求5所述的異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光報(bào)告 基團(tuán)為FAM。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種異尖線蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，包括PCR特異性引物和熒光探針；其中，PCR特異性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的異尖線蟲核糖體18s上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的異尖線蟲核糖體18s下游引物；熒光探針具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且所述熒光探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)、3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。本發(fā)明的試劑盒，是實(shí)時(shí)反映靶基因擴(kuò)增的過程，并根據(jù)內(nèi)參或外參直接反映出靶基因的拷貝數(shù)；具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、周期短、高通量等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)通過光學(xué)系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，既減少了假陽性的發(fā)生率和對人、環(huán)境的潛在危害，同時(shí)縮短了檢測時(shí)間。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561265
【申請?zhí)枴緾N201410676272
【發(fā)明人】黃達(dá)娜, 張仁利, 陽帆, 吳春利, 李玥, 武偉華, 耿藝介, 李曉恒, 高世同
【申請人】深圳市疾病預(yù)防控制中心
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月21日